NaCl在食品加工过程中是重要的增味保鲜调味品,根据世界卫生组织和我国《中国居民膳食指南(2022)》建议,每人每日摄入NaCl应少于5 g[1],然而目前国内家庭人均每日烹调用盐高达9.3 g,部分南方地区(如湖南)甚至超过12 g,过量摄入食盐会加重心脑血管及肾脏负担,提高高血压发病率。因此,挖掘可替代NaCl的天然物质,已成为食品科学领域的研究重点。
大量研究已证实动植物蛋白经酶解或微生物发酵后产生的咸味肽或咸味增强肽可产生显著的咸味特征。目前,咸味肽的研究主要集中在其制备,分离,鉴定与咸味形成机制等方面。通常使用凝胶过滤色谱法、反向高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、飞行时间质谱法等对咸味肽进行分离鉴定。结合分子对接及动力学模拟探究咸味肽与ENaC、TMC4、CaSR等咸、鲜、厚味感知受体结合形式,以及感官评价确定其咸味形成机制[2-3]。BU等[4]通过虚拟水解所得的咸味肽,与咸味受体TMC4进行分子模拟预测其相互作用机制,联合感官评价及电子舌分析,最终验证黑鲈肌肉中的咸味肽的增咸效果。但蛋白质酶解产物由于其原料、工艺等因素的不同,其产物的咸味特征及形成机制也显著不同。
豌豆是一种具有较强的适应生长环境能力的作物,在全球种植广泛,是主要的食品加工原料。豌豆含有丰富的膳食纤维,多酚类化合物,维生素等营养成分,具有善肠道微生态,抗氧化、清除自由基等多种生理功能[5]。豌豆蛋白作为其主要的营养成分之一,其致敏性低,氨基酸组成均衡,在人体中的生物利用率高。富含的谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)等风味氨基酸,被认为是制备风味增强剂的理想前体物质,因此多被作为酿酒、酱油等食品的主要原料。但在食品工业中,豌豆蛋白多作为淀粉、粉丝等加工品的副产物而被低值化利用。因此,提升豌豆蛋白的加工利用率已成为当下急需解决的关键产业难题。
综上,本研究以豌豆蛋白为原料,采用酶解技术对咸味肽的制备工艺及参数进行优化。结合电子舌、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)、液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)等检测技术,定性、定量测定及分析蛋白酶解产物风味特征及风味物质,筛选潜在新型豌豆咸味肽,并进行ENaC模型分子对接,阐明咸味肽与咸味受体间的构效关系,以期为健康低钠食品的研发提供了理论依据和技术路径支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
豌豆蛋白(90%),西安美禾生物科技有限公司;碱性蛋白酶(200 U/mg)、风味蛋白酶(20 U/mg)、胰蛋白酶(猪胰)(2 500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg),上海源叶生物科技有限公司;牛血清蛋白、三氯乙酸、硫酸铜、蔗糖、奎宁,上海麦克林生化科技股份有限公司;酒石酸钾钠、盐酸,天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钠、辽宁泉瑞试剂有限公司;柠檬酸、NaCl、L-谷氨酸钠,北京索莱宝科技有限公司。以上均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
LC-20AD 高效液相色谱仪,LC20 AT 高效液相色谱泵,RID - 20A 示差折光检测器,日本Shimadzu公司;TSKgel GMPWXL 水相凝胶色谱柱,日本Tosoh公司;7725i 手动六通阀进样器,美国IDEX 公司;5430R 离心机,德国Eppendorf公司;GenPure 纯水仪,Q-Exactive HF-X 质谱仪,美国赛默飞世尔科技;NSENT 电子舌,日本 INSENT 公司。
1.3 实验方法
1.3.1 豌豆咸味肽制备
1.3.1.1 不同蛋白酶制备豌豆咸味肽
7.5 g豌豆蛋白溶解于1 000 mL去离子水中,按表1所示,固定不同蛋白酶的最佳酶解温度与最适酶解pH值,在豌豆蛋白溶解液中分别加入碱性蛋白酶(200 U/mg)、风味蛋白酶(20 U/mg)、胰蛋白酶(猪胰)(2 500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg),酶解3 h,酶解结束,将酶解液置于90 ℃水浴锅中,水浴15 min 灭酶处理。4 ℃、10 000 r/min离心15 min后提取上清液进行盐析柱脱盐处理,所得豌豆蛋白酶解产物于-20 ℃冷冻干燥保存,随后对4种酶解产物进行感官评价与电子舌检测。
表1 不同蛋白酶最佳酶解pH值及温度
Table 1 Optimal pH and temperature for different proteases
酶最适pH值最适温度/℃碱性蛋白酶9.040.0木瓜蛋白酶7.060.0胰蛋白酶 10.540.0风味蛋白酶7.550.0
1.3.1.2 碱性蛋白酶单因素实验
以豌豆蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)与可溶性肽含量(soluble peptide content,SPC)为指标,在40 ℃、pH 9.0的固定条件下,采用碱性蛋白酶(200 U/mg)对豌豆蛋白进行酶解,对制备豌豆肽的酶解时间、豌豆蛋白底物浓度及酶添加量这3个因素进行单因素优化。
a)酶解时间:豌豆蛋白质量浓度0.075 g/mL,碱性蛋白酶(200 U/mg)添加量3%(质量分数)条件下,酶解时间分别为1、2、3、4、5 h。
b)豌豆蛋白质量浓度:酶解4 h,碱性蛋白酶(200 U/mg)添加量3%条件下,豌豆蛋白质量浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 g/mL。
c)碱性蛋白酶(200 U/mg)添加量:酶解时间4 h,豌豆蛋白质量浓度0.075 g/mL条件下,碱性蛋白酶(200 U/mg)添加量分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%(质量分数,下同)。
各实验组均测定豌豆蛋白DH与SPC,并将制得酶解液冻干后进行感官评价,以确定最佳酶解条件。
1.3.1.3 DH测定
采用NaOH滴定法进行DH测定,根据酶解过程中的1 mol/L NaOH溶液的消耗量计算酶解程度。每10 min记录1次NaOH溶液的消耗体积,待酶解步骤全部完成后,计算操作过程中使用的NaOH溶液总体积。DH按公式(1)计算:
(1)
式中:VNaOH,酶解过程中消耗的NaOH体积,mL;CNaOH,NaOH的浓度,mol/L;α,氨基的解离度,α=10pH-pK/(1+10pH-pK),pH为酶解过程实际pH,pK为氨基酸的解离常数,采用7.0计算;Mp,蛋白质的总质量,g;htot,蛋白质中肽键的总数,mmol/g,采用豌豆蛋白的htot=7.55 mmol/g。
1.3.1.4 SPC测定
采用凯氏定氮仪测定豌豆蛋白粉中蛋白含量。
使用双缩脲试剂法测定酶解上清液中SPC。2 mL酶解上清液与同体积的150 g/L三氯乙酸溶液混合均匀静置10 min,4 000 r/min离心10 min,取1 mL上清液加入4 mL双缩脲试剂,静置30 min后测定540 nm波长处的吸光度值,根据双缩脲测定蛋白标准曲线计算,酶解液中SPC按公式(2)计算:
(2)
式中:C,酶解液中多肽质量浓度mg/mL;V,蛋白酶解液总体积,mL;N,稀释倍数;M,豌豆蛋白粉实际蛋白含量,g。
1.3.1.5 豌豆蛋白酶解液分级处理
以豌豆蛋白酶解物为底物采用超滤进行<1 kDa、1～3 kDa和3～5 kDa分级处理,所得分级物于-20 ℃冷冻干燥保存,对冻干后的豌豆蛋白酶解产物进行感官评价与电子舌检测。
1.3.1.6 电子舌
将酶解产物冻干样制成1 mg/mL样液,采用电子舌对样品酸、苦、涩、咸、鲜、后味(涩味的回味、后苦味的回味)和丰富度(鲜味回味)的相对强度进行分析。
1.3.1.7 感官评定
感官评价小组成员由10名成员构成,正式评定前,参照GB/T 16291.1—2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分:优选评价员》对评价小组进行感官培训[6]。将不同条件酶解的酶解冻干粉配制成10 g/L 浓度,采用0～10分的评分评价样品如表2所示。以0.8 g/L 柠檬酸、10 g/L蔗糖、0.8 g/L奎宁、3.5 g/L NaC1、3.5 g/L L-谷氨酸钠作为酸、甜、苦、咸、鲜的评价标准品,标准品分值设定为5分。
表2 感官评价标准
Table 2 Sensory Evaluation Criteria
滋味类别0～3分4～7分8～10分咸咸味微弱或令人不适咸味适中咸味明显、滋味丰富鲜鲜味微弱鲜味适中鲜味明显、滋味丰富苦无苦味苦味较弱苦味明显或令人不适甜甜味微弱甜味适中甜味明显、滋味丰富酸酸味微弱酸味适中酸味明显或令人不适
1.3.2 豌豆咸味肽风味物质测定
1.3.2.1 酶解产物分子质量测定
通过凝胶渗透色谱法测定F1(<1 kDa)组分分子质量分布。流动相:含0.05%(体积分数)NaN3的NaNO3溶液(0.1 mol/L),流速0.6 mL/min,柱温35 ℃。将冻干样品溶解形成10 mg/mL样液,使用0.45 μm的膜过滤器过滤。将20 μL样液注人高效液相色谱系统,用差示折射率检测器检测蛋白质,所得结果经聚乙二醇校准。
1.3.2.2 游离氨基酸测定
采用HPLC测定F1(<1 kDa)组分中的游离氨基酸。A相:V[0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5)]∶V(乙腈)=93∶7;B相:V(乙腈)∶V(水)=80∶20;流速:1.0 m L/min;温度:36 ℃。称取F1(<1 kDa)组分冻干样溶解,连续5次充氮,熔封,烘箱110 ℃水解24 h后,取溶液1.0 mL,N2吹干盐酸,加1.0 mL水复溶。200 μL溶液与100 μL A液和100 μL B液,混合,摇匀后放置60 min;加入正己烷溶液400 μL振摇5～10 s,室温静置,待分层,取下层200 μL溶液,加入800 μL水混合均匀,再取200 μL加入800 μL水混合均匀,用0.22 μm有机膜过滤,进行分析。
1.3.2.3 咸味肽测定
1.3.2.3.1 豌豆咸味肽序列测定
采用LC-MS/MS测定F1(体积分数)(<1 kDa)组分中肽段序列。A液:0.1%(体积分数)甲酸水溶液。B:0.1%(体积分数)甲酸、80%(体积分数)乙腈和水混合溶液。色谱柱以100%的A液平衡。样品经色谱分析柱进行梯度分离,流速为300 nL/min。液相分离梯度:0～2 min,B液线性梯度从2%～5%;2～44 min,B液线性梯度:5%～28%,44～51 min;28%～40%,51～53 min;40%～100%,53～60 min;维持100%。用质谱仪对分离的肽段进行质谱分析。
1.3.2.3.2 豌豆咸味肽呈味筛选
对鉴定的多肽使用PeptideRanker进行活性打分。采用BIOPEP-UWM数据库对所得肽段进行咸鲜活性片段分析及呈味预测分析筛选新型咸味肽[7-8](PeptideRanker:https://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/Server_pages/help/peptideranker/help.php.BIOPEP-UWM:https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start biopep.php)。
1.3.3 豌豆咸味肽与ENaC分子对接
1.3.3.1 豌豆咸味肽和ENaC的结构构建
ENaC-α、ENaC-β、ENaC-γ(PDB ID:P37088、P51168、P51168)这3个亚基靶点蛋白晶体结构来自于蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)。运用Pymol 2.1软件剔除蛋白分子中的无关小分子后,将该蛋白分子导入AutoDock Tools-1.5.6软件,依次完成水分子移除、氢原子添加及原子类型设置操作,最终保存为pdbqt格式文件。
多肽结构(PGLAR)借助Chem3D对多肽进行能量最小化处理,并将其转换为pdb格式。将小分子多肽导入AutoDock Tools-1.5.6软件后,添加原子电荷、分配原子类型,且将所有柔性键设置为默认可旋转,完成上述步骤后保存为pdbqt格式
1.3.3.2 豌豆咸味肽与ENaC分子对接
多肽PGLAR为小分子配体,P37088蛋白靶点为受体,依据小分子与靶点间的相互作用,Grid Box的中心坐标被设定为(x=164.719,y=144.95,z=141.093),其长、宽、高维度均120 Å×120 Å×120 Å。分子对接操作最终执行依托AutoDock完成,对接结束后对所得结果展开系统分析,而多肽与蛋白间结合作用的可视化呈现,则借助Pymol 2.1软件来实现。在计算过程中,借助Lamarckian遗传算法,相关算法参数:群体规模150,能量评估上限2 500万次,最高迭代次数2 000,交叉概率0.8,突变概率0.02。对接过程共独立执行200次,最终对接结构的评估以结合自由能为标准。
1.4 数据处理与分析
以上实验均进行3次有效实验,使用SPSS 27软件对实验结果进行单因素方差分析;沃勒-邓肯检验比较均值(P<0.05);Origin 2018 64Bit软件绘图。
2 结果与分析
2.1 四种酶酶解效率与产物呈味分析
由图1可知,碱性蛋白酶处理的豌豆蛋白DH和SPC显著高于其他处理组(图1-a、图1-b),分别达到17.34%和19.10%(P<0.05)。这是因为不同种酶的作用位点不同所致,木瓜蛋白酶与胰蛋白酶偏好针对赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)等碱性氨基酸的位点发挥作用[9];风味蛋白酶为复合型酶类外肽酶则偏向从大分子肽链末端逐步释放氨基酸[10],豌豆蛋白较大的分子质量与复杂的空间结构使风味蛋白酶与肽链末端接触受阻;而碱性蛋白酶具有广泛的作用位点尤其偏向肽键内部靠近疏水性氨基酸与芳香族氨基酸,因而其显著促进了豌豆蛋白的酶解,使酶解产物中SPC较高[11]。
a-豌豆蛋白DH;b-酶解产物SPC
图1 不同蛋白酶对豌豆蛋白酶解效果的影响
Fig.1 Effects of different proteases on hydrolysis of pea protein
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
由图2结果可知,不同酶的酶解产物显现不同程度的咸鲜值,其中,碱性蛋白酶的咸鲜味特征最为突出(P<0.05)。此现象与HUANG等[12]发现碱性蛋白酶酶解产物具有明显的咸味的结果相一致。可能是由于碱性蛋白酶酶解蛋白过程中释放更多Glu,Asp等鲜味成分,同时在碱性环境下(pH 8～10)打破离子平衡,促进Na+对咸味受体的激活。综合酶解效率与感官评价结果,选择碱性蛋白酶作为制备豌豆咸味肽的最适酶。
a-酶解产物咸鲜感官评分图;b-酶解产物咸鲜电子舌评分图;c-酶解产物电子舌雷达图;d-酶解产物感官评分雷达图
图2 不同蛋白酶对豌豆蛋白酶解产物感官效果的影响
Fig.2 Effect of different proteases on the sensory effects of pea protease hydrolysis products
注:图中不同大写字母表示咸味结果差异显著(P<0.05),不同小写字母表示鲜味结果差异显著(P<0.05)(下同)。电子舌评分中,咸味的无味点为-6,鲜味的无味点为0,以此为基点,低于无味点则无味道,反之则有(图6同)。
2.2 碱性蛋白酶制备豌豆咸味肽工艺条件的优化
2.2.1 酶解时间
酶解工艺条件(时间、底物质量浓度、酶添加量),直接关系到酶解产物中滋味肽段的分子质量大小,氨基酸组成及其他副产物的生成,最终影响酶解产物咸鲜滋味值。由图3-a可知,酶解时间越长,豌豆蛋白DH越高,呈味效果越显著。酶解4 h时,豌豆蛋白DH和SPC达到20.70%和59%(图3-a、图3-b),与5 h相比差异不显著(P>0.05)。该结果与XIA等[13]的研究相一致,在同一底物质量浓度条件下,碱性蛋白酶特定酶切位点的可用性变得有限,4 h后豌豆蛋白中碱性蛋白酶酶切位点显著减少。随着酶解时间的延长DH与SPC无显著变化(P>0.05)。感官评价结果显示4 h酶解产物的感官咸味评分8.67分显著高于其他处理组(P<0.05,图3-c),超过4 h咸味明显下降,鲜味5 h达到最高水平(P<0.05,图3-c)。这可能是由于在蛋白酶解产物中,咸味感知依赖于肽段所含氨基酸所带电荷特性与肽段大小,而鲜味感知依赖于具有呈味特性的小分子如游离谷氨酸或肽段中的特定功能基团。酶解至4 h时咸味多肽质量浓度值达到最高,超过4 h咸味肽被进一步降解,形成无咸味或鲜味强烈的小肽或氨基酸,导致咸味减弱。根据酶解效率与感官评分综合评定,选择4 h作为最佳酶解时间。
a-豌豆蛋白DH;b-酶解产物SPC;c-酶解产物咸鲜感官评分图;d-酶解产物感官评分雷达图
图3 酶解时间对碱性蛋白酶解豌豆蛋白效果及感官的影响
Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the hydrolysis of pea protein by alkaline protease and sensory analysis
注:图b不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2.2 底物质量浓度
由图4-a、图4-b可知,底物质量浓度的增加显著提高了豌豆蛋白DH与SPC,底物质量浓度0.075 g/mL时,豌豆蛋白DH与SPC达到20.67%和61.41%(P<0.05),酶解产物咸味评分达到最高评分7.7分(P<0.05,图4-c)。当底物质量浓度高于0.075 g/mL,DH和SPC变化不显著(P>0.05),咸味显著降低。这可能是由于酶解过程中,底物质量浓度过高发生蛋白局部聚集现象,碱性蛋白酶难以参与到聚集区域内部发挥作用。同时高质量浓度底物使酶-蛋白体系黏度增大,阻碍酶在底物中的扩散,使反应速率减慢。根据酶解效率与感官评分综合评定,选择0.075 g/mL作为最佳底物质量浓度。
a-豌豆蛋白DH;b-酶解产物SPC;c-酶解产物咸鲜感官评分图;d-酶解产物感官评分雷达图
图4 豌豆蛋白质量浓度对碱性蛋白酶酶解效果及感官的影响
Fig.4 Effect of pea protein concentration on enzymatic hydrolysis and sensory function of alkaline protease
2.2.3 酶添加量
由图5-a、图5-b可知,随着酶添加量的增高,豌豆蛋白的DH、SPC及咸鲜评分均大幅度提高,酶添加3%时,豌豆蛋白DH、SPC最高,为18.48%及62.96%,且咸味评分也达到最高6.9分(P<0.05,图5-c)。酶添加量超过3%,豌豆蛋白DH、SPC与咸味随着酶添加量增大而下降,这可能是由于底物质量浓度一定的情况下,碱性蛋白酶作用位点有限,且过量酶存在竞争性抑制。根据酶解效率与感官评分综合评定,选择3%作为最佳酶添加量。
a-豌豆蛋白DH;b-酶解产物SPC;c-酶解产物咸鲜感官评分图;d-酶解产物感官评分雷达图
图5 碱性蛋白酶添加量对豌豆蛋白酶解效果及感官的影响
Fig.5 Effect of alkaline protease content on the proteolytic hydrolysis and sensory function of pea
2.3 豌豆蛋白酶解产物的分级及不同级分的呈味分析
如图6所示,将豌豆蛋白酶解产物进行分级处理,分别得到3个组分F1(<1 kDa)、F2(1～3 kDa)、F3(3～5 kDa),进行电子舌和感官评价分析,结果表明,F1(<1 kDa)组分电子舌与感官评分咸鲜得分均显著高于其他组分(P<0.05,图6-a、图6-b),这与CHEN等[14]的结果相一致,低分子质量(<1 kDa)酶解物中有更多的咸鲜味物质。同时研究坛紫菜酶解产物经超滤处理,已证实酶解产物中咸鲜风味物质浓度升高,增强了其咸味[15]。综上,选取F1组分进一步分析其呈味效果。
a-F1、F2、F3组分咸鲜感官评分图;b-咸鲜电子舌评分图;c-电子舌雷达图;d-感官评分雷达图
图6 分级处理对酶解产物感官的影响
Fig.6 Effect of graded treatment on the sensory properties of enzymatic hydrolysis products
2.4 豌豆蛋白酶解产物分子质量测定
食物源蛋白经酶解后,形成的低分子质量肽段通常表现出较强的咸鲜味。图7是豌豆蛋白主要酶解产物的分子质量分布情况,结果表明,F1组分中分子质量主要集中于1 000 Da以下,其中500 Da以下组分占比超70%,与LIOE等[16]发现发酵大豆凝乳中低于500 Da级分鲜味最突出的结果相一致。JU等[17]同样发现低分子质量物质,尤其是<500 Da咸味肽呈咸效果更好。因此推测F1组分中低分子质量(<500 Da)咸味肽在咸鲜味中起主导作用。酶解产物作为复杂的风味体系,肽段结构及其他成分对F1的咸鲜贡献程度还需要进一步研究分析。
图7 F1组分分子质量分布图
Fig.7 Molecular weight distribution of the F1 fraction
2.5 豌豆蛋白酶解物的游离氨基酸种类及含量
游离氨基酸在蛋白酶解产物中的组成与含量差异,会直接影响酶解产物咸鲜味的强弱。由图8可知,F1级分含有17种游离氨基酸,与未酶解的豌豆蛋白相比,酶解物中Glu、Asp、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)等呈咸鲜风味的氨基酸显著升高。这与陕怡萌等[18]在酵母抽提物关键增咸物质分析中发现Asp、Ser、甘氨酸(Gly)、Glu和Ala均有增咸作用的结果一致。同样SAKAI等[19]采用酶混合处理蔬菜汤发现产生的谷氨酸和支链氨基酸可协同提高蔬菜汤的咸鲜味。酶解产物中Glu占比7.8%,有研究发现Glu能够与谷胱甘肽,有机酸或其他呈味氨基酸Arg、Lys协同增强NaCl溶液的咸度[20]。由此说明Glu、Asp、Ser、Ala促进F1组分中咸鲜味的表达,且Glu促进作用更强。
图8 豌豆蛋白水解前后F1组分游离氨基酸对比
Fig.8 Comparison of free amino acid contents in the F1 fraction before and after pea protein hydrolysis
2.6 豌豆蛋白酶解产物肽段序列及呈味预测分析
咸味肽可与咸味受体结合诱发咸味感知,咸味肽氨基酸组成,氨基酸序列的差异,分子力量大小及空间折叠结构的不同,使其可以呈现出显著的咸鲜差异。一般情况下,咸味肽主要为短肽链。目前已知咸味肽氨基酸组成序列大部分与Glu(E)、Asp(D)有关[21]。蛋白酶解产物是含有多种多肽的复杂体系,其咸鲜值高低不仅与咸味肽含量有关还与具体氨基酸组成有关。
为明确F1酶解产物中肽段氨基酸组成及序列对咸鲜味影响,采用LC-MS对F1肽段进行氨基酸序列测定。表3反应的是豌豆蛋白酶解产物中F1组分中的主要肽段序列。通过BIOPEP-UWM数据库分析已知的咸鲜呈味活性片段,得到的22条肽段中,分子质量主要集中在400～700 Da,多为5肽或6肽,与图7分子质量测定结果相对应。由表3可知F1组分咸味或咸味增强活性片段Ala(A)、Arg(R)、Asp(D)及Glu(E)氨基酸出现频率最高,CHEN等[22]研究发现Arg(R)和Lys(K)在多肽咸味表达中起促进作用的结果相一致。另有研究表明含鲜味氨基酸Lys(K)、Ala(A)、Val(V)的短肽伴随增咸特征[23]。由此可推测表3中所含咸鲜活性片段的肽段促进F1咸鲜风味的表达,且含有AR、A、R、D、E片段的肽段在咸味中起主要促进作用。
表3 F1组分肽段序组成分析
Table 3 Analysis of peptide sequence composition in the F1 fraction
序号肽段序列分子质量/Da咸味片段咸味增强片段鲜味片段鲜味增强片段1SWLRL673.39————2PAALR526.32————3LFAAG477.26————4PGLAR512.31—AR——5YVVLK620.39——VV—6RLVLL612.43————7LLLAF575.37————8TLVLL557.38————9LVLLL569.42————10LLVVQ570.37——VV—11MIIVVQ701.41——VV—12LKLVLL697.51————13LLLLLA654.47————14LLVLLK697.51————15IAVLIRIL909.64————16LIPARLVLL1 006.69—AR——17SLIDKILPVY1 159.69D—D—18LSDISDLLGELK1 301.71D—D、E、EL—19AVFVDLEPTVIDEVR1 700.90D、DEVRD、E、DE、VD、EV—20LQSLNNTMNKSQEAFEKK2 109.05——E、EA、EK—21AFVHWYVGEGMEEGEFSEAR2 329.01EEARE、EE、EG、VG、EA—22PKPPMVVMLPSPGMGHLIPMIEFAKRIS3 072.65——E、VV—
注:D、DE、AR、EE等为肽段内部具有咸鲜活性的片段,“—”为未检出。
咸味肽作为一类典型的小分子短链肽,根据已被证实的肽链氨基酸排列顺序与咸味关系中精氨酸(R)位于肽段N端或C端的结构特征,对其咸味具有显著的增强效应[21],结合BIOPEP-UWM数据库进行感官活性预测,筛选得出F1中PGLAR为新型潜在豌豆咸味肽。为探究其呈咸机制,将PGLAR与ENaC模型进行分子对接。
2.7 豌豆咸味肽与ENaC分子对接分析
咸味肽可以通过与味觉受体结合释放特定神经信号,后传递到大脑,使人体感知咸味,ENaC是公认的咸味受体之一。豌豆咸味肽PGLAR分别与咸味受体ENaC-α、ENaC-β、ENaC-γ这3个亚基通过计算机辅助分子对接,对应得到结合能大小为:ENaC-α(-6.519 kcal/mol)、ENaC-β(-5.625 kcal/mol)、ENaC-γ(-5.427 kcal/mol)。一般来说,若活性肽与靶蛋白之间的结合能小于0,两者可自发结合,当结合能低于-5.0 kcal/mol时,表明该肽与靶蛋白具有较强的亲和力[24]。该结果表明PGLAR与靶蛋白ENaC具有很强的亲和力,尤其与ENaC-α亚基存在自发的高亲和力。该结果与XU等[25]研究相一致,咸味肽(AR)能增强对ENaC-α细胞的反应。
通过Pymol 2.1软件对结合能最低的对接构象(ENaC-α亚基)进行可视化分析,结合界面的分子间相互作用力及对接位点总结如表4所示。如电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044199)所示,PGLAR多肽作为配体,与受体蛋白的氨基酸残基Tyr444、His298、Thr266和Pro264间形成了氢键作用,特别是与His298形成短键,极大地增强了多肽与ENaC-α亚基的结合强度,这是使肽段PGLAR与ENaC-α亚基能够特异性结合和维持稳定的核心。多肽与受体蛋白的Pro437、Tyr407、Leu260、Leu263及Tyr140间形成了显著的疏水效应,这有助于PGLAR稳定地包埋于结合口袋深处,并排除溶剂水分子,从而增强结合的熵驱动力。同时,PGLAR多肽的整体三维构象与ENaC-α亚基蛋白结合腔的拓扑结构高度匹配。这种优异的“锁-钥”式契合不仅最大化了分子间的有效接触面积,还为氢键与疏水相互作用的形成创造了理想的几何条件。PGLAR通过多重分子间作用力与ENaC-α有效结合,表明了PGLAR肽段对咸味受体具有激活能力,同时两者间能够形成结合强度高且稳定的构效关系。
表4 PGLAR与ENaC-α的作用力结合位点统计
Table 4 Statistics of the binding sites and interaction forces between PGLAR and ENaC-α
靶蛋白ID肽段序列结合能得分/(kcal/mol)氢键(距离/Å)疏水相互作用(距离/Å)P37088PGLAR-6.519 TYR444(3.08 Å), HIS298(2.15 Å),THR266(2.49 Å), PRO264(2.67 Å)PRO437(4.02 Å)、TYR407(4.53 Å)、LEU260(4.63 Å)、LEU263(4.08 Å)、TYR140(4.68 Å)
3 结论
本研究主要优化了豌豆咸味肽制备工艺参数,通过DH、SPC,结合电子舌和感官分析指标筛选出碱性蛋白酶酶解液咸鲜味最佳,最适酶解工艺条件为:酶解时间4 h,底物质量浓度0.075 g/mL,酶添加量3%。经分级处理,筛选出碱性蛋白酶酶解液中F1(<1 kDa)组分咸鲜味最强,采用凝胶渗透色谱法、HPLC及LC-MS/MS结合Biopep-UWM数据库分析F1中咸鲜味主要与Glu、Asp、Ser、Lys游离氨基酸及短肽有关。并筛选出F1组分中具有咸鲜风味特征肽段,其中PGLAR肽段为新型潜在豌豆咸味肽,通过与构建的ENaC蛋白模型进行分子对接,确定PGLAR多肽与ENaC-α亚基可以有效的结合。本研究结果在进一步提高豌豆蛋白利用率的基础上,为咸鲜调味品的研发提供理论依据和技术支持。
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