乳制品作为人类饮食中一种重要的组成部分,其营养价值早已被广泛认知,在提供优质蛋白、钙、维生素和必需脂肪酸方面发挥着重要作用[1]。乳源胞外囊泡(milk-derived extracellular vesicles,mEVs)是由乳腺上皮细胞分泌产生,在乳汁及其制品中存在的一种纳米级生物活性颗粒[2]。mEVs含有多种蛋白质、脂质、核酸等生物活性分子,其独特的膜结构可以使胞外囊泡通过胞吞、胞吐促进细胞间通信,传递活性物质[3-4]。因此,mEVs具有多种生物活性,在抗氧化方面也展示出显著潜力。研究表明,mEVs能够上调细胞内抗氧化酶表达,有效清除自由基发挥抗氧化作用,其本身富含的蛋白质、免疫增强因子等物质也能够强化机体的抗氧化能力[5-6]。
皮肤是人体保护屏障器官,是抵御外界环境侵害(如紫外线辐射、污染物、病原微生物)的第一道物理与生化屏障,在所有器官中,皮肤分布最广、占比最多,其损伤及老化严重影响着人体生理功能的正常运转[7-9]。氧化应激是一种由促氧化剂和抗氧化剂之间失衡导致生物体内的氧化还原信号传导和控制机制的破坏所引起的现象[5]。由于皮肤的暴露特性,皮肤时刻面临着内源性代谢和外源性压力源诱导产生的过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的冲击,这使皮肤增加了氧化应激的风险。所以,抗氧化在皮肤保护研究中具有重要意义,缓解皮肤氧化应激也已然成为抗皮肤衰老、治疗皮肤疾病领域研究的热点之一。寻求高效、安全且能靶向作用于皮肤细胞、增强其自身抗氧化防御能力的策略,是抗皮肤氧化应激研究的关键方向。目前,应用外源性抗氧化剂(如维生素C、维生素E、辅酶Q10等)是常见的策略,然而这些传统抗氧化剂往往面临稳定性差、皮肤渗透效率有限或生物利用率低等局限性[10-11]。为了寻找新型抗氧化剂,来源于干细胞或其他哺乳动物细胞的胞外囊泡已被广泛研究,显示抵抗氧化应激的潜力[12-13]。考虑原料来源便利性等因素,牛乳胞外囊泡具有原料易获取的优点,但也存在牛乳中胞外囊泡含量低、生产成本高等现实问题,故选择合适的分离原料非常关键[14]。
因此,基于以上问题,本研究从生牛乳、巴氏杀菌乳、全脂乳粉3种乳制品中提取胞外囊泡并进行理化性质研究及自由基清除能力测定,比较3种原料胞外囊泡含量及抗氧化活性差异,同时建立人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)的氧化应激模型探究牛乳胞外囊泡对皮肤细胞的抗氧化作用效果,旨在为牛乳胞外囊泡产业化生产中原料选取及在护肤领域的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生牛乳、巴氏杀菌乳、全脂乳粉购于青岛市黄岛区金榜鲜奶店,3种乳制品原料来源于同一牧场;HaCaT细胞购于无锡新润生物科技有限公司。
凝乳酶,Caglificio Clerici公司;30%(质量分数)H2O2,中国医药集团有限公司;谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒、BCA试剂盒、CCK-8试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司;抗坏血酸(维生素C)、ROS检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;DPPH、ABTS、硫酸亚铁,上海源叶生物科技有限公司;过硫酸钾、水杨酸,上海麦克林生化科技股份有限公司;总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
HIMAC CP70ME超高速冷冻离心机、H-7650透射电子显微镜,日本Hitachi公司;ZS90纳米粒度分析仪,马尔文帕纳科仪器有限公司;PMX120纳米颗粒追踪分析仪,德国Particle Metrix公司;A1R HD25激光共聚焦显微镜,日本Nikon公司;Powerwave XS酶标仪,美国Biotek公司。
1.3 实验方法
1.3.1 牛乳胞外囊泡的提取
参考TONG等[15]的方法,采用超速离心法提取胞外囊泡。分别取35 mL生牛乳、巴氏杀菌乳、全脂乳粉(30 g全脂乳粉+250 mL无菌水)于50 mL离心管并加入适量凝乳酶,11 000×g离心30 min吸取中间层乳清过0.22 μm的滤膜分离乳清。之后使用超速离心机将乳清以35 000×g离心1 h,结束后将上清液以40 000×g再次离心1 h 30 min,将沉淀的胞外囊泡重悬于PBS溶液中。最后35 000×g超速离心1 h进行洗涤,收集胞外囊泡,将超速离心管底部沉淀重悬于少量PBS中用超滤管2 572×g离心2次,取超滤管内剩余溶液再次重悬于少量的PBS中立即使用或者在-80 ℃的条件下保存。
1.3.2 牛乳胞外囊泡的蛋白浓度测定
采用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。
1.3.3 牛乳胞外囊泡的透射电镜形态分析
取10 μL样品加入90 μL PBS进行稀释,取10 μL稀释后的样品于铜网上室温沉降1 min。待干燥后取10 μL的磷钨酸滴加于铜网上室温染色5 min。吸去多余染料,室温干燥过夜后使用透射电子显微镜对样本进行观察。
1.3.4 牛乳胞外囊泡的粒径测定
将样品用PBS进行稀释至浓度为1 mg/mL,取1 mL 放入样品池,利用纳米粒度分析仪测定其粒径分布情况。每组测定3次,每次运行3 min,在11个位置进行分析。
另取稀释后样品使用纳米颗粒追踪分析仪进行检测。
1.3.5 牛乳胞外囊泡的自由基清除率测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除实验
称取0.003 9 g DPPH粉末溶于100 mL无水乙醇中避光备用(0.039 mg/mL的DPPH工作液)。将样品溶液用无菌水稀释至浓度为50、100、200、500、1 000 μg/mL,取50 μL不同浓度样品溶液与150 μL DPPH工作液分别加入96孔板,室温避光反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度值。计算如公式(1)所示:
(1)
式中:W,自由基清除率,%;A1,实验(样品或维生素C)孔的吸光度值;A2,对照孔的吸光度值;A0,空白(无水乙醇或水)孔的吸光度值。
1.3.5.2 ABTS阳离子自由基清除实验
将浓度为7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等体积混合,室温避光放置16～24 h后用无水乙醇稀释,制得在734 nm处吸光度为0.70±0.02的ABTS工作液备用。将20 μL不同浓度样品溶液(样品稀释同1.3.5.1节)和180 μL ABTS工作液分别加入96孔板,室温避光反应6 min,在734 nm波长下测定吸光度。计算同公式(1)。
1.3.5.3 羟自由基清除实验
按体积添加比例2∶2∶1∶2,分别将2 mmol/L的FeSO4溶液与6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液添加到不同浓度样品中(样品稀释同1.3.5.1节),再加入6 mmol/L H2O2溶液充分混匀,37 ℃水浴反应30 min,吸取混合液加入96孔板测定510 nm处吸光度。计算同公式(1)。
1.3.6 细胞培养
HaCaT细胞使用含双抗的MEM培养基[补充10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)非必需氨基酸]在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁生长至融合度80%～90%时进行传代、冻存或铺板。
1.3.7 牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞存活率的影响
取传代2次后状态稳定的细胞按1×104个/孔铺于96孔板,将其置于37 ℃,体积分数5% CO2培养箱中培养24 h,每组设6个复孔,细胞贴壁后实验组用含浓度为25、50、100、200、400、800、1 200 μg/mL胞外囊泡的培养基干预24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液在培养箱中继续孵育1 h。用酶标仪在450 nm波长处测定每组吸光度值。计算如公式(2)所示:
(2)
式中:S,细胞存活率,%;A1,实验孔的吸光度值;A2,对照孔的吸光度值;A0,空白孔的吸光度值。
1.3.8 牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞氧化应激的保护作用
首先通过实验确定H2O2造模浓度,建立氧化应激模型。铺板方法同1.3.7节,待细胞贴壁后,用含浓度为25、50、100、200、300、500 μmol/L H2O2的培养基干预12 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液测定450 nm波长处吸光度并计算细胞存活率,计算同公式(2)。
之后测定牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞氧化应激的保护作用。铺板同1.3.7节,细胞贴壁后,实验组用含浓度为50、100、200、400、800 μg/mL胞外囊泡的培养基培养24 h,再用含浓度为150 μmol/L H2O2的培养基换液培养12 h;干预组用培养基培养24 h后用含150 μmol/L H2O2的培养基换液培养12 h;对照组只用培养基培养。最后每孔加入10 μL CCK-8溶液测定450 nm处吸光度并计算细胞存活率,计算同公式(2)。
1.3.9 牛乳胞外囊泡的抗氧化作用效果
1.3.9.1 细胞中ROS的检测
取传代2次后状态稳定的细胞以3×105个/孔铺于6孔板,对照组、干预组以及实验组处理方法同1.3.8节,每组3个复孔。培养后参照ROS检测试剂盒说明测定细胞内ROS水平,取10 μL 2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯在37 ℃下避光孵育细胞20 min,洗掉探针后于激光共聚焦显微镜下观察ROS荧光强度并拍摄图片,再使用Image J软件对其进行数据化处理。
1.3.9.2 MDA及抗氧化酶的检测
按1.3.9.1节铺板、处理细胞后去掉上清培养基,每孔加入130 μL细胞裂解液于4 ℃裂解10 min,用细胞刮刀收集裂解细胞后10 012×g离心10 min,取上清液按照MDA、SOD、CAT及GSH-Px试剂盒说明测定牛乳胞外囊泡对细胞内MDA及抗氧化酶含量的影响。
1.4 统计学分析
数据采用SPSS 26软件进行分析、Origin软件作图,结果以“平均值±标准差”表示。多组间样品数据均值差异比较采用单因素方差分析和事后多重比较。结果符合正态分布,P<0.05具有统计意义记为“*”, P<0.01记为“**”。
2 结果与分析
2.1 牛乳胞外囊泡的提取与鉴定
提取得到3种胞外囊泡后通过BCA试剂盒检测其蛋白浓度,结果如图1所示。不同乳制品中胞外囊泡的蛋白浓度排序为:生牛乳源>巴氏杀菌乳源>全脂乳粉源,其中生牛乳胞外囊泡的蛋白浓度显著高于巴氏杀菌乳和全脂乳粉(P<0.01),巴氏杀菌乳与全脂乳粉胞外囊泡则不存在显著性差异。
图1 牛乳胞外囊泡的蛋白浓度
Fig.1 Protein concentration of mEVs
注:**表示P<0.01(下同)。
已有研究表明牛乳的工业加工会影响其胞外囊泡的完整性,可使胞外囊泡中标志性蛋白发生变性、聚集和糖基化,但低热巴氏杀菌处理对胞外囊泡数量影响不大[16]。本研究发现巴氏杀菌乳胞外囊泡的蛋白浓度与生牛乳相比存在显著性差异,一方面可能是本研究巴氏杀菌乳的工艺条件不一样,另外一方面可能是在提取时存在损失。为进一步提高牛乳胞外囊泡的提取量和纯度,不同加工工艺条件对牛乳胞外囊泡的影响有待于进一步系统比较研究。
采用透射电镜观察3种乳制品中牛乳胞外囊泡的形态,结果如图2所示。3种乳制品中的胞外囊泡均具有胞外囊泡的典型结构,呈现出典型的茶托状及双层膜结构;同时研究发现,生牛乳胞外囊泡的膜结构更加完整,整体分布更加均匀,纯度最高,与蛋白浓度检测结果一致。这一研究结果说明热处理等加工工艺对牛乳胞外囊泡的结构形态和完整性具有一定影响。
a-生牛乳;b-巴氏杀菌乳;c-全脂乳粉
图2 牛乳胞外囊泡的透射电镜图
Fig.2 Transmission electron microscopy image of mEVs
通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)2种方法比较了3种乳制品中的牛乳胞外囊泡粒径,结果如表1所示。3种样品的牛乳胞外囊泡平均粒径均为30～200 nm,符合胞外囊泡特征,平均粒径大小结果显示生牛乳源>巴氏杀菌乳源>全脂乳粉源。有研究表明生牛乳胞外囊泡可通过吸附产生胞外囊泡聚团现象,故粒径偏大,与本研究结果一致[17]。原液颗粒数浓度比较发现,生牛乳胞外囊泡的浓度最高,与蛋白浓度的结果一致。胞外囊泡的颗粒蛋白比在一定程度上能够表示所提取胞外囊泡的纯度[18]。3种样品的颗粒蛋白比结果相近。表明3种原料提取的胞外囊泡纯度相近。
表1 牛乳胞外囊泡的粒径及颗粒数浓度
Table 1 Particle size and particle number concentration of mEVs
指标生牛乳巴氏杀菌乳全脂乳粉DLS测定平均粒径/nm150.72±2.23114.02±1.72109.58±1.51NTA测定平均粒径/nm153.9139.6124.4颗粒数浓度/(个/mL)5.2×10122.1×10123.0×1012原颗粒数浓度/(个/mL牛乳)5.9×10109.6×1098.6×109颗粒蛋白比/(个/μg)9.57×1088.97×1081.16×109
2.2 牛乳胞外囊泡对自由基的影响
为探究牛乳胞外囊泡缓解氧化应激的潜力,测定了牛乳胞外囊泡的自由基清除率,结果见图3。总体上看,3种乳制品中的牛乳胞外囊泡在DPPH自由基、ABTS阳离子自由基以及羟自由基清除实验中均呈现浓度依赖性增强的趋势,具有一定自由基清除潜力。参考维生素C当量结果(表2),牛乳胞外囊泡对ABTS阳离子自由基以及羟自由基清除效果更好,推测可能是由于牛乳胞外囊泡作为水溶性物质更易与亲水性自由基接触发生反应所致。另外对比3种样品之间自由基清除效果,发现生牛乳胞外囊泡对DPPH 自由基、ABTS阳离子自由基清除效果显著优于巴氏杀菌乳和全脂乳粉(P<0.01)。
a-DPPH自由基;b-ABTS阳离子自由基;c-羟自由基
图3 牛乳胞外囊泡的自由基清除率
Fig.3 Free radical scavenging rate of mEVs
表2 牛乳胞外囊泡的维生素C当量抗氧化活性值
Table 2 Vitamin C equivalent antioxidant activity value of mEVs
指标生牛乳巴氏杀菌乳全脂乳粉DPPH自由基/(μmol 维生素C/g prot)27.57±4.2612.04±3.5511.63±2.07ABTS阳离子自由基/(μmol 维生素C/g prot)563.56±29.68357.56±3.77391.06±18.55羟自由基/(μmol 维生素C/g prot)217.82±11.24272.46±57.64245.24±40.12
本研究发现加工会影响牛乳胞外囊泡的含量及状态,使胞外囊泡更加分散、膜结构损伤并且含量减小,同时显著影响其DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力。但若考虑胞外囊泡产业化应用中牛乳原料的贮存问题,根据目前结果来看贮存时间相对更长的巴氏杀菌乳、全脂乳粉同样可以作为获取牛乳胞外囊泡的原料,其所提取的胞外囊泡仍具有一定抗氧化功能。
2.3 牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞存活率的影响
为进一步探究牛乳胞外囊泡针对皮肤的抗氧化潜力,测定了不同浓度生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞的作用效果,结果如图4所示。结果显示,25～1 200 μg/mL的生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞均不具有细胞毒性;在50 μg/mL时,细胞存活率存在上升趋势,在200 μg/mL(P<0.01)、400 μg/mL(P<0.05)时作用效果显著,细胞存活率达到(121.68±7.20)%、(116.46±6.00)%,故选择50～800 μg/mL的生牛乳胞外囊泡进行后续研究。
图4 生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞的作用效果
Fig.4 Effect of raw-mEVs on HaCaT cells
注:*表示P<0.05(下同)。
2.4 牛乳胞外囊泡对氧化应激HaCaT细胞存活率的影响
基于H2O2建立了HaCaT细胞氧化应激模型,结果如图5-a所示。在H2O2浓度为150 μmol/L时,细胞存活率为(74.25±2.71)%,最接近70%,因此选择此浓度作为HaCaT细胞的造模浓度。HaCaT细胞造模后(图5-b),干预组与对照组(Control)相比细胞存活率显著降低(P<0.01),而经生牛乳胞外囊泡处理的实验组在200、400、800 μg/mL时与干预组相比细胞存活率显著增加(P<0.05)。本研究结果说明,生牛乳胞外囊泡在200～800 μg/mL时可显著提高H2O2诱导的HaCaT细胞的存活率,对其氧化应激具有显著抑制作用。
a-H2O2造模浓度确定;b-生牛乳胞外囊泡对氧化应激HaCaT细胞的保护作用
图5 氧化应激造模浓度确定及生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞氧化应激的保护作用效果
Fig.5 Determination of oxidative stress modeling concentration and protective effect of raw-mEVs on oxidative stress in HaCaT cells
2.5 牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞中ROS生成的影响
ROS是一系列主要来源于线粒体、内质网、过氧化物酶体和吞噬体的活性分子,在生理过程中作为信号分子能够直接或间接调节细胞生长、坏死、凋亡,维持细胞稳态。机体常见的ROS包括H2O2、羟自由基(·OH)、氢氧根离子(OH-)、超氧阴离子自由基
等[19-20]。当机体内ROS过量时则会由于ROS积累破坏抗氧化防御系统,导致氧化应激。本研究通过激光共聚焦显微镜得到荧光图像,显示细胞内ROS水平,结果如图6-a所示。与对照组相比,干预组绿色荧光信号更强,表明细胞内ROS水平升高。Image J软件量化分析后发现(图6-b),干预组荧光强度与对照组相比显著增加了(114.67±1.62)% (P<0.01),而生牛乳胞外囊泡实验组缓解了ROS水平,且呈浓度依赖性,在400、800 μg/mL时缓解效果显著(P<0.05),表明生牛乳胞外囊泡能够通过抑制细胞内ROS的过量生成来缓解细胞氧化应激。
a-ROS荧光图像;b-荧光图像的定量分析
图6 生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞内ROS生成的影响
Fig.6 Effect of raw-mEVs on generation of intracellular ROS in HaCaT cells
2.6 牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞内MDA及抗氧化酶的影响
MDA是脂质过氧化的最终产物,其含量反映了细胞氧化应激的程度,抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)能够通过清除过多的ROS缓解氧化应激,二者在生物体内形成动态平衡关系[21-23]。上调内源性抗氧化酶的表达,对缓解氧化应激具有重要意义。本研究测定了牛乳胞外囊对HaCaT细胞内MDA和抗氧化酶活性的影响。结果如图7所示。与对照组相比,干预组细胞MDA水平显著增加,抗氧化酶SOD、CAT以及GSH-Px活性显著降低(P<0.05),而实验组800 μg/mL生牛乳胞外囊泡显著提高了氧化应激的HaCaT细胞内SOD活性(P<0.05);200、400、800 μg/mL生牛乳胞外囊泡均能够显著降低MDA水平,提高GSH-Px、CAT活性(P<0.05)。表明生牛乳胞外囊泡可以通过调节细胞内MDA及抗氧化酶水平,提高细胞抗氧化能力。
a-MDA;b-SOD;c-GSH-Px;d-CAT
图7 生牛乳胞外囊泡对HaCaT细胞内MDA及抗氧化酶的作用效果
Fig.7 Effect of raw-mEVs on MDA and antioxidant enzymes in HaCaT cells
3 结论
本研究系统分析了生牛乳、巴氏杀菌乳、全脂乳粉3种牛乳胞外囊泡的蛋白浓度、形态、粒径、颗粒数浓度以及自由基清除能力。结果显示,3种乳制品均能够作为牛乳胞外囊泡的提取原料,但加工会对牛乳胞外囊泡产生一定影响。生牛乳胞外囊泡的蛋白浓度及颗粒数浓度最高,形态更加完整,粒径最大,同时自由基清除效果最好。巴氏杀菌乳、全脂乳粉的胞外囊泡在加工过程中均会产生一定损伤,使胞外囊泡形态完整性降低,浓度减少,粒径变小。另外与生牛乳胞外囊泡相比,巴氏杀菌乳与全脂乳粉胞外囊泡的ABTS阳离子自由基与DPPH自由基清除能力显著降低。生牛乳胞外囊泡虽然因其天然完整性占据生物活性优势,但巴氏杀菌乳与全脂乳粉具有原料易得、长保质期及低成本的优点,在大规模产业化中具有一定优势。
综上,3种原料中生牛乳胞外囊泡含量、形态以及抗氧化能力最好,并且具有缓解HaCaT氧化应激的能力,其作用机制有待进一步探索。本研究为牛乳胞外囊泡在抗氧化食品或护肤领域的研究与开发提供了参考。
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