酱香型白酒作为中国白酒四大香型之一,因其具有酱香突出,幽雅细致,色泽微黄,空杯留香持久,酒体醇厚等典型的风格特点,受到了广大用户的青睐[1]。酱香型白酒采用两次投料、九次蒸煮、八次发酵、七次取酒的工艺,因此酱香型白酒的每一个轮次堆积发酵和窖池发酵都会严重影响其酿造过程。前一个轮次的异常发酵会影响下一个轮次的正常进行,因此对酱香型白酒每一个轮次的把控都极为重要,但酱香型白酒酒醅酸度高是其在酿造过程中的一大特点,其中酸类风味物质主要包括乙酸、乳酸、丙酸、丁酸以及高级脂肪酸等有机酸,前期轮次酒醅中有机酸过度累积将会严重影响微生物生长代谢,最终导致发酵异常。丙酸和乙酸作为白酒中主要的短链有机酸,既是风味调节剂,也是微生物代谢的产物。适量的乙酸可赋予酒体柔和的酸香,并参与酯类合成(如乙酸乙酯),但过量则会破坏酸甜平衡,导致口感刺激[2]。丙酸则因其挥发性强,易与醇类生成丙酸乙酯等物质,但其浓度过高可能引发类似“汗酸”的不愉悦气味,甚至抑制酵母菌活性,降低出酒率[3]。此外,一、二轮次基酒高级醇含量偏高是酱香型白酒生产的普遍问题,适量的高级醇可增加酒香和酒体的甜度,过量的高级醇则会降低白酒饮后舒适度,所以控制高级醇含量具有重要意义。
控制白酒酸度和高级醇含量的方法有改变发酵工艺、大曲用量等,也有研究通过添加性能优良的微生物来改善白酒酸度和高级醇含量。库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)共培养显著增加乳酸消耗,将乳酸从40.00 g/L降低至26.29 g/L。降酸能力比单一培养库德里阿兹威氏毕赤酵母高90%,比单一培养酿酒酵母降酸能力高209%[4]。高耐酸性的粟酒裂殖酵母可以将酱香型白酒酒醅中的乙酸含量从9.62 g/kg降低至6.55 g/kg[5]。此外,研究表明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)可以调控酱香型白酒酒醅酸度和高级醇,强化后酒醅酸度降低28%,正丙醇降低45.2%[6]。利用耐低温和耐酸生长能力强、酒精产率高的矮小假丝酵母控制白酒中高级醇的含量,使发酵结束酒样高级醇含量为标准菌株发酵结束酒样的69.5%[7]。清香型小曲白酒生产中添加乳杆菌可降低高级醇含量,使酒醅中高级醇含量降低52.2%,但总酸含量会上升2.5倍[8]。由此可见,添加微生物菌剂可以有效调控白酒生产中有机酸和高级醇的合成。基于此,本研究采用从酱酒酒醅中筛选的发酵性能良好的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)L21与地衣芽孢杆菌BE1制成单一和复合的微生物菌剂采用原位发酵实验探究菌剂对酒醅有机酸和高级醇的降低效果。本研究分析了添加菌剂对微生物菌群的影响,探讨微生物组成差异,通过基于样本中的标记基因序列丰度来预测样本功能丰度的软件(PICRUSt2)对群落进行系统发育研究,预测不同样品中目标差异高级醇及有机酸代谢关键酶的丰度和主要贡献菌属,对有机酸和高级醇合成机制进行了解析。本研究为同时解决白酒酿造过程中酸度过高、高级醇含量过高的问题提供思路,为复合微生物菌剂在白酒生产中的应用提供理论依据,为复合菌剂抑制有机酸和高级醇合成机制提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鼠李糖乳酪杆菌L21(保藏编号为:CGMCC NO.32609),地衣芽孢杆菌BE1(保藏编号为:CGMCC NO.28071),糙沙轮次酒醅,河北某酒厂;无菌生理盐水,0.1 mol/L磷酸盐缓冲液。
1.2 仪器与设备
UV mini-1240紫外分光光度计,岛津仪器有限公司;gL20A高速冷冻离心机,中科院生物物理所技术服务公司;7890A气相色谱仪,河北某酒厂;美国Agilent公司;LRH-250A生化培养箱,上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 原位发酵实验
将从本土酒醅中筛选出的鼠李糖乳酪杆菌L21以105 CFU/g、地衣芽孢杆菌BE1以106 CFU/g的接种量分别按单一菌剂和复合菌剂接入蒸酒摊凉后的糙沙轮次5 kg酒醅中,空白组为等体积的无菌生理盐水;再加入质量分数为18%的大曲翻拌均匀后,分至布袋中分别命名为空白组(CK)、单一鼠李糖乳酪杆菌菌剂(L21)、单一地衣芽孢杆菌菌剂(BE1)、复合菌剂(L21+BE1),放置到酒醅堆的中部位置,堆积发酵2～3 d后,将样品进行翻拌,模拟移堆操作,取样后,将其再放入纱布袋中,随着酒醅堆进入到窖池发酵阶段,窖池发酵持续30 d左右,发酵结束后取出样品。共在堆积初期(S0)、堆积末期(SM)、窖池末期(PM)3个时间点取样,对酒醅中的总酸、还原糖、水分、有机酸和高级醇含量和微生物扩增子测序进行分析。
1.3.2 发酵酒醅理化因子、有机酸、高级醇检测
根据乔潞[9]的方法对酒醅水分、总酸、还原糖、有机酸、高级醇含量进行检测。
1.3.3 微生物扩增子测序分析
样品预处理[9]:称取30 g酒醅溶于100 mL,pH 8.0 的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中,充分振荡混匀,用布氏漏斗过滤去除高粱、麸皮等大颗粒谷物杂质,利用高速冷冻离心机(10 000 r/min,4 ℃,10 min)离心,去除滤液,收集沉淀物于-80 ℃保存。DNA提取及PCR扩增均由派森诺公司承担。
1.4 数据处理
使用SPSS 26.0对风味物质理化因子进行显著性分析,用派诺森基因云平台对扩增子数据进行微生物组成分析,此外,利用PICRUSt2预测基于KEGG数据库的功能组成和代谢途径。所有图表均使用GraphPad Prism(9.5.1版本)绘制。
2 结果与分析
2.1 添加不同菌剂对酒醅理化因子影响
一轮次酱酒酒醅酸度和高级醇偏高已成为制约行业发展的共性问题,针对此,本研究利用2株具有抑制有机酸和高级醇潜力的本土菌株:鼠李糖乳酪杆菌L21和地衣芽孢杆菌BE1,研究采用原位发酵实验,在糙沙轮次酒醅中分别接种单一及复合菌剂,并系统分析发酵体系的理化指标变化,结果见图1。如图1-a所示,发酵阶段不同菌剂的应用对酒醅水分含量(37.5%～38.8%)无显著影响。如图1-b所示,不同菌剂的应用对堆积结束酒醅的总酸含量无显著影响。然而,窖池发酵结束,菌剂L21酒醅酸度为0.87 mmol/10 g,与CK相比,L21组酸度显著下降0.29 mmol/10 g,下降25.00%;菌剂BE1组酒醅酸度为0.81 mmol/10 g,与CK相比,BE1组酸度显著下降0.34 mmol/10 g,下降29.55%;菌剂L21+BE1组酒醅酸度为0.79 mmol/10 g,与CK相比,L21+BE1组酸度显著下降0.37 mmol/10 g,下降31.82%。不同菌剂的应用均使窖池阶段酒醅酸度显著下降,然而,单一菌剂L21和BE1两者之间对总酸含量的降低效果无显著差异,复合菌剂和单一菌剂之间对总酸含量的降低效果也无显著差异,未呈现叠加效果。如图1-c所示,堆积阶段,与CK相比,不同菌剂组还原糖含量无显著差异。窖池发酵结束,菌剂L21组酒醅还原糖含量为1.15%,较CK组显著增加0.55%,增幅约91.67%;菌剂BE1组酒醅还原糖含量为1.1%,较CK组显著增加0.50%,增幅约83.33%;菌剂L21+BE1组酒醅还原糖含量为0.975%,较CK组显著增加0.38%,增幅约62.50%。窖池发酵结束不同菌剂的添加均使还原糖显著提升,这主要归因于可能外源菌剂的添加使体系中淀粉酶糖化酶增加,淀粉转化为还原糖增加。进一步分析表明,鼠李糖乳酪杆菌可以通过分泌麦芽糖淀粉酶,利用原料淀粉转化为还原糖[10];而地衣芽孢杆菌产较强活性的淀粉酶[11],使得酒醅还原糖含量增加。如图1-d所示,发酵结束,与CK相比,添加菌剂L21、BE1、L21+BE1的酒醅乙醇含量无显著变化。添加菌剂不影响窖池发酵结束酒醅的乙醇产量,菌剂的添加不影响白酒的产酒率。
a-水分;b-酸度;c-还原糖;d-乙醇
图1 不同菌剂应用对酒醅理化的影响
Fig.1 Effects of bacterial agents on physicochemical properties of fermented grains
注:*,显著性差异为0.01<P<0.05;**,显著差异为0.001<P<0.01;***,显著差异为0.000 1<P<0.001(下同)。
2.2 添加不同菌剂对酒醅中高级醇含量的影响
适量的高级醇呈现出与乙醇相似的气味,会使酱酒中香气和口味保持良好,但高级醇过量时,会使酒体苦涩辛辣,导致酒后易上头,严重影响酒后舒适度[12]。如图2所示,酒醅中共检测2种高级醇包括正丙醇和仲丁醇,以正丙醇为主。窖池发酵结束,L21菌剂组酒醅正丙醇含量为2 253.32 mg/kg,较CK组显著下降467.40 mg/kg,降幅约17.18%;BE1菌剂组酒醅正丙醇含量为2 159.16 mg/kg,较CK组显著下降561.56 mg/kg,降幅约20.64%;L21+BE1菌剂组酒醅正丙醇含量为2 346.77 mg/kg,较CK组显著下降373.95 mg/kg,降幅约13.74%。菌剂L21、BE1、L21+BE1均使窖池阶段酒醅正丙醇含量显著下降,单一菌剂L21和BE1两者之间对正丙醇含量的降低效果无显著差异,复合菌剂和单一菌剂之间对正丙醇的降低效果也无显著差异。窖池发酵结束,L21菌剂组酒醅仲丁醇含量为42.90 mg/kg,较CK组显著下降13.34 mg/kg,降幅约23.73%;BE1菌剂组酒醅仲丁醇含量为40.73 mg/kg,较CK组显著下降15.50 mg/kg,降幅约27.57%;L21+BE1 菌剂组酒醅仲丁醇含量为52.32 mg/kg,较CK组显著下降39.92 mg/kg,降幅约6.98%。菌剂L21、BE1、L21+BE1均使窖池阶段酒醅仲丁醇含量显著下降,单一菌剂L21和BE1两者之间对仲丁醇含量的降低效果无显著差异,单一菌剂BE1对仲丁醇含量的降低效果比复合菌剂L21+BE1的降低效果更好。总体分析,L21菌剂组酒醅高级醇含量为2 296.21 mg/kg,较CK组显著下降480.75 mg/kg,降幅约17.31%;BE1菌剂组酒醅高级醇含量为2 199.89 mg/kg,较CK组显著下降577.07 mg/kg,降幅约20.78%;L21+BE1菌剂组酒醅高级醇含量为2 399.09 mg/kg,较CK组显著下降377.87 mg/kg,降幅约13.61%。菌剂L21、BE1、L21+BE1均使窖池阶段酒醅高级醇含量显著下降,单一菌剂L21和BE1两者之间对高级醇含量的降低效果无显著差异,复合菌剂和单一菌剂之间对高级醇的降低效果也无显著差异。
图2 窖池发酵结束时酒醅中高级醇含量分析
Fig.2 Analysis of higher alcohols content in fermented grains at the end of pit fermentation
2.3 添加不同菌剂对酒醅有机酸的影响
有机酸影响乳酸乙酯、乙酸乙酯等主要酯类物质含量,但过量的有机酸会对微生物有毒害作用,破坏微生物代谢平衡,导致酸败现象[13]。
乳酸能赋予白酒醇厚的口感[14],然而,当酒醅中乳酸含量偏高时,会破坏微生物细胞内外质子平衡,损伤细胞膜,干扰微生物正常生长代谢,因此控制乳酸至关重要。如图3-a所示,整体分析发现,窖池发酵阶段是乳酸含量显著上升的主要时期。与CK相比,不同菌剂的添加对堆积和窖池阶段的乳酸含量无显著影响。有趣的是,添加乳酪杆菌并没有使乳酸含量显著增加,有利于对酒醅中乳酸的控制,菌剂的添加不会使酒醅乳酸增加,有利于菌剂在白酒生产中的实际应用。
a-乳酸;b-乙酸;c-丙酸
图3 酒醅有机酸含量分析
Fig.3 Analysis of the organic acids content in fermented grains
注:a、b、c表示在P<0.05水平上显著(下同)。
对添加不同菌剂的酒醅乙酸含量的变化分析结果(图3-b)整体分析,窖池发酵阶段是乙酸显著上升的主要时期。窖池阶段,L21菌剂组酒醅乙酸含量为7 633.16 mg/kg,较CK组显著下降1 496.52 mg/kg,降幅约16.39%;BE1菌剂组酒醅乙酸含量为6 606.66 mg/kg,较CK组显著下降2 523.02 mg/kg,降幅约27.64%;L21+BE1菌剂组酒醅乙酸含量为7 199.93 mg/kg,较CK组显著下降1 929.75 mg/kg,降幅约21.14%。菌剂L21、BE1、L21+BE1均使窖池阶段酒醅乙酸含量显著下降,单一菌剂BE1对乙酸含量的降低效果比单一菌剂L21更好,复合菌剂和单一菌剂之间对乙酸的降低效果无显著差异。
丙酸是白酒中一种重要的微量有机酸,其在酱香型白酒中的含量显著高于其他香型[15]。在酱香型白酒发酵的前几轮,酒醅中的丙酸含量往往较高[16]。这种高含量的丙酸会抑制酵母活性、降低酒精转化效率,同时也会破坏乳酸菌与酵母菌的共生平衡,进而阻碍发酵进程。添加不同菌剂对酒醅丙酸含量的影响如图3-c所示,整体分析发现,随着时间的延长,丙酸呈上升趋势,堆积阶段是丙酸显著增加的关键时期。堆积发酵结束,L21菌剂组酒醅丙酸含量为80.24 mg/kg,较CK组显著下降23.43 mg/kg,降幅约32.38%;L21+BE1菌剂组酒醅丙酸含量为74.83 mg/kg,较CK组显著下降28.85 mg/kg,降幅约36.94%。单一菌剂L21与复合菌剂L21+BE1的添加使堆积发酵结束酒醅中丙酸含量显著下降,复合菌剂和单一菌剂L21之间对丙酸含量的降低效果无显著差异。窖池发酵结束,L21菌剂组酒醅丙酸为105.00 mg/kg,较CK组显著下降14.82 mg/kg,降幅约12.37%;BE1菌剂组酒醅丙酸含量为102.61 mg/kg,较CK组显著下降17.21 mg/kg,降幅约14.36%;L21+BE1 菌剂组酒醅丙酸含量为95.62 mg/kg,较CK组显著下降24.20 mg/kg,降幅约20.20%。单一菌剂L21、BE1及复合菌剂L21+BE1的添加均使窖池发酵结束酒醅丙酸含量显著下降。值得注意的是,单一菌剂L21和BE1两者之间对丙酸含量的降低效果无显著差异,复合菌剂L21+BE1对丙酸含量的降低效果显著,比单一菌剂L21和BE1更好。
L21、BE1单一菌剂及L21+BE1复合菌剂处理均能显著降低酒醅中的乙酸与丙酸含量。其中,L21+BE1复合菌剂不仅对这2种酸含量具有显著的降低效果,其在降低丙酸含量方面,相较于单一菌剂效果更好。
2.4 添加不同菌剂对酒醅微生物群落结构的影响
2.4.1 添加不同菌剂对酒醅真菌群落组成的影响
基于样品中微生物基因序列,将相对丰度大于10%的微生物定义为绝对优势微生物属,相对丰度大于1%的微生物定义为优势属,选取Top 20作属水平上物种相对丰度柱形图。如图4所示,酒醅中优势真菌属为毕赤酵母属(Pichia)、嗜热子囊属(Thermoascus)、踝节菌属(Rasamsonia)、丝衣霉属(Byssochlamys)、嗜热真菌属(Thermomyces)和曲霉属(Aspergillus)。
图4 酒醅中真菌属水平相对丰度
Fig.4 Relative abundance of fungal genera in fermented grains
毕赤酵母属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为71.18%、44.31%、74.19%、49.94%;在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为35.25%、6.70%、10.86%、9.24%。与CK相比,堆积阶段中菌剂L21、L21+BE1组酒醅毕赤酵母属相对丰度显著下降;窖池阶段,菌剂L21、BE1及L21+BE1组酒醅毕赤酵母属的相对丰度均显著下降。毕赤酵母属具有良好的耐受性,产生多种酯类物质,能够提升酒体果香和花香[17]。毕赤酵母属在发酵过程中产生乙酸,其丰度降低可能是菌剂组酒醅中乙酸含量降低的原因之一。嗜热子囊属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为1.57%、5.79%、1.38%、3.53%;在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为8.18%、13.06%、7.35%、15.45%。与CK相比,嗜热子囊属的相对丰度在堆积和窖池发酵结束的L21和L21+BE1菌剂组酒醅中显著增加,嗜热子囊属能产生淀粉酶,加速淀粉糖化,这可能是菌剂组发酵结束还原糖含量增加的原因。嗜热真菌属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为3.01%、6.52%、1.80%、3.57%;在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为1.50%、5.28%、1.84%、6.01%。与CK相比,嗜热真菌属在堆积和窖池发酵结束的L21菌剂组和窖池发酵结束的L21+BE1菌剂组酒醅中显著增加。嗜热真菌属、嗜热子囊菌属是酱香型白酒发酵过程的优势真菌,是酒醅发酵及白酒风味物质形成的重要菌属。嗜热真菌属能产生高活力且耐热的纤维素酶、蛋白酶等,促进微生物的生长繁殖及白酒酿造产香[18]。
与CK相比,单一菌剂BE1的添加对真菌丰度影响较小,菌剂BE1的添加主要影响堆积阶段的毕赤酵母属。菌剂L21和L21+BE1的添加对真菌丰度的影响较大,主要影响堆积阶段的毕赤酵母属、嗜热子囊属、嗜热真菌属、丝衣霉属和窖池阶段的毕赤酵母属、嗜热子囊属,特别是对于窖池阶段的毕赤酵母属相对丰度影响较大。
2.4.2 添加不同菌剂对酒醅细菌群落组成的影响
在属水平上对酒醅细菌组成进行分析,结果如图5所示,酒醅中优势细菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、罗伊氏乳杆菌属(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和片球菌属(Pediococcus)。
图5 酒醅中细菌属水平相对丰度
Fig.5 Relative abundance of bacterial genera in fermented grains
芽孢杆菌属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为8.11%、38.61%、8.92%、25.42%;在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为0.15%、4.61%、0.08%、1.14%。与CK相比,芽孢杆菌属的相对丰度在堆积和窖池发酵结束的L21和L21+BE1菌剂组酒醅中显著增加。芽孢杆菌属能够产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶来水解原料,形成丰富的发酵前体物质,如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等发酵能生成如吡嗪类、酸类、芳香类等风味物质,为酱香型白酒赋予了独特风格[19]。乳杆菌属在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为98.06%、71.30%、86.47%、84.50%。与CK相比,乳杆菌属的相对丰度在窖池发酵结束的L21、BE1、L21+BE1菌剂组酒醅中均显著下降。乳酪杆菌属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为0.07%、41.76%、0.06%、42.94%;在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为0.01%、4.92%、0.01%、5.61%。与CK相比,乳酪杆菌属的相对丰度在堆积和窖池发酵结束的L21与L21+BE1菌剂组酒醅中显著上升。菌剂L21的添加使酒醅中乳酪杆菌属相对丰度显著增加,菌剂BE1的添加对乳酪杆菌属的相对丰度无显著影响。乳酪杆菌属是目前最广泛应用的益生菌属,其中代表菌株包括鼠李糖乳酪杆菌GG等[20],其中鼠李糖乳酪杆菌具有产酸、肠道增殖、耐酸与耐胆盐的良好性能。鼠李糖乳酪杆菌是同型乳酸发酵,只产生乳酸,强化后其在堆积发酵末期占据优势地位,挤占了其他异型菌生态位,这可能也是菌剂组乙酸含量降低的原因之一。罗伊氏乳杆菌属在堆积发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为51.84%、3.09%、64.33%、8.09%,在窖池发酵结束的CK、L21、BE1、L21+BE1酒醅中相对丰度分别为0.37%、0.08%、7.49%、0.31%。与CK相比,罗伊氏乳杆菌属的相对丰度在堆积和窖池发酵结束的菌剂BE1酒醅中显著升高,在菌剂L21与L21+BE1酒醅中显著降低,这可能与乳酪杆菌属相对丰度大幅增高,微生物间竞争有限资源和营养物质有关。
菌剂L21、BE1、L21+BE1的添加对堆积阶段酒醅的芽孢杆菌属、乳酪杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、片球菌属、不动杆菌属和窖池阶段酒醅的乳杆菌属、芽孢杆菌属、乳酪杆菌属、枝芽孢杆菌属、不动杆菌属的影响较大。
2.5 PICRUSt2分析不同菌剂酒醅中微生物的代谢差异
为深入探究不同菌剂的添加对酒醅发酵体系中高级醇、乙酸及丙酸代谢的影响机制,本研究采用KEGG数据库对微生物群落功能谱进行代谢通路预测,并进一步结合PICRUSt2生物信息学工具,对编码关键代谢酶的基因丰度变化进行分析。
2.5.1 不同菌剂酒醅中微生物高级醇代谢差异分析
经2.2节对正丙醇分析发现,窖池发酵阶段是正丙醇含量增加的主要时期,且菌剂的添加使酒醅中正丙醇含量显著下降。根据KEGG数据库对关键酶的索引,使用PICRUSt2工具,结合对正丙醇合成的研究推测窖池发酵过程中正丙醇合成通路如图6-a所示。正丙醇的生物合成主要通过2条代谢途径实现:苏氨酸代谢途径和丙酸代谢途径[21]。在苏氨酸代谢途径中,苏氨酸解氨酶[EC:4.3.1.19]首先催化L-苏氨酸脱氨生成2-酮丁酸。随后,该中间产物通过磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]和2-氧代异戊酸脱氢酶[EC:1.2.4.4]的连续作用转化为丙酰辅酶A。最终,丙酮酸脱羧酶[EC:4.1.1.1]和醇脱氢酶[EC:1.1.1.1]协同催化脱羧-还原反应,完成正丙醇的生物合成。丙酸代谢途径则起始于丙酮醛的还原反应,由甲基乙二醛还原酶[EC:1.1.1.283]催化生成L-乳醛。随后,乳醛还原酶[EC:1.1.1.77]将L-乳醛转化为1,2-丙二醇。该二醇化合物经丙二醇脱水酶[EC:4.2.1.28]作用脱水形成丙醛,最终由1,3-丙二醇脱氢酶[EC:1.1.1.202]催化还原生成终产物正丙醇。
a-正丙醇合成通路;b-EC:1.1.1.202丰度;c- EC:2.3.1.8丰度;d- EC:1.1.1.1丰度
图6 窖池发酵正丙醇代谢途径及关键酶丰度
Fig.6 Metabolic pathways of n-propanol and the abundance of the key enzymes during pit fermentation
如图6所示,物种贡献分析表明,窖池时期正丙醇合成的主要贡献细菌属有乳杆菌属、枝芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、乳酪杆菌属、不动杆菌属。
如图6-b～图6-d所示,对窖池发酵结束不同菌剂组酒醅中细菌对正丙醇合成途径的贡献进行了分析,关注正丙醇合成关键酶的丰度变化。正丙醇合成的关键酶磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]和醇脱氢酶[EC:1.1.1.1]的丰度显著高于1,3-丙二醇脱氢酶[EC:1.1.1.202],说明苏氨酸代谢途径是主要的代谢途径。
对磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]和醇脱氢酶[EC:1.1.1.1]的丰度进行分析,发现与CK相比,L21和L21+BE1菌剂组中乙酰转移酶和醇脱氢酶的丰度显著降低,BE1菌剂组乙酰转移酶的丰度显著降低,菌剂组正丙醇合成受限,其含量降低,其中乳杆菌属是主要贡献菌属。
综上,L21、L21+BE1菌剂通过降低磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]和醇脱氢酶[EC:1.1.1.1]丰度,调控苏氨酸代谢途径,抑制正丙醇合成。BE1菌剂通过降低磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]丰度,调控2-酮丁酸生成丙酰辅酶A过程,抑制正丙醇合成。菌剂组细菌对生成正丙醇的关键酶丰度显著降低,最终使菌剂组发酵结束正丙醇含量显著降低。
2.5.2 不同菌剂酒醅中微生物乙酸代谢差异分析
经2.3节对乙酸分析发现,窖池发酵时期是乙酸合成的关键时期,且菌剂的添加使酒醅中乙酸的含量显著下降。根据KEGG数据库对关键酶的索引,使用PICRUSt2工具,结合对乙酸合成的研究推测窖池发酵过程中乙酸合成通路如图7-a所示。淀粉经糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸[22],丙酮酸可以通过丙酮酸氧化酶[EC:1.2.3.3]催化生成乙酰磷酸,再经乙酸激酶[EC:2.7.2.1]和酰基磷酸酶[EC:3.6.1.7]催化生成乙酸。
a-乙酸合成通路;b-EC:2.7.2.1丰度;c-EC:3.6.1.7丰度
图7 窖池发酵乙酸代谢途径及关键酶丰度
Fig.7 Metabolic pathways of acetate and the abundance of key enzymes during pit fermentation
如图7所示,物种贡献分析表明,窖池时期乙酸合成的主要贡献细菌属有乳杆菌属、枝芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、乳酪杆菌属、气单胞菌属(Aeromonas)、未分类乳杆菌菌属(unclassified_Lactobacillaceae)。
对窖池发酵结束不同菌剂组酒醅细菌对乙酸合成途径的贡献进行了分析,关注乙酸合成关键酶的丰度变化,如图7-b和图7-c所示。与CK相比,L21、BE1、L21+BE1菌剂组细菌对乙酸激酶[EC:2.7.2.1]和酰基磷酸酶[EC:3.6.1.7]的丰度显著降低,其中乳杆菌属是主要贡献者。乙酸激酶[EC:2.7.2.1]和酰基磷酸酶[EC:3.6.1.7]的丰度显著降低,这2种酶催化丙酮酸生成乙酸,乙酸合成受限,最终酒醅中乙酸含量显著降低。
综上所述,L21、BE1和L21+BE1菌剂通过降低细菌对乙酸激酶[EC:2.7.2.1]和酰基磷酸酶[EC:3.6.1.7]的丰度,调控乙酰磷酸生成乙酸过程,从而降低乙酸含量。
2.5.3 不同菌剂酒醅中微生物丙酸代谢差异分析
经2.3节对丙酸分析发现,堆积发酵时期是丙酸升高的关键时期,菌剂的添加使酒醅中丙酸的含量显著下降。根据KEGG数据库对关键酶的索引,使用PICRUSt2工具,结合对丙酸合成的研究确定了堆积发酵时期产丙酸的代谢途径如图8-a所示。淀粉经过糖酵解途径是将葡萄糖转化为丙酮酸,丙酮酸经过丁酰辅酶A脱氢酶[EC:1.3.8.1]转化为丙酰辅酶A,再经磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]为丙酰磷酸酯,最后经关键酶乙酸激酶[EC:2.7.2.1]转化为丙酸,丙酸可以经乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]转化为丙酰基腺苷酸[23]。
a-丙酸代谢途径;b-EC:2.3.1.8丰度;c-EC:2.7.2.1丰度;d-EC:6.2.1.1和EC:6.2.1.17丰度;e-EC:2.7.2.1丰度;f-EC:6.2.1.1和EC:6.2.1.17丰度
图8 堆积发酵丙酸代谢途径及关键酶丰度
Fig.8 Metabolic pathways of propionate and the abundance of key enzymes during heap fermentation
注:图8-b～图8-d为细菌贡献分析;图8-e、图8-f为真菌贡献分析。
如图8所示,物种贡献分析表明,堆积时期丙酸代谢的主要贡献细菌属有乳杆菌属、枝芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、乳酪杆菌属,真菌属有毕赤酵母属、蝶形担孢酵母属(Papiliotrema)、踝节菌属、嗜热子囊属、嗜热真菌属、红曲霉属(Monascus)、未分类的曲霉属(unclassified_Aspergillaceae)。
对堆积发酵结束不同菌剂组酒醅细菌对丙酸代谢途径的贡献进行了分析,关注丙酸代谢关键酶的丰度变化,如图8-b～图8-d所示。丙酸代谢的主要贡献细菌属有罗伊氏乳杆菌属、片球菌属和芽孢杆菌属。磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]和乙酸激酶[EC:2.7.2.1]是丙酸合成的关键酶,乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]是丙酸消耗的关键酶。与CK相比,L21、L21+BE1菌剂组磷酸乙酰转移酶的丰度显著下降,乙酰辅酶A合成酶和丙酰辅酶A合成酶的丰度显著上升,BE1菌剂组磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶的丰度显著下降,丙酸合成受限,消耗增加,酒醅中其含量下降。
对堆积发酵结束不同菌剂组酒醅真菌对丙酸代谢途径的贡献进行了分析,关注丙酸代谢关键酶的丰度变化,如图8-e和图8-f所示。丙酸代谢的主要贡献真菌属有毕赤酵母属和蝶孔酵母属。乙酸激酶[EC:2.7.2.1]是丙酸合成的关键酶,乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]是丙酸消耗的关键酶。与CK相比,L21和L21+BE1菌剂组乙酸激酶的丰度显著下降,乙酰辅酶A合成酶和丙酰辅酶A合成酶的丰度显著上升。BE1菌剂组乙酰辅酶A合成酶和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]的丰度显著上升,丙酸合成受限,消耗增加,酒醅中其含量降低。
综上所述,细菌丙酸代谢差异分析表明,菌剂L21、L21+BE1降低丙酸,一方面通过降低磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]丰度,调控丙酰辅酶A转化为丙酰磷酸酯,其中罗伊氏乳杆菌属和片球菌属是主要贡献菌属;另一方面,通过升高乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]丰度,调控丙酸生成丙酰基腺苷酸,丙酸消耗量增加,其中芽孢杆菌属是主要贡献菌属。菌剂BE1降低丙酸含量,一方面通过降低磷酸乙酰转移酶[EC:2.3.1.8]丰度,调控丙酰辅酶A转化为丙酰磷酸酯;另一方面,BE1菌剂通过降低乙酸激酶[EC:2.7.2.1]丰度,调控丙酰磷酸酯生成丙酸。其中片球菌属是这2种关键酶丰度显著下降的主要贡献菌属。
真菌丙酸代谢差异分析表明,菌剂L21、L21+BE1降低丙酸,一方面通过降低乙酸激酶[EC:2.7.2.1]丰度,调控丙酰磷酸酯生成丙酸,毕赤酵母属是主要贡献菌属;一方面通过增加乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]丰度,调控丙酸生成丙酰基腺苷酸,消耗丙酸增加,蝶孔酵母属是主要贡献菌属。菌剂BE1通过增加乙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.1]和丙酰辅酶A合成酶[EC:6.2.1.17]丰度,调控丙酸生成丙酰基腺苷酸,消耗丙酸增加,毕赤酵母属是主要贡献菌属。
真菌和细菌共同影响丙酸代谢关键酶的丰度,酒醅中丙酸含量降低。在以往的研究中多考虑细菌对丙酸的影响,本研究发现真菌在丙酸消耗方面有重要作用,真菌对乙酰辅酶A合成酶和丙酰辅酶A合成酶丰度显著上升,可能是L21+BE1菌剂组丙酸含量显著低于其他组的重要原因。
3 结论
本研究对添加了单一L21、BE1和复合L21+BE1菌剂酒醅的理化指标、风味物质进行了监测分析,主要研究了酒醅中总酸、有机酸和高级醇含量。对添加不同菌剂酒醅微生物群落进行了差异分析,确定了发酵过程中优势真菌属和优势细菌属,分析了菌剂的添加对酒醅微生物组成的影响,发现菌剂的添加主要影响堆积阶段微生物组成,且极大地影响了毕赤酵母属的丰度。复合菌剂L21+BE1具有显著降低总酸、乙酸和高级醇含量方面的优良性能,且降丙酸含量效果比单一菌剂优异。利用PICRUSt2工具分析了菌剂的应用对酒醅微生物正丙醇、乙酸和丙酸的代谢差异及主要贡献菌属,发现虽然不同菌剂在降正丙醇和乙酸含量效果上无显著差异,但不同菌剂对代谢关键酶的丰度影响不同。
本研究为微生物复合菌剂在白酒中的应用提供了数据支撑,为解决酱香型白酒酒醅在发酵过程中酸高和高级醇含量过高的生产共性难题提供了新思路。本研究对菌剂抑制酒醅中有机酸和高级醇合成机制进行了解析,为后续机制的研究提供理论依据。同时创新性地揭示了真菌在丙酸代谢中的重要作用,提出了除细菌外,真菌同样是酒醅中丙酸消耗的关键微生物类群。这一发现为通过定向调控真菌群落结构降低酒醅丙酸含量提供了新的理论依据和技术路径。
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