桦木醇-咖啡酸苯乙酯共组装纳米复合物结构及性质研究

桦木醇(betulinol,Bet)是一种广泛存在于白桦树、乌木、罗勒和酸枣仁等天然植物中的羽扇豆烷型五环三萜类化合物,在白桦树中的含量高达35%[1]。Bet具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和杀菌等广泛的生理活性,常用于食品、化妆品和医药领域[2]。然而,Bet水溶性和稳定性差,生物利用度低,严重限制了实际应用[3]。为了改善Bet的水溶性和生物利用度,研究者通过化学修饰手段制备了多种衍生物。例如,通过Steglich酯化反应将Bet嵌入两亲性共聚物,显著增加了其溶解度[3]。Bet28位的羟甲基与L-赖氨酸或L-鸟氨酸连接所得的衍生物水溶性得到极大改善,对恶性黑色素瘤细胞株Me-45的抑制能力也显著提升[4]。然而,化学修饰方法存在合成工艺复杂、副产物多、安全性未知等局限。此外,有研究者将Bet以非共价作用负载于可食用基质构建的递送系统,以改善其性能[5]。例如,利用静电纺丝技术将Bet负载于甲基-β-环糊精纳米纤维中,显著改善了Bet的溶解性和生物利用度[6]。利用Pickering乳液递送Bet,提高了其生物可及性[7]。尽管上述递送系统负载改善了Bet的性能,但需适宜的基质经一定的工艺进行构建,致使制备步骤繁多,制备成本增加。

近年来,利用天然小分子自组装或共组装能力构建无载体纳米递送系统受到广泛关注。共组装是指2种或多种不同分子之间通过非共价相互作用(如氢键、疏水相互作用、π-π堆积等)形成有序结构复合物的技术[8]。共组装反应过程简单,条件温和,无需载体辅料,在生物安全方面具有独特的优势。五环三萜类化合物因多羟基或羧基的独特结构,具有优异的共组装特性[9]。张廷恩等[10]制备了齐墩果酸与羟基喜树碱共组装纳米复合物,显著改善了齐墩果酸的溶解性和生物利用度。齐墩果酸与白桦脂酸共组装后,其水溶性显著增强,并具有改善脂多糖诱导的小鼠肺部炎症损伤的功效[11]。紫杉醇与桦木酮酸共组装复合物表现出良好的水溶性,且具有协同抗肿瘤作用[12]。另外,Bet能在不同介质中自组装形成三维花状超分子结构,从而为快速吸附特定离子或电解质提供高可及性表面,其物理化学特性显著改善[13]。Bet还能与甘草次酸共组装形成球形纳米粒子[14]。可见,共组装后天然小分子的性质显著改善,而且Bet具有较好的组装能力。

咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是蜂胶中一种带有酯键的多酚类化合物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种生理活性[15]。与Bet类似,CAPE在水中溶解度较差,生物利用度较低,但其具有组装能力[16]。例如,CAPE与积雪草酸可通过分子间氢键和疏水相互作用共组装形成纳米颗粒,表现出较好的溶解度、热稳定性和贮藏稳定性,并具有协同抗氧化活性,同时实现了CAPE在模拟胃肠消化过程中的可控释放[16]。然而,Bet与CAPE共组装纳米复合物及其性质研究鲜有报道。

本文以CAPE和Bet为原料,通过共组装技术制备Bet-CAPE纳米粒子(nanoparticles,NPs),优化了二者配比;通过粒径、zeta-电位、扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、紫外-可见光谱(ultraviolet-visible spectroscopy,UV-vis)对Bet-CAPE NPs的结构进行了表征,并评价了其水溶性和稳定性;结合分子动力学模拟技术,探讨了Bet与CAPE的共组装机理。此外,还评估了Bet-CAPE NPs的还原力、DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,解析了NPs在模拟胃肠液消化过程中对Bet的释放特性。研究结果可为改善Bet和CAPE的溶解性及稳定性提供参考依据,为基于Bet或CAPE的共组装纳米复合物制备提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Bet、CAPE、DPPH、ABTS、胃蛋白酶(15 000 U/g)、胰蛋白酶(>2 500 U/mg),上海麦克林生物化学技术有限公司;所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

H1850台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV-1780双光束紫外可见分光光度计,岛津仪器有限公司;Nicolet iS50 FTIR仪,美国赛默飞世尔科学公司;BT-zeta 100 zeta-电位/纳米粒度/分子量分析仪,丹东百特仪器有限公司;SFX550超声波破碎仪,美国Branson超声波公司;STA449F5热分析仪,德国耐驰仪器制造有限公司;LC1260 HPLC,安捷伦科技有限公司;Phenom Pure G6 SEM,上海复纳科学仪器有限公司;LC-10 N-50D真空冷冻干燥机,上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Bet-CAPE NPs的制备

Bet-CAPE NPs制备采用HAN等[17]的方法,略有修改。将Bet与CAPE以质量比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合溶解在1 mL的无水乙醇中,总质量为5 mg。再将混合溶液逐滴加入到20 mL去离子水中;磁力搅拌1 h后,将混合物超声波处理1 min,超声频率20 kHz,振幅为30%。随后,将混合物在10 000 r/min离心40 min,取出沉淀,经真空冷冻干燥获得Bet-CAPE NPs。根据质量比,将NPs标记为Bet-CAPE 9∶1、Bet-CAPE 8∶2、Bet-CAPE 7∶3、Bet-CAPE 6∶4、Bet-CAPE 5∶5、Bet-CAPE 4∶6、Bet-CAPE 3∶7、Bet-CAPE 2∶8和Bet-CAPE 1∶9。

1.3.2 Bet-CAPE NPs的粒径和zeta-电位分析

将Bet-CAPE NPs溶解于去离子水中,配成质量浓度为1 mg/mL的水溶液,使用粒度仪测定溶液中粒子的粒径、多分散性指数(polymer dispersity index,PDI)及zeta-电位[18]。

1.3.3 Bet-CAPE NPs的SEM观察

将Bet-CAPE NPs水溶液分散均匀后滴到硅片上烘干,喷金后采用SEM观察形貌,电压10.0 kV[17]。

1.3.4 Bet-CAPE NPs的UV-vis分析

将0.5 mg/mL的样品于200～600 nm波长进行UV-vis扫描,以去离子水作为空白。

1.3.5 Bet-CAPE NPs的FTIR测定

将Bet-CAPE NPs粉末置于衰减全反射元件上,扫描500～4 000 cm-1的FTIR,扫描次数32次,分辨率4 cm-1[16]。

1.3.6 Bet-CAPE NPs形成过程的分子动力学模拟

使用Desmond 2020软件进行分子动力学模拟[19]。Bet和CAPE分子以8∶1的比例置于无定形盒中,添加TIP3水模型对系统进行溶剂化。使用OPLS3e力场(全原子型力场)实现整个系统的能量最小化,使用SHAKE算法约束水分子的几何形状、重原子的键长和键角,同时使用粒子网格Ewald方法维持长程静电。使用温度为300 K、压力为1.0 bar的NPT系综对模拟系统进行平衡;温度-压力参数的耦合采用Berendsen耦合算法。对系统进行200 ns的模拟,预测模型分子的模拟轨迹。模拟结果使用Discovery Studio 2019客户端进行可视化。

1.3.7 Bet-CAPE NPs的热重-差示扫描量热法(thermogravimetric-differential scanning calorimetry,TG-DSC)测定

准确称取5～10 mg样品置于坩埚中,采用TG-DSC热分析仪测定其在30～500 ℃的热分解特性,升温速率为5 ℃/min,空坩埚作为空白对照[20]。

1.3.8 Bet-CAPE NPs的溶解度测定

将10 mg(m0)Bet-CAPE NPs粉末分散于5 mL去离子水中,在25 ℃下磁力搅拌2 h,使样品充分溶解。随后将样品在4 000 r/min离心10 min,弃去上清液,将沉淀冷冻干燥至恒重,记录质量(m1)[21]。溶解度按公式(1)计算:

1.3.9 Bet-CAPE NPs的稳定性测定

1.3.9.1 贮藏稳定性

将Bet-CAPE NPs分散于去离子水中,终质量浓度为1 mg/mL;分别于4 ℃和25 ℃避光放置30 d。贮藏过程中,分别在第3、7、15、30天时测定样品的粒径、PDI和zeta-电位。

将5 mg Bet-CAPE NPs粉末分散于5 mL pH值分别为5.0、7.0、9.0的去离子水中,于25 ℃下静置2 h后测定样品的粒径、PDI和zeta-电位。

1.3.9.3 光稳定性

将5 mL 1 mg/mL的Bet-CAPE NPs水溶液置于透明玻璃管中,于25 ℃下采用254 nm紫外灯进行照射,在24、48、72 h时测定样品的粒径、PDI和zeta-电位[22]。

1.3.10 Bet-CAPE NPs的抗氧化活性测定

1.3.10.1 DPPH自由基清除活性

配制浓度为1×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液,将250 μL 1 mg/mL的Bet-CAPE NPs水溶液加入到3 mL DPPH溶液中,摇匀后在室温避光静置20 min,于517 nm处测量吸光度(A1);用等体积去离子水代替样品,测得的吸光度记为A0;用等体积的乙醇代替DPPH溶液,测得的吸光度记为A2[23]。以等量的游离Bet和CAPE乙醇溶液为对照。按公式(2)计算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率

1.3.10.2 ABTS阳离子自由基清除活性

配制7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾,混匀后在黑暗条件下放置12～16 h。测定时,用0.5 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释,使其吸光度在0.7±0.02(记为A0)。将300 μL 1 mg/mL的Bet-CAPE NPs水溶液加入到3 mL ABTS稀释液中,摇匀后在室温下反应6 min,测定734 nm处的吸光度(A1)[23]。以等量的游离Bet和CAPE乙醇溶液为对照。ABTS阳离子自由基清除率计算如公式(3)所示:

ABTS阳离子自由基清除率

1.3.10.3 还原力测定

参照XIE等[24]的方法测定,略有修改。将500 μL Bet-CAPE NPs溶液(1 mg/mL)与1 mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)和1 mL 10 mg/mL的铁氰化钾溶液混合,在50 ℃水浴中加热20 min;混合液冷却至室温后加入1 mL 100 mg/mL三氯乙酸溶液,于4 000 r/min离心10 min。取上清液1 mL,加入1 mL去离子水和300 μL 1 mg/mL FeCl3溶液,混匀后在室温下静置10 min,在700 nm下测吸光度,即为还原力;用去离子水做参比。

1.3.11 Bet-CAPE NPs的体外模拟消化性测定

1.3.11.1 Bet和CAPE标准曲线制作

分别配制0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL的Bet和CAPE的二甲基亚砜溶液,进行HPLC测定,并绘制标准曲线。色谱条件:C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相A(乙腈)、流动相B(1%甲酸水),按照V(A)∶V(B)=70∶30进行等梯度洗脱,流速1 mL/min,检测波长分别为210 nm和250 nm。获得标准曲线为y=1 900.694 95x+49.101 03(R2=0.997 33,Bet),y=8 790.586 23x-245.879 72(R2=0.998 39,CAPE)。

1.3.11.2 模拟胃肠消化

参考李镐诚等[25]的方法,略有修改。将50 mg Bet-CAPE 4∶6 NPs粉末分散于5 mL模拟胃液中(32 g/L胃蛋白酶,2 g/L NaCl,pH 1.2),置于截留分子质量为3 500 Da的透析袋中;将透析袋置于含有50 mL乙醇和50 mL无酶模拟胃液的释放介质中,在37 ℃、170 r/min搅拌下消化2 h。再将混合物的pH值调至7.5,将5 mL模拟肠液(10 g/L胰蛋白酶,6.8 g/L磷酸二氢钾,pH 7.5)注入到透析袋中,并将透析袋转移到含有50 mL乙醇和50 mL无酶模拟肠液的释放介质中,在相同条件下消化3 h。在设定时间点从透析袋中移取0.1 mL样品,与1 mL二甲基亚砜溶液混匀后经HPLC测定,并利用标准曲线计算Bet含量,获得累积释放率。

1.4 数据统计分析

所有实验均独立重复3次,所得数据采用Excel 2019软件进行处理,并以“平均值±标准差”表示。图表绘制采用Origin Pro 2021软件;利用SPSS 22软件,采用单因素方差分析和Duncan法进行数据的显著性差异分析,以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 Bet-CAPE NPs的结构表征

2.1.1 粒径和zeta-电位

游离Bet、CAPE和共组装复合物溶液外观如图1-a所示。游离Bet、CAPE几乎不溶于水,而Bet-CAPE NPs在水中分散良好,形成均匀的溶液。随着CAPE添加量的增加,Bet-CAPE NPs溶液由淡黄色转变为黄色,这是因为CAPE为黄色。齐墩果酸和β-胡萝卜素组装后呈现均匀的橙色乳状液,且水溶性和分散性显著提高,与本研究结果相似[22]。

Bet-CAPE NPs粒径如图1-b所示。当Bet与CAPE质量比为9∶1时,共组装产物的粒径为(498.16±16.45) nm,PDI为0.31±0.01。结合图1-a可知,该条件下Bet与CAPE发生共组装,形成了均匀的纳米粒子。当Bet与CAPE质量比在9∶1～4∶6时,NPs粒径变化不大(P>0.05),且PDI均小于0.3。然而,当Bet与CAPE质量比为3∶7时,NPs粒径迅速增大,且随着CAPE质量的增加而显著增大(P<0.05),其PDI也迅速升高。当Bet与CAPE质量比为1∶9时,其粒径显著增大(P<0.05),而PDI与质量比为8∶2的样品PDI接近,可能是由于过量CAPE导致粒径增大,但形成的溶液仍是较为均匀的分散体,因此其PDI变化不大。由此可见,Bet与CAPE可共组装形成纳米复合物,其结构与两者比例有关。当Bet过量时,二者形成较为紧凑的纳米结构;当CAPE过量时,二者形成较为松散的纳米粒子,且过量的CAPE呈现较大粒径。WANG等[12]研究表明,随着紫杉醇添加量的增加,紫杉醇和桦木酮酸共组装纳米粒子的粒径先减小后增大,与本研究结论一致。

如图1-c所示,Bet-CAPE NPs的zeta-电位均为负值,且其绝对值随着CAPE添加量的增加而增大,但在Bet与CAPE质量比为7∶3～4∶6变化不大(P>0.05)。另外,Bet-CAPE 7∶3～4∶6的zeta-电位约为-30 mV,意味着该体系具有较高的分散性和稳定性[12]。

图2为游离Bet和CAPE以及Bet-CAPE NPs的SEM图。如图2所示,游离Bet为纤维状缠结结构,冻干过程中形成网状;游离CAPE为片状结构,表面光滑,与文献报道一致[14,16]。当Bet与CAPE组装后,形成球形纳米颗粒,粒径迅速减小。当Bet与CAPE质量比为9∶1～7∶3时,除了纳米粒子,还有较小的棒状物质,推测为过量的Bet自组装产物或Bet与不足量CAPE共组装产物。当Bet与CAPE质量比介于6∶4～4∶6时,复合物中球形纳米粒子数量较多,粒度分布较为均匀;当Bet与CAPE质量比超过4∶6时,CAPE过量,样品与游离CAPE的形貌相近,呈现大块状,与粒径和PDI分析结果一致(图1-b)。由此可见,Bet与CAPE共组装的适宜条件为二者质量比9∶1～4∶6。

有研究表明,疏松多孔的积雪草酸与片状结构的CAPE共组装后形成了球形纳米颗粒,与本研究结果相似[16]。

图3为游离Bet和CAPE以及Bet-CAPE NPs的UV-vis图。如图3所示,游离Bet在220 nm处出现紫外吸收峰;游离CAPE在250 nm和330 nm处出现紫外吸收峰,其中250 nm处的吸收峰归属于苯环[26]。与游离Bet和CAPE相比,Bet-CAPE NPs在330 nm处的吸光度增加,且最大吸收波长蓝移至324 nm处;其在250 nm的吸光度也增加,这是因为Bet和CAPE共组装过程涉及非共价作用(氢键、π-π*共轭等),证明Bet与CAPE形成了共组装复合物[27]。

图4为游离Bet和CAPE与Bet-CAPE NPs的FTIR图。如图4所示,游离Bet在3 479 cm-1处的峰为O—H伸缩振动,在2 930 cm-1处的峰为C—H吸收峰,在1 007 cm-1处的峰为C—O伸缩振动峰[6]。游离CAPE在3 476 cm-1和3 299 cm-1处的峰为O—H 伸缩振动,在1 678 cm-1和1 600 cm-1处的峰归因于C—O伸缩振动,在800～1 600 cm-1的多个峰是酚羟基特征吸收峰[28-29]。

共组装后,Bet-CAPE NPs的FTIR中没有观察到新的吸收峰出现,表明Bet与CAPE之间只形成了非共价作用[16]。在Bet-CAPE共组装体系中,Bet在3 479 cm-1处、CAPE在3 476 cm-1和3 299 cm-1处的O—H吸收峰移至3 354 cm-1处,而CAPE在1 600 cm-1和1 678 cm-1处C

O的伸缩振动峰分别移至1 681 cm-1和1 740 cm-1处,表明Bet和CAPE通过分子间氢键结合[9]。此外,Bet在2 930 cm-1处的C—H特征吸收峰、CAPE在800～1 600 cm-1处的多个酚羟基特征吸收峰的强度和位置也发生了变化,说明Bet和CAPE的共组装过程涉及氢键和疏水相互作用。积雪草酸和CAPE的共组装是由氢键和疏水相互作用共同驱动的,与本研究的结果一致[16]。

2.2 Bet-CAPE NPs组装机理分析

图5为Bet-CAPE NPs的分子动力学模拟图。如图5所示,Bet和CAPE分子混合200 ns后,CAPE嵌入到Bet中,形成聚集体。其中,CAPE的酚羟基与Bet的羟基间形成分子间氢键,CAPE分子中的2个苯环与Bet的甲基之间形成疏水作用,从而形成复合物。分子动力学模拟结果表明,Bet和CAPE主要在分子间氢键和疏水相互作用驱动下形成共组装复合物,与紫外(图3)和红外(图4)分析结果一致。由于CAPE嵌入复合物中,所以其过量后样品粒径迅速增大(图1-b),且出现游离CAPE特征形貌(图2),验证了Bet与CAPE共组装的适宜条件为二者质量比9∶1～4∶6。

2.3 Bet-CAPE NPs的理化性质分析

2.3.1 热降解特性

由于Bet与CAPE共组装的适宜质量比为9∶1～4∶6,因此对该质量比范围内的共组装复合物进行性质分析。图6为Bet-CAPE 9∶1～4∶6 NPs的DSC和TG曲线。如图6-a所示,游离Bet和CAPE分别在260 ℃和130 ℃处出现尖锐的吸热峰,对应各自的熔点[30-31]。共组装之后,Bet-CAPE NPs在225 ℃出现吸热峰,由NPs的热降解所致。然而,Bet-CAPE NPs的热降解温度低于游离Bet,这可能是由于Bet与CAPE组装改变了Bet的结构,从而改变了其热降解温度。

如图6-b所示,游离Bet和CAPE的初始失重温度分别在280 ℃和242 ℃。在500 ℃时,Bet的质量损失接近100%,而CAPE的质量损失约为70%。共组装后,Bet-CAPE NPs从150 ℃开始降解;随着温度升高,其质量逐渐降低。也就是说,在加热过程中,Bet-CAPE NPs逐渐熔融而分解。此外,在495 ℃时,Bet-CAPE NPs的质量损失均低于游离Bet,其中Bet-CAPE 4∶6 NPs的质量损失最少,约为75%。这是由于Bet与CAPE分子间产生相互作用,增强了Bet的热稳定性。有研究指出,Bet/甲基-β-环糊精复合物的质量损失小于游离Bet,与本研究结果一致[6]。

Bet-CAPE 9∶1～4∶6 NPs的溶解性如图7所示。据文献报道,游离Bet和CAPE在水中的溶解度分别为0.08、21 μg/mL[3,31]。结合图1可知,共组装Bet-CAPE NPs的溶解性显著高于游离Bet和CAPE,与姜黄素与齐墩果酸共组后溶解性变化趋势相似[22]。具体而言,在9∶1～4∶6的质量比范围内(除5∶5 外),Bet-CAPE NPs的溶解度均大于60%,且差异不显著(P>0.05);其中Bet-CAPE 4∶6的溶解度为(69.17±5.30)%。共组装过程中,Bet和CAPE分子间通过氢键和疏水相互作用(图5)形成了稳定的纳米结构,促使亲水基团暴露在表面,使其更容易分散在水中;另一方面,共组装后Bet-CAPE 9∶1～4∶6 NPs的粒径显著减小,分散更均匀(图1-b),因此溶解度增加。当Bet与CAPE质量比为5∶5时,共组装复合物的溶解度最低,可能是因为该条件下形成的共组装复合物最多,分子间氢键等作用最强,从而削弱了其与水的相互作用,因此溶解度最低。

2.4 Bet-CAPE NPs的稳定性分析

2.4.1 贮藏稳定性

图8为Bet-CAPE NPs水溶液在4 ℃和25 ℃无光照条件下的贮藏稳定性。如图8-a所示,Bet-CAPE NPs水溶液在4 ℃贮藏3 d时,粒径显著增大(P<0.05)。然而,在后续3～30 d贮藏期间,质量比为7∶3～4∶6 NPs的粒径变化趋势减缓。所有样品中,Bet-CAPE 4∶6 NPs的粒径变化幅度最小,从初始的(463.81±5.60) nm增加到贮藏30 d时的(533.13±15.03) nm。此外,Bet-CAPE NPs的PDI在贮藏期间保持稳定(P>0.05,图中未标注),表明粒子分散均匀,未出现明显的聚集。如图8-b所示,4 ℃贮藏期间Bet-CAPE 8∶2～4∶6 NPs的zeta-电位变化程度较小,而Bet-CAPE 9∶1的负电荷较少,说明其稳定性较差。该变化趋势与粒径变化趋势基本相似。虽然Bet-CAPE 8∶2的粒径变化趋势与Bet-CAPE 9∶1相当,但其电位变化较小,是因为质量比为8∶2时形成的组装复合物较多,其表面所带的负电荷较大,稳定性相对较高。

如图8-c所示,Bet-CAPE NPs在25 ℃贮藏期间的粒径变化趋势与4 ℃时相似,在贮藏3 d时粒径显著增大(P<0.05)。其中,Bet-CAPE 9∶1～8∶2 NPs在贮藏3 d时粒径达到1 000 nm以上,表明粒子发生了聚集。与4 ℃相比,25 ℃下粒子的热运动加剧,加速了颗粒的聚集,从而使粒径和PDI增大[32]。另外,Bet-CAPE 9∶1的粒径随贮藏期的延长显著增大,且显著大于其他样品(P<0.05)。贮藏30 d后,Bet-CAPE 8∶2的粒径显著大于其他样品(P<0.05)。结合图2可知,Bet与CAPE质量比为9∶1和8∶2时,CAPE不足量,仍然存在未组装的Bet,因此易于聚集。相比之下,Bet-CAPE 7∶3～4∶6 NPs的粒径在贮藏3～30 d期间变化幅度较小,且贮藏30 d后Bet-CAPE 4∶6的粒径最小[(576.84±19.19) nm],表明其具有良好的贮藏稳定性。25 ℃贮藏30 d后,Bet-CAPE 4∶6的粒径与4 ℃下的粒径差异不大(P>0.05),也就是说贮藏温度对该复合物稳定性没有显著影响。此外,在贮藏期内,Bet-CAPE 7∶3～4∶6 NPs的PDI仍然保持在较低水平,证明共组装复合物分散性良好。就Bet-CAPE NPs在25 ℃贮藏过程中的zeta-电位而言(图8-d),在质量比8∶2～4∶6,其变化程度较小,而Bet-CAPE 9∶1的负电荷较少,与4 ℃贮藏期间样品的zeta-电位变化趋势一致。

综上所述,Bet-CAPE 7∶3～4∶6 NPs在4 ℃和25 ℃下均具有良好的贮藏稳定性;其中Bet-CAPE 4∶6的贮藏稳定性最高,且在25 ℃下的贮藏稳定性与4 ℃时差异不大,可在室温下进行贮藏,有利于节约贮藏和运输成本。

图9为Bet-CAPE NPs水溶液在不同pH条件下的稳定性。如图9-a所示,在pH 5.0和pH 7.0条件下,Bet-CAPE NPs粒径与对照组相比无显著变化(P>0.05),且PDI小于0.4,表明粒子稳定性高,分散良好。另外,在该条件下,Bet-CAPE 4∶6的粒径最小。在pH 9.0条件下,Bet-CAPE NPs的粒径显著增大(P<0.05),这可能归因于CAPE在碱性环境中不稳定[33]。另一方面,在pH 9.0下,溶液负电荷增加,导致Bet和CAPE分子间的静电斥力增加,使得复合物结构变得松散甚至部分解离,从而使粒径增大。

Bet-CAPE NPs的zeta-电位变化如图9-b所示。随着pH的增大,Bet-CAPE 9∶1～8∶2 NPs的zeta-电位绝对值显著增加(P<0.05),而Bet-CAPE 7∶3～4∶6 NPs的zeta-电位无显著变化(P>0.05),表明在该质量比范围内形成的复合物较为稳定。综上所述,Bet-CAPE NPs在pH 5.0和pH 7.0的条件下具有良好的稳定性,在pH 9.0时粒径有所增大,但未出现大量聚集。

图10为Bet-CAPE NPs水溶液在紫外光照射下的稳定性。如图10-a所示,光照24 h后,Bet-CAPE NPs的粒径显著增大(P<0.05),可能是由于CAPE的苯环和碳碳双键吸收紫外线后发生降解或异构化,进而破环了NPs的结构,导致粒径增加[34]。之后,随着光照时间延长至72 h,Bet-CAPE NPs粒径不再显著变化(P>0.05),且PDI保持稳定。光照条件下,Bet-CAPE 4∶6 NPs粒径从(463.81±5.60) nm增加到(517.13±14.13) nm,变化程度最小,表现出最高的光稳定性,说明该条件下分子间相互作用较强,形成了稳定的共组装纳米粒子,从而抵抗了紫外光的破环。如图10-b所示,Bet-CAPE 9∶1～8∶2 NPs的zeta-电位绝对值随光照时间的延长而显著增大(P<0.05),而Bet-CAPE 4∶6 NPs的zeta-电位则保持稳定。

综上所述,Bet-CAPE 4∶6 NPs具有较高的光稳定性,与贮藏稳定性(图8)、pH稳定性(图9)分析结果一致。

2.5 Bet-CAPE NPs的抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除活性

游离Bet和CAPE以及Bet-CAPE NPs清除DPPH自由基的能力如图11-a所示。游离Bet的乙醇溶液几乎不具备清除DPPH自由基的能力,而游离CAPE乙醇溶液的清除能力随浓度的增加而显著增强(P<0.05)。Bet与CAPE共组装形成NPs后,其水溶液具有一定的DPPH自由基清除能力,且在质量比9∶1～6∶4高于CAPE的乙醇溶液。共组装显著提高了Bet和CAPE的溶解度(图7),从而产生了协同抗氧化效应。LIU等[35]发现,疏水性姜黄素与酪蛋白胶束结合后水溶性提高,从而表现出更强的DPPH自由基清除能力,与本文研究结果相似。然而,Bet-CAPE 5∶5～4∶6 NPs的DPPH自由基清除能力虽强于游离Bet的乙醇溶液,却弱于游离CAPE的乙醇溶液,这是因为CAPE与Bet组装形成NPs,其部分活性基团被掩蔽,且CAPE浓度越高,形成的复合物越多,其活性基团掩蔽效应越大。另外,复合物在水中的溶解度低于CAPE在乙醇中的溶解度,因此复合物的抗氧化活性低于高浓度游离CAPE的乙醇溶液。

2.5.2 ABTS阳离子自由基清除活性

游离Bet和CAPE以及Bet-CAPE NPs清除ABTS阳离子自由基的能力如图11-b所示。与游离Bet相比,CAPE的ABTS阳离子自由基清除能力较强,这是因为CAPE上的酚羟基具有极强的自由基清除能力[36]。对于Bet-CAPE NPs而言,其ABTS阳离子自由基清除能力随CAPE含量的增加而显著增强(P<0.05),归因于CAPE较强的抗氧化性及共组装后Bet和CAPE的溶解度增加[16]。然而,在7∶3～4∶6的质量比条件下,Bet-CAPE NPs的ABTS阳离子自由基清除能力低于游离CAPE的乙醇溶液,与DPPH自由基清除能力变化趋势相似。另外,Bet-CAPE 4∶6 NPs的ABTS阳离子自由基清除能力与同浓度维生素C接近。研究表明,积雪草酸和CAPE共组装后,其抗氧化能力比游离积雪草酸强,与本研究结果一致[16]。

还原力通常用于评估抗氧化剂供电子或供氢的能力[24]。如图11-c所示,游离Bet和CAPE乙醇溶液的还原力呈浓度依赖性。共组装后,Bet-CAPE NPs的还原力显著大于游离Bet和CAPE(P<0.05),呈现协同抗氧化效应。亲电的羟基可与自由基发生反应,将自由基转化为更稳定的产物,并终止自由基连锁反应[24]。因此,随着CAPE含量的增加,Bet-CAPE NPs的还原力也随之增强。在4∶6的质量比条件下,Bet-CAPE NPs的还原力强于同浓度维生素C。

综上所述,Bet和CAPE共组装后,复合物水溶液的抗氧化活性显著改善,其中Bet-CAPE 4∶6 NPs的抗氧化活性最强。根据稳定性分析结果,Bet-CAPE 4∶6 NPs具有良好的贮藏稳定性、pH稳定性和光稳定性。因此,对Bet-CAPE 4∶6 NPs进行体外模拟消化实验,评价其在模拟胃肠液中的消化性。

2.6 Bet-CAPE 4∶6 NPs的体外模拟消化性分析

Bet-CAPE 4∶6 NPs中Bet的体外模拟消化累积释放曲线如图12所示。在模拟胃液和肠液消化过程中,Bet-CAPE 4∶6 NPs中Bet逐渐释放;模拟胃液消化2 h后,其累积释放率为(53.47±0.74)%,模拟肠液消化3 h后,其累积释放率达到(88.28±0.34)%。这是因为Bet与CAPE共组装后水溶性增强,在胃肠液中溶解性增大,因此在消化阶段逐渐释放,且消化5 h时即可达到较高的累积释放率。有研究发现,积雪草酸与CAPE共组后,在胃肠液中逐渐释放,与本研究结果一致[16]。综上所述,Bet-CAPE 4∶6 NPs中Bet在模拟胃肠消化过程中可达到较高的释放率,有助于改善其生物利用度。

3 结论

Bet与CAPE可通过分子间氢键和疏水相互作用共组装形成纳米粒子,在二者质量比为9∶1～4∶6时,共组装复合物粒径较小。共组装复合物具有良好的热稳定性,其中Bet-CAPE 4∶6 NPs的热稳定最高。与游离Bet和CAPE相比,共组装后Bet-CAPE NPs的溶解性显著提高。稳定性分析表明,Bet-CAPE 4∶6 NPs具有良好的贮藏稳定性和光稳定性;其在pH 5.0和pH 7.0条件下均具有较高的稳定性。同时,Bet-CAPE NPs显示出协同抗氧化作用,其中Bet-CAPE 4∶6 NPs的还原力超过了同浓度维生素C。在模拟胃肠消化过程中,Bet-CAPE 4∶6 NPs中的Bet逐渐释放,5 h累积释放率高于85%。综上所述,Bet-CAPE 4∶6 NPs具有良好的溶解性、抗氧化活性和稳定性,可作为功能因子用于功能食品或药品开发。研究结果可为Bet和CAPE的溶解性及稳定性改善提供参考依据,以扩大其在食品和医药行业的应用范围。

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