随着全球能源需求增长与环境保护意识提升,将有机废弃物高效转化为可再生能源成为研究热点。厌氧消化(anaerobic digestion,AD)作为绿色技术,可通过微生物群落将有机废弃物转化为甲烷,但传统AD存在电子传递效率低、中间产物积累(如挥发性脂肪酸)等问题,限制了甲烷产率与处理效能[1]。
近年来,电催化技术与AD的融合为破解这些难题提供了新路径。在电催化厌氧消化(electrocatalytic anaerobic digestion,EAD)系统中,向反应器中引入外部电场或加入电极材料可强化微生物代谢的电子传递过程,加速有机物分解与甲烷产生[2-4]。其中,电催化产甲烷通过阴极直接还原CO2为CH4,或通过阳极氧化有机物释放电子驱动底物降解和产甲烷过程,以显著提升能量转化效率[5-7]。反应机理研究表明,电催化系统可通过2种途径强化甲烷生成:a)直接种间电子传递(direct interspecies electron transfer,DIET),电活性产甲烷菌与电活性产酸菌,如甲烷丝菌(Methanothrix)与地杆菌(Geobacter),通过细胞表面的细胞色素、导电菌毛或外部导电材料直接交换电子,无需氢气或甲酸等可溶性介体;b)间接种间电子传递(mediated interspecies electron transfer,MIET),即微生物依赖氢气、甲酸等可溶性电子载体完成电子转移。二者都受到电子传递效率的影响[8-9]。因此,当前EAD的研究聚焦于通过电极材料设计或外电场调控,优化微生物与电极间的电子传递机制。基于这些机理,具有电子传递能力的导电纳米材料的引入有望进一步突破电子传递瓶颈,为系统性能优化提供新思路。吴彤彤等[10]将纳米Fe2O3用于餐厨垃圾厌氧消化,纳米Fe2O3在促进甲烷产量上升的同时还能起到缓冲体系pH值的作用。WEI等[11]利用污泥合成污泥基铁碳复合介质,发现污泥基铁碳复合介质可以增加AD耦合微生物电解池体系中沼液的降解和甲烷的产生。
多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)作为导电纳米材料的典型代表,具有高比表面积、明确的导电性能、稳定化学结构及适中的材料成本特征。其纳米管状结构可作为“电子导线”促进微生物的直接种间电子转移DIET,同时通过吸附作用减少抑制性物质的抑制作用。CAVALEIRO等[12]、ZHENG等[13]发现MWCNTs在AD过程中能通过DIET使得产电微生物和产甲烷菌之间直接交换电子促进甲烷生成。然而,现有研究对MWCNTs在外加电场存在下的EAD中调控产甲烷菌群落结构及电子传递路径的机制尚不明确,尤其缺乏对电活性产甲烷菌[如甲烷八叠球菌(Methanosarcina)]响应行为的深入探究。
本研究基于MWCNTs的纳米导线特性,将其引入EAD体系。研究MWCNTs对电催化厌氧消化过程的辅助效果及辅助机理。通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和微生物分析,研究MWCNTs与关键的电活性产甲烷菌之间的关系及其对不同代谢途径的产甲烷菌的辅助驯化作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
EAD反应器依靠AD反应器污泥启动,污泥取自本团队自行研制的已连续稳定运行4年的全混式厌氧消化反应器(continuous stirred tank reactor,CSTR)。该反应器内容量为100 L,发酵类型为中温厌氧发酵,运行温度为(37.5±0.5) ℃。接种污泥的pH值为7.93,总固体(total solids,TS)含量为9.0%,挥发性固体(volatile solids,VS)含量为5.2%。污泥从反应器中取出后通过40目筛网过滤,取3.7 L接种于本团队自行研制的EAD反应器内,并以4 d为1个批次在1.20 V电压下对微生物进行驯化。
实验所用的MWCNTs购自中国深圳穗衡石墨烯科技有限公司。所用MWCNTs呈黑色粉末状,通过化学气相沉积法制备,纯度达95%,尺寸如下:内径3～5 nm,外径8～15 nm,长度2 000～3 000 nm。
1.2 仪器与设备
BIOTECH-3BG-7000A自动发酵罐,上海汇和堂生物有限公司;GC-17A气相色谱,日本岛津有限公司;SUP-5022 pH值传感器,德国JUMO公司;Clarus 590 GC气相色谱,珀金埃尔默仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 实验设计
实验中使用质量分数为50%的乙酸水溶液为唯一底物,通过蠕动泵进行投料,控制最低pH值不低于5.8。具体的起始底物质量浓度和MWCNTs投加量见表1。A、B阶段均进行时长24 d(共6批次,间隔4 d投料1次,A1～A6/B1～B6)的持续发酵,C阶段进行时长30 d(共6批次,间隔5 d投料1次,C1～C6)的持续发酵。选取A、B、C 3个阶段最后稳定的2批次数据进行对比与分析。
表1 多壁碳纳米管辅助电催化厌氧消化实验设计
Table 1 Experimental design of electrocatalytic anaerobic digestion assisted by multi walled carbon nanotubes
实验阶段MWCNTs投加量/(g/L)批次发酵时间/d投加底物起始底物质量浓度/(mg/L)有效发酵容积/LA04乙酸6 7573.7B0.54乙酸6 7573.7C0.55乙酸8 1083.7
注:A阶段6个批次分别为A1、A2、A3、A4、A5、A6;B阶段6个批次分别为B1、B2、B3、B4、B5、B6;C阶段6个批次分别为C1、C2、C3、C4、C5、C6。
1.3.2 实验装置
实验所用的4 L反应器如图1所示,系利用自动发酵罐改装设计而成。通过对发酵罐顶部的接口进行重新设计规划,将pH值传感器、碳纤维阴极和碳纤维阳极等增设在玻璃发酵罐顶部。
1-厌氧发酵罐;2-出气管;3-进出料管;4-搅拌器;5-pH值传感器;6-温度传感器;7-碳纤维刷阳极;8-碳纤维刷阴极;9-温度控制夹套;10-循环水调温器;11-循环水瓶;12-可编程电极;13-干燥滤管;14-沼气收集袋;15-蠕动泵;16-进出料瓶。
图1 电催化厌氧消化实验装置
Fig.1 The experimental device for the electro-catalytic anaerobic digestion
运行条件如下:温度37.5 ℃,外加电压1.20 V,搅拌转速120 r/min。pH值通过传感器获取数据并存储至上位机内,通过气体收集袋收集产气以用于后续检测沼气总量和甲烷含量。电极尺寸参数如下:刷毛直径3 cm,刷毛长度10 cm,总长12 cm;电极间距12 cm。
1.3.3 分析方法
甲烷含量测定:采用 GC-17A 气相色谱仪测定样品中甲烷峰面积,比对甲烷的标准曲线计算实际样品中甲烷的含量,即甲烷的体积分数。分析系统由PEG-20M固定相毛细管色谱柱(30 m×0.53 mm×0.5 μm)和氢火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)组成,柱温为60 ℃,进样口温度150 ℃,检测器温度200 ℃,手动进样量为8 μL,载气为高纯氮气。
产沼气量测定:沼气由气体采样袋收集,每2 h更换一次,产气量通过排水集气法测定。
pH值测定:通过反应罐顶部的pH值传感器实时监测,监测数据实时传导至控制面板。
TS含量测定:称取10 g样品,于105 ℃烘干2 h,通过烘干前后的质量差测定TS。
VS含量测定:将已烘干的样品,于600 ℃灼烧2 h,通过灼烧前后的质量差测定VS。
挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)含量测定:以投料开始为0 h,每24 h用离心管收集5 mL沼液,在通过转速8 000 r/min、时长10 min的离心处理后,取1 mL上清液于10 mL容量瓶中,加入超纯水配制为混合液,在经过膜直径13 mm、膜孔径0.45 μm的过滤膜过滤2次后,加入0.325 mL色谱纯甲酸混匀酸化,制成待测液后移入1.5 mL进样瓶,通过Clarus 590 GC气相色谱仪测定样品各组分峰面积,比对挥发性脂肪酸的标准曲线计算实际样品中乙酸、丙酸等挥发性脂肪酸的含量。
宏基因组微生物分类测序:由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,通过使用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒完成DNA提取,通过对第一轮:340F、1000R,第二轮:349F、806R进行扩增完成PCR扩增步,文库质控及混样步骤使用Qubit3.0荧光定量仪进行文库浓度测定。
SEM表征由广西南宁国拓生物科技有限公司完成。经过以下处理获得SEM照片:离心收集样品后用PBS漂洗,之后加SEM固定液室温避光固定2 h。固定后首先经过0.1 mol/L磷酸缓冲液PB(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min。其次经过1%(质量分数)的锇酸0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)室温(20 ℃)固定1～2 h。最后0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min。将样品依次体积分数为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精中,每次15 min进行梯度脱水,再浸入V(酒精)∶V(乙酸异戊酯)=1∶1的混合液中15 min,最后转入纯乙酸异戊酯15 min。脱水后使用临界点干燥仪对样品进行干燥。最后将样本置于导电碳膜双面胶上进行喷金30 s。
2 结果与分析
2.1 MWCNTs-EAD系统的底物缓释效应
沼液系统是一种由厌氧微生物和溶解或悬浮的化合物组成的复杂多相系统。MWCNTs作为一种纳米导线,其具有纳米尺度的管壁外内径所形成的管状结构,这就使得复杂系统中的小分子物质可以通过扩散作用占据甚至充满MWCNTs的内腔,大分子物质及微生物则被阻挡在MWCNTs外侧。由于MWCNTs管内壁的纳米作用,扩散进入管内的小分子向外输运将遇到阻力,导致其参与的后续EAD生化过程受到动力学阻力[14-15]。在MWCNTs-EAD系统中,乙酸的质量浓度变化、乙酸单日分解率变化如图2所示。
a-乙酸质量浓度;b-乙酸单日分解率
图2 乙酸降解过程的影响因素分析
Fig.2 Analysis of factors influencing the acetate degradation process
A、B、C批次的生化产气阶段乙酸浓度变化对比见图2-a,投加MWCNTs后乙酸浓度下降速率明显降低,与A批次相比,B批次完全降解乙酸的时间由72 h(3 d)延长至96 h(4 d),而在增加投加乙酸浓度后这种影响带来的差异更加显著,C批次完全降解乙酸的时间延长至120 h(5 d)。结合图2-a、图2-b,无MWCNTs的A批次1 d时的乙酸降解率为53%(A5)、56%(A6)、并在2 d时乙酸累计降解率均达到了98%,而投加MWCNTs的B、C批次1 d时的乙酸降解率分别为30%(B5)、37%(B6)、25%(C5)、21%(C6),在2 d时的乙酸累计降解率仅达到59%(B5)、64%(B6)、51%(C5)、46%(C6),导致B批次在3 d时达到99%的乙酸累计降解率,而C批次需要5 d的时间才能达到99%的乙酸累计降解率。由此可见,MWCNTs的吸附作用延缓乙酸降解,致使批次前期乙酸降解率降低,从而导致乙酸分解的时间延长。
此外,根据图2-b对比B、C组可以发现,乙酸首日降解率由B批次的30%(B5)、37%(B6)降低至C批次的25%(C5)、21%(C6),而4 d时的乙酸降解率由B批次的8%(B5)、4%(B6)升至C批次的23%(C5)、29%(C6)。表明随着乙酸投入量增加,其降解速率进一步被放缓,使乙酸底物在整个批次中存续,以至于最后一天仍可支持产甲烷菌的代谢活动。
随着反应的进行,pH值的回升会受到两方面影响:一方面,产生甲烷时消耗大量H+会使pH值上升;另一方面,被吸附的乙酸分子的缓慢释放会使pH值下降。这种由缓释导致的pH值下降是常规EAD体系中所没有的。通过对比图3中pH值斜率的变化可以看出,A批次在40 h时pH值已达到7.9,此后pH值保持稳定,而B批次由于投加MWCNTs,进入纳米管芯的乙酸分子参与后续的生化反应受到动力学阻碍,pH值在70 h方才达到7.9,原因是缓释导致的回升速率下降,因此达到最大pH值的时间相对延后。图3同样投加量MWCNTs的C批次中,随着乙酸底物的投加量增加,pH值回升速率的减缓愈加明显。进一步验证了MWCNTs投加后的小分子吸附-缓释效果。
图3 pH值变化图
Fig.3 pH value change chart
实验表明,MWCNTs的投加对乙酸降解速率和pH值变化产生影响。投加MWCNTs后会使首日乙酸降解率从54.5%下降至33.5%,同时分解时间由2 d延长至4 d,使产气时长延长。在投加更多乙酸的条件下,乙酸首日降解率继续下降至23%,进一步扩大MWCNTs的小分子吸附-缓释效应的影响。此外,MWCNTs的缓释作用导致pH值回升速率降低,导致与A批次相同底物质量浓度的B批次达到最大pH值的时间推迟约30 h。
2.2 投加MWCNTs对产甲烷的促进作用
2.2.1 MWCNTs对EAD过程产沼气和产甲烷的影响
实验中,通过对比未投加MWCNTs的批次和投加MWCNTs的批次,研究MWCNTs对底物缓释及产甲烷效果的影响。实验条件与结果如表2、图4所示。
表2 投加MWCNTs前后累积产沼气量与累积产甲烷量
Table 2 Cumulative biogas production and cumulative methane production before and after MWCNTs addition
批次底物质量浓度/(mg/L)是否投加MWCNTs产沼气量/L产甲烷量/L单位底物产甲烷量/(mg/L)单位时间内甲烷含量峰值/%单位时间内甲烷含量达到80%的采样时间/hA56 757否19.489.190.378236±1A66 757否19.579.170.378236±1B56 757是20.009.390.388546±1B66 757是20.059.750.398648±1
不同批次在发酵过程中日产沼气量和日产甲烷量的变化情况如图4-a、图4-b所示。通过柱状图对比可以发现,相同底物质量浓度的A、B批次,A5的日产沼气量峰值区间为1 d,而B6的日产沼气量期峰值时间为2 d,相较延后了1 d,单位时间内甲烷含量达到80%的采样时间从36 h延后至48 h,这印证了MWCNTs投加后的缓释作用。虽然在缓释作用下B6的日产沼气量和日产甲烷量趋于平缓,但由于缓释作用有效延长了产甲烷的时长,能有效地将沼气中的CO2转化为CH4,使单位时间内甲烷含量峰值从82%上升至86%,甲烷产量从9.19 L增加至9.75 L。
这一现象表明,虽然在投加MWCNTs的EAD体系中部分乙酸分子会因为MWCNTs的中空管腔通过纳米吸附作用被截留于纳米管芯,使其扩散至沼液并参与微生物生化代谢的路径延长,使得微生物代谢乙酸分子受到阻碍,表现为乙酸降解速率下降、产甲烷时间延后,但又能通过MWCNTs的导电介质特性有效地促进微生物与电极、微生物与微生物之间的电子交换,从而促进产甲烷过程,其表现为单位时间内甲烷含量峰值得到提升、产甲烷量增加,体现了显著的产甲烷动力学差异。
2.2.2 MWCNTs对产甲烷过程动力学特征的影响
为量化上述产甲烷过程的动力学特征及了解其变化规律,采用Logistic模型对A5和B6批次的累积甲烷产量进行拟合,结果如图5及表3所示。
图5 投加MWCNTs的EAD过程累积甲烷产量的Logistic拟合曲线
Fig.5 Logistic fitting diagram of cumulative methane production in MWCNTs
表3 MWCNTs体系累积甲烷产量Logistic拟合参数表
Table 3 Logistic fitting parameters of cumulative methane production with MWCNTs
指标A5B6A1/L1.288 591.662 43A2/L9.289 2910.816 63x0/L32.171 2143.786 86p6.701 073.126 99R20.999 060.996 75
对产甲烷量进行非线性曲线拟合的方程见公式(1),各批次拟合的决定系数R2均大于0.999,表明模型与实测数据吻合度极高,可准确反映产甲烷动力学特征:
(1)
式中:A1,产甲烷量的基线值,对应初始累积产甲烷量,L;A2,产甲烷量的理论终点值,反映系统最终产甲烷潜力,L;x0,基线值与理论终点值中点[(A2-A1)/2]的横坐标值,表征产甲烷速率峰值出现的时间[16],h;p,与曲线斜率相关的参数,体现产甲烷速率的变化梯度。
图5和表3结果体现了MWCNTs投加对EAD产甲烷过程的影响。首先,投加MWCNTs致使累积甲烷总产量提升(A2增大)。B6批次的A2(10.816 63)高于未投加MWCNTs的A5批次,对应累积产甲烷量增加6%,单位底物产甲烷量从0.37 mL/mg升至0.39 mL/mg。这得益于MWCNTs优化了电子传递路径:通过“纳米导线”网络促进DIET,增强了Methanosarcina等电活性菌的代谢活性,提升了底物转化效率。
其次,产甲烷峰值时间延后(x0增大)。A5批次在32.171 21 h达到产甲烷速率的峰值,而B6批次的峰值延后至43.786 86 h,其延后幅度达36.1%。与MWCNTs的乙酸吸附-缓释效应直接相关:MWCNTs的中空管芯截留乙酸分子并使其被缓慢释放,导致微生物代谢底物的时间延长,产甲烷过程被延缓。
第三,产甲烷速率变缓(p减小)。A5的p值为6.701 07,对应曲线陡峭,表明产甲烷速率在前期呈快速上升趋势;B6的p值降至3.126 99,曲线趋于平缓,说明其产甲烷速率在整个周期内分布更为均匀。这是由于MWCNTs通过延缓底物分解(乙酸平均降解率从54.5%降至33.5%),避免了底物的集中消耗,使产甲烷菌代谢更持续。
第四,产甲烷周期延长。A5因底物快速耗尽在48 h后停止产甲烷,而B6得益于MWCNTs的底物缓释,产甲烷时长延长至72 h,这与Logistic拟合中x0延后、p值减小的趋势一致(表3)。这是因为乙酸小分子的缓释使体系产甲烷的过程被同步延缓。
2.3 投加MWCNTs对产甲烷菌的再驯化
2.3.1 投加MWCNTs对产甲烷菌相对丰度的影响
加入电催化前后及投加MWCNTs前后反应器污泥的微生物基因测序结果如图6所示。
a-加入电催化前后产甲烷菌相对丰度变化;b-投加MWCNTs前后产甲烷菌相对丰度变化
图6 产甲烷菌的相对丰度变化图
Fig.6 Variation diagram of relative abundance of Methanogenic archaea
对比AD与EAD体系中Methanosarcina的种群丰度[5]可知,在未引入电催化的AD体系中,由于Methanosarcina对乙酸的亲和力更高,即具有较低的半饱和常数(Ks)和较低的最大比生长速率(μmax)[17]。Methanosarcina在AD体系中的相对丰度显著高于EAD体系。在EAD体系中,因为Methanothrix/Methanosaeta能够更有效地与电活性细菌形成DIET共生体,在H2或甲酸盐的介导模式之外,增加了直接从电子供体(如产乙酸菌或电极)接收电子的方式,提高其物种的竞争优势,相对丰度进一步上升[18-20],使得Methanosarcina的竞争优势被削弱,其相对丰度急剧下降至仅0.10%。
在此基础上,投加MWCNTs并进行数个批次试验后,几乎消失的Methanosarcina重新恢复活力,其相对丰度从投加前的0.10%增长至投加后的6.79%。这一变化的原因可能与MWCNTs的纳米电子导线性质密切相关。研究表明,Methanosarcina可通过DIET途径,即直接接收来自产电微生物的电子来还原二氧化碳或乙酸根,从而增强甲烷生成效率[21],而MWCNTs的引入恰好为其提供了新的电子传递可能方案,例如,协助Methanosarcina在与电极或与其他产电菌之间建立电子转移路径,使其在电催化环境中重新获得代谢活性和竞争优势。
2.3.2 EAD过程中产甲烷菌与MWCNTs的联结
投加MWCNTs前后污泥的SEM结果如图7所示。对比发现发现,添加MWCNTs之后,产甲烷菌与MWCNTs之间形成明确联结,进一步印证了上述机理。
a～b-未投加MWCNTs的污泥(5 000×、15 000×);c- 投加MWCNTs的污泥(5 000×)及局部放大细节(15 000×);d- 投加MWCNTs的污泥(10 000×);e-投加MWCNTs的污泥(15 000×)及局部放大细节(45 000×)
图7 是否投加MWCNTs污泥的SEM图像对比
Fig.7 SEM image comparison of sludge with and without MWCNTs addition
图7中分别为未投加MWCNTs的污泥和投加MWCNTs的污泥在不同放大倍率下的扫描电镜图片。在5 000×放大倍率下(图7-a、图7-c),投加MWCNTs的SEM图中可以明显看见有极细的丝状物体出现在微生物周围,而未投加MWCNTs的SEM图中则没有发现,此时再对比中等放大倍率下(图7-b、图7-b、图7-d)可以更加清晰地发现MWCNTs穿过或缠绕在微生物上或被包裹在微生物中,45 000×放大倍率下(图7-e)体现MWCNTs穿过了Methanosarcina,这也证明了微生物可以利用MWCNTs互相连接。而且图7-e可以清晰的看到,MWCNTs与微生物的大小差距极大,可以肉眼区分MWCNTs与微生物。
实验发现,Methanosarcina的恢复与MWCNTs的辅助作用有关,MWCNTs的引入为Methanosarcina等短鞭毛菌种提供了独特的电子传递路径。这类微生物可通过2种方式利用MWCNTs建立导电连接:a)胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)包裹。通过分泌胞外聚合物包裹MWCNTs的一端,形成“微生物-碳纳米管”复合结构(图7-d);b)细胞直接锚定。通过直接夹持作用将MWCNTs定位于细胞间间隙或细胞膜表面,利用MWCNTs的中空管状结构和高导电性,构建微生物与微生物、微生物与电极之间的“纳米导线”网络,见图7-c和图7-e。这2种连接方式使MWCNTs作为导电桥梁,成为胞外电子传递的介导,突破了传统DIET中依赖细胞直接接触或菌毛作为电子线进行电子传递的限制,提升了电子传递效率,促进了微生物之间电子转移。也通过MWCNTs作为电极与微生物的连接媒介,缩短了电子从电极到产甲烷菌的传递距离,尤其促进了一部分电活性产甲烷菌对电极电子的利用。
3 结论
本研究通过实验发现,MWCNTs在EAD体系中可通过多重作用机制优化产沼气性能,并对产甲烷菌群落结构及电子传递路径产生显著调控效果。主要结论如下:
a)MWCNTs对底物的吸附缓释效应
投加MWCNTs之后,底物降解和累积产甲烷曲线出现明显缓释或延迟。MWCNTs的纳米尺度的中空管状结构可吸附乙酸分子,乙酸降解时间从2 d延长至4 d,首日平均降解率从54.5%下降至33.5%。该缓释作用显著延缓了pH值上升速率,使体系达到最大pH值的时间推迟约30 h,维持了更稳定的底物供应环境,为产甲烷菌提供了适宜的代谢条件。
b)MWCNTs对产甲烷性能的促进作用
投加0.5 g/L MWCNTs后,产沼气量提升3%,累积产甲烷量增加6%,单位质量底物的产甲烷量从0.37 mL/mg增至0.39 mL/mg。单位时间内甲烷含量峰值从82%提升至86%,单位时间内甲烷含量达到80%的采样时间从36 h延后至48 h,产甲烷周期因底物缓释而延长,动力学参数显示累积产甲烷曲线中产甲烷速率峰值出现的时间(x0)延后幅度达到36.1%,相同底物质量浓度的条件下,累积甲烷产量因反应时间延长而提升幅度达到6%。
c)MWCNTs对产甲烷古菌的群落调控与电子传递优化
SEM结果证实MWCNTs通过胞外聚合物包裹或细胞直接锚定的方式,成为微生物与微生物/电极之间的电子传递介导,通过“纳米电子线”网络,增强DIET。MWCNTs的介导作用优化了Methanosarcina在EAD体系中的电子转移和底物代谢的能力,体现在Methanosarcina的相对丰度在从投加前的0.10%增长至投加后的6.79%,其种群呈现出显著恢复的趋势。
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