中高温大曲作为浓香型白酒的关键糖化发酵剂,富含微生物和风味物质,被誉为“酒之骨”[1]。制作好的大曲通常需要3～6个月贮存陈化,通过微生物和酶作用提升品质,对酿造高品质白酒至关重要[2]。在实际生产中,当前对中高温大曲贮存时间与品质关联性的判断主要依赖工人的经验积累,这种经验依赖性的评价方式易导致大曲及其酿造白酒出现显著的批次差异[3]。
近年来,高通量测序和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱等技术的发展应用,使得大曲贮存时间与品质之间的关联成为了研究热点。现有的研究陆续揭示了大曲贮存过程中微生物群落动态演替与持续代谢的生化过程,取得了一定的进展。例如,LIANG等[4]采用扩增子测序结合蛋白质组学技术,系统研究了低温大曲贮存过程中的品质变化(贮存期为120 d)。发现贮存后大曲的酸度、糖化力及发酵力均显著提高,优势菌属(如曲霉菌属、乳杆菌属)的相对丰度显著增加,且α-淀粉酶和乳酸脱氢酶等关键酶的活性水平也显著提升。梁晨等[5]的研究进一步表明,中高温大曲在贮存过程中(贮存期为0～180 d),前期主要积累酸类和醇类物质,而后期则形成丰富的酯类及含氮类风味物质,同时4-甲基苯酚等异味成分的含量显著降低。FAN等[6]的研究表明,高温大曲陈化过程(90 d)通过持续改变理化性质和微生物群落,提升酯化活性并稳定风味,最终形成以犁头霉属和根霉属为核心的功能菌群,优化了白酒品质。吴正坤等[7]研究发现,中高温大曲经120 d贮存后,其曲皮和曲心微生物数量较30 d贮存显著增加,群落结构由嗜热型向中高温型微生物演替,这一变化优化了大曲微生物菌群结构,更利于优质白酒酿造。然而,受限于实际生产经验及传统大曲贮存期的限定,目前对大曲贮存时间的研究多集中于短期(30～180 d)贮存过程中的变化,而对于超长期贮存(≥1年)大曲的理化特性、微生物组成差异及风味物质累积特征的研究仍鲜见报道,普通贮存时间和超长贮存时间对大曲品质的影响差异及其机制也不清晰。
为此,本研究以四川成都某酒厂普通贮存期和超长贮存期中高温大曲(陈曲和新曲)为研究对象,系统分析其理化特性、微生物群落结构及挥发性风味物质的组成差异,并探究三者间的关联性,以阐明普通贮存时间和超长贮存时间分别对大曲品质的影响差异及其机制,为大曲的科学评价与合理使用提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验样品
不同贮存期中高温大曲样品:产于四川成都某酒厂,主发酵时间为28～30 d,新曲贮存期约为3个月,陈曲贮存期约为15个月,两者均为同一批次生产大曲,并且贮存在同一曲房。
取样方法:为保证取样科学性及均一性,每次取样随机取大曲12块,每块大曲一分为四,取1/4曲块粉碎混匀并采用五点取样法进行取样。每个样品分为3份,-20 ℃保存用于理化指标测定,-80 ℃保存用于高通量测序和挥发性风味物质检测。
1.2 仪器与设备
Agilent 7890A GC system GC-MS、Agilent 1200 series HPLC,安捷伦科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相微萃取头,美国Supelco公司;BS210S电子分析天平,德国Sartorius公司;FE28 pH计,梅特勒-托利多仪器有限公司;HWS24电热恒温水浴锅,一恒科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 大曲理化指标检测
参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》测定水分、酸度、液化力、糖化力、酯化力、发酵力,每组样品取3组平行样进行检测。
1.3.2 大曲微生物群落组成检测
DNA提取的方法和DADA2序列去噪程序均参考唐慧芳等[8]的方法。
1.3.3 大曲中不挥发性有机酸检测
大曲样品预处理:称取5 g样品,加入10 mL超纯水混匀后密封,在80 ℃下以48 kHz超声波提取30 min,经0.22 μm水相滤膜过滤后,进行HPLC分析。
HPLC条件:Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm);柱温35 ℃;流动相5 mmol/L H2SO4溶液;进样体积10 μL;示差检测器;检测温度40 ℃。
1.3.4 挥发性风味物质检测
大曲挥发性风味物质的检测参照陈勇等[3]的方法进行。
1.4 数据处理
采用派森诺基因云(https://www.genescloud.cn/home)平台进行主坐标分析(principal coordinate analysis,PCoA);显著性分析采用SPSS 27.0软件完成;冗余分析使用Canoco 5.0软件实现;其他图通过GraphPad Prism 10和Origin 2021进行绘制。
2 结果与分析
2.1 大曲理化性质与有机酸分析
如图1所示,本研究涉及的2种不同贮存期浓香型白酒大曲(新曲和陈曲),其各项理化指标均符合QB/T 4259—2011《浓香大曲》行业标准的规定要求,两者之间具有显著的差异。陈曲的糖化力(693.0 vs 428.2)、液化力(0.455 1 vs 0.207 6)、发酵力(0.736 7 vs 0.153 3)和酯化力(461.0 vs 342.7)均显著高于新曲(P<0.01)。此外,陈曲酸度(1.203 0)较新曲(0.936 7)显著提升(P<0.01)。作为大曲品质的关键指标,酸度水平直接表示产酸微生物的代谢强度[9]。酸度过高会抑制酵母等有益微生物生长,导致乳酸积累及其酯化产物乳酸乙酯过量,进而破坏酒体酯类平衡,产生涩味等不良风味,而酸度过低则难以有效抑制有害菌增殖,严重影响大曲质量[10]。陈曲中乙酸和己酸含量显著高于新曲(P<0.05),而丁酸含量则显著降低,丙酸与乳酸含量无显著差异(表1)。这些有机酸主要由己酸菌、乳酸菌及酪酸梭菌等微生物代谢产生,并与发酵过程中形成的己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒关键风味物质具有一定的关联性[11-12]。
a-水分;b-酸度;c-液化力;d-糖化力;e酯化力;f-发酵力
图1 不同贮存期大曲理化性质差异分析
Fig.1 Analysis of physicochemical properties of Daqu with different storage periods
注:**表示P<0.01,***表示P<0.001,ns表示P>0.05。
表1 不同贮存期大曲主要有机酸组成与含量 单位:mg/g
Table 1 Composition and content of main organic acids in Daqu during different storage periods
样品乙酸丙酸丁酸己酸乳酸新曲1.171 0±0.059 0a0.413 7±0.015 6a0.717 4±0.072 8b0.830 1±0.046 9a2.515 5±0.102 9a陈曲3.219 9±0.275 5b0.451 9±0.058 6a0.496 5±0.060 8a0.955 6±0.039 9b2.438 8±0.046 1a
注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)。
2.2 大曲挥发性物质组成与占比
2种大曲各类挥发性风味物质含量及占比如图2所示,2种大曲挥发性风味物质含量明细如表2所示。2种大曲样品(陈曲和新曲)中共检出了44种挥发性风味物质成分,包括酯类(15种)、醇类(2种)、酸类(7种)、醛类(4种)、酮类(2种)、吡嗪类(8种)和其他类(6种),其总含量分别为292.89 μg/g(陈曲)和271.82 μg/g(新曲)。陈曲的挥发性风味物质组成与新曲具有显著差异,主要表现为陈曲的酯类、酸类、吡嗪类物质含量更高,分别为249.98、23.66、4.90 μg/g,新曲醛类和酮类物质含量更高,分别为10.86、1.69 μg/g。
a-各类别挥发性物质含量;b-各类别挥发性物质占比;c-关键性差异性代谢物
图2 不同贮存期大曲挥发性物质组成差异分析
Fig.2 Analysis of differences in the composition of volatile substances in Daqu during different storage periods
表2 不同贮存期大曲挥发性风味物质含量 单位:μg/g
Table 2 The content of volatile flavor substances in Daqu at different storage periods
化合物新曲陈曲化合物新曲陈曲酯类(15)218.29249.98苯乙酸0.300.842,6-环辛二烯-1-羧酸,4,5-二甲基-甲酯2.690.32醛类(4)10.862.509,12-十八碳二烯酸(Z,Z)-甲酯1.559.22苯甲醛0.771.169-十六碳烯酸甲酯(Z)-6.589.64癸醛1.400.22苯乙酸甲酯0.300.84壬醛4.261.01碳酸十六烷基丙烯酯0.510.10(Z)-7-十六碳烯醛4.440.11癸酸甲酯2.092.28酮类(2)1.690.17十二烷酸甲酯2.373.91(Z)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮1.590.08庚酸甲酯1.111.234,8-二甲基双环[3.3.1]壬烷-2,6-二酮0.110.09十六烷酸,14-甲基-甲酯1.231.06吡嗪类(8)3.344.90十六烷酸甲酯182.38195.702,6-二甲基吡嗪1.301.00己酸乙酯0.331.93四甲基吡嗪1.170.96己酸甲酯1.183.30三甲基吡嗪0.871.00壬酸甲酯3.003.022-乙基-6-甲基吡嗪—0.67辛酸甲酯9.1011.923-乙基-2,5-二甲基吡嗪—0.11十五烷酸甲酯3.885.50甲基吡嗪—0.19醇类(2)9.429.982-乙酰基-3-甲基吡嗪—0.25苯乙醇7.368.952,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪—0.162-乙基-1-己醇2.061.03酚类(0)——酸类(7)18.0023.66其他类(6)10.211.72己酸1.182.921-十二碳烯2.000.47庚酸1.111.091,2,4-三乙基苯1.67—辛酸9.1010.56石竹烯2.21—壬酸3.002.67十七烷4.33—癸酸2.092.021-十三碳烯—0.8014-甲基十六烷酸1.230.94二十烷—0.45
注:表中“()”内为挥发性物质数量,“—”为未检出。
为进一步明确不同贮存时间大曲的差异性风味物质,对大曲样品气相色谱检测结果进行正交偏最小二乘法判别分析,筛选出12种差异香气物质(变量投影重要度>1)(图2-c),变量投影重要度表征了分类过程中各量的重要性,变量投影重要度值大于1的变量对不同样本组之间的区分起着重要作用[13]。差异香气物质主要包括7种酯类、2种酸类、2种醛类和1种醇类(棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、亚油酸甲酯、己酸甲酯、己酸乙酯、己酸、壬醛和苯乙醇等)。棕榈酸甲酯和亚油酸甲酯等高沸点酯是大曲中主要挥发性成分,MU等[14]通过分析浓香型大曲挥发性成分,鉴定出76种风味物质,其中己酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、油酸甲酯及亚油酸甲酯作为主体香气物质,其含量占比超过样品总风味成分的50%。研究结果表明,相较于新曲,陈曲风味更加饱满,层次更加丰富,棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯等长链脂肪酸酯,在贮存过程中通过缓慢的酯化反应逐渐积累,能够赋予大曲更加醇厚、协调的风味特征;辛酸甲酯(甜润的菠萝和奶油香气)、己酸甲酯(浓郁的热带水果香)和己酸乙酯(强烈的苹果和菠萝香气)等中短链酯类物质在陈曲中的含量也呈现上升趋势,这些物质能够显著提升大曲的果香和甜香特征,使整体香气更加丰富饱满;陈曲中醛类物质的含量趋于平衡,减少了新曲中可能存在的刺激性气味,使整体香气更加协调、柔和;苯乙醇等醇类在陈化过程中与酯类、醛类等风味成分相互作用,增强了大曲的花香和果香特征,促进了各类香气的融合。因此,在大曲生产过程中,适当的贮存陈化能够显著提升大曲的风味表现。陈曲通过酯类物质的积累、醛类物质的平衡以及醇类物质的协同作用,形成了更加复杂、和谐的风味特征,未来可通过调控贮存陈化条件进一步优化大曲的风味品质。
2.3 大曲微生物群落结构差异性分析
本研究通过高通量测序分析2种大曲(陈曲和新曲)微生物群落结构,以探究其内在差异。通过PcoA比较了2个样品大曲的微生物组成,结果如图3-a和图3-b所示,基于真菌和细菌的主坐标分析,陈曲和新曲微生物群落结构差异显著。陈曲和新曲共同拥有18种真核微生物(图3-c)以及52种原核微生物(图3-d)。
a-真菌组成PcoA;b-细菌组成PcoA;c-真菌属韦恩图;d-细菌属韦恩图
图3 不同贮存期大曲微生物群落结构差异性分析
Fig.3 Analysis of the difference of microbial community structure of Daqu during different storage periods
注:图中X表示新曲,C表示陈曲(下同)。
子囊菌门是2种大曲中的绝对优势真菌门(图4-a),其相对丰度在99%以上,其次是毛霉菌门和担子菌门。嗜热子囊菌属(Thermoascus)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和根霉属(Rhizopus)在2种大曲中均有被检测到(图4-b),但其丰度却有显著差异。在真菌群落中,Thermoascus、Aspergillus和Thermomyces是绝对优势菌属,其相对丰度(relative abundance,RA)之和超过90%。而陈曲中Thermoascus的RA相较于新曲显著升高,Aspergillus和Thermomyces的RA显著降低,这可能与三者的生态位竞争有关。Thermoascus是酿酒关键酶源菌,能分泌纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等,分解原料中的大分子物质为可发酵糖类和氨基酸,促进大曲产酒生香[15]。王琳等[16]的研究表明,Thermoascus在浓香型白酒大曲发酵中与酯化力(r=0.97,P<0.01)和液化力呈显著正相关,尤其对酯化作用影响显著,这与本研究结果相似。此外,Wickerhamomyces和Pichia在陈曲中的相对丰度显著较高(P<0.05)。研究表明,这2种酵母菌在酒醅发酵过程中能合成乙酸乙酯、己酸乙酯等关键香气成分,对白酒风味品质具有重要提升作用[17-18]。陈勇等[3]发现,Wickerhamomyces和Pichia在浓香型大曲中的丰度与发酵力呈显著正相关,证实了其在大曲发酵中的关键作用。
陈曲的细菌群落主要以厚壁菌门(Firmicutes)(93.42%)和变形菌门(Proteobacteria)(4.32%)为主(图4-c),二者占总菌群的97.74%;新曲的细菌群落组成与陈曲相似,但其优势菌门为Firmicutes(91.19%)和放线菌门(Actinobacteriota)(2.54%)。在属水平上,2种大曲样品中共检测到20个细菌属(图4-d),其中RA>1%的优势菌属包括:魏斯氏菌属(Weissella)、明串珠菌属(Leuconostoc)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、片球菌属(Pediococcus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伴乳杆菌属(Companilactobacillus)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Levilactobacillus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、短小杆菌属(Curtobacterium)和乳球菌属(Lactococcus)。本研究发现,贮存1年的大曲(陈曲)中Weissella、Pediococcus、Acetobacter、Staphylococcus和Bacillus的RA显著增加,而Leuconostoc和Lactiplantibacillus的RA显著降低。Weissella、Pediococcus和Lactiplantibacillus是中温大曲中常见的产酸菌类群,其能通过代谢产酸促进风味物质的形成[19],汪江波等[20]进一步证实这些菌群是大曲酸度上升及酸性蛋白酶产生的关键功能菌,这从微生物角度解释了陈曲酸度显著高于新曲的原因。作为大曲中关键的风味功能菌群,Bacillus能代谢产生吡嗪类化合物,并与乙酸乙酯、异戊醇等多种风味物质呈显著正相关(P<0.05),其产酶特性和风味物质合成能力对白酒品质提升具有关键作用[21];而Leuconostoc与白酒香气特征呈极显著负相关(P<0.01),其丰度降低可能有利于减少对苯乙醇、异戊醇等香气物质的抑制作用[22]。
a-真菌门水平;b-真菌属水平;c-细菌门水平;d-细菌属水平
图4 不同贮存时间大曲微生物群落结构组成
Fig.4 Microbial community structure and composition of Daqu at different storage periods
2.4 优势微生物类群与理化性质及挥发性风味物质相关性分析
大曲理化性质与优势微生物类群相关性分析如图5-a所示,冗余分析(redundancy analysis,RDA)表明,理化参数对微生物群落组成有显著影响(P<0.05)。前2轴(RDA1和RDA2)分别解释了微生物群落变异的69.53%和4.48%(累计解释率74.01%),环境因子对微生物群落结构具有强筛选作用[23]。本研究发现,Thermoascus作为大曲中的优势真菌属,与液化力、糖化力和发酵力这3种理化指标均呈显著正相关,这一结果与HOU等[24]的研究结论一致。而Aspergillus和Thermomyces却表现出与上述理化指标的负相关性,该现象与李声睿等[25]的报道存在差异。推测可能源于大曲贮存过程中Thermoascus通过生态位竞争抑制了相关菌属的代谢活性。Wickerhamomyces和Pichia与酯化力呈显著正相关。原核微生物中,Weissella作为乳酸菌的重要类群,其丰度与多项理化指标呈显著正相关,这与向港兴等[26]研究的浓香型大曲微生物群落与理化性质相关性结果一致。Leuconostoc、Thermoactinomyces和Lactiplantibacillus则与酸度、液化力等指标呈显著负相关。
微生物间相互作用共同调控着大曲挥发性风味物质的形成。由图5-b可知,大曲优势真核微生物属与差异性风味物质呈显著正相关(P<0.01),Thermoascus、Rhizopus和扣囊复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)与棕榈酸甲酯、苯乙醇、己酸乙酯、2-乙基-6-甲基吡嗪等关键风味物质呈显著正相关;而Aspergillus与多种醛类[(Z)-7-十六碳烯醛、壬醛、癸醛等]呈显著正相关,但与己酸乙酯、苯乙醇、2-乙基-6-甲基吡嗪呈显著负相关。Thermoascus作为2种大曲共有的优势真核微生物属,能够通过分泌耐高温酶类(如淀粉酶、蛋白酶)促进原料降解,增强发酵效率,并贡献独特风味物质[27]。在优势原核微生物中,Weissella与棕榈酸甲酯呈正相关;Leuconostoc、Saccharopolyspora与多种醛类和酮类呈正相关,与部分香气物质(苯乙醇、己酸乙酯、2-乙基-6-甲基吡嗪等)呈显著负相关。研究表明,陈曲与新曲中存在着多样化的微生物群落,这些微生物通过复杂的相互作用,共同影响了两类大曲在挥发性风味物质组成上的差异性表现。
a-优势微生物类群与理化指标相关性分析;b-优势微生物类群与挥发性风味物质相关性分析
图5 优势微生物类群与理化性质及挥发性风味物质相关性分析
Fig.5 Correlation analysis of dominant microbial groups with physical and chemical properties and volatile flavor substances
2.5 不同贮存时间大曲潜在功能差异预测
为揭示陈曲与新曲的代谢功能差异,采用PICRUSt2对陈曲与新曲的关键代谢功能差异进行预测分析(图6-a)。结果表明,二者在淀粉利用、酯类合成、乙醇转化、酸类生成及吡嗪合成等代谢途径存在显著差异,并进一步通过气泡图(图6-b)直观呈现了关键酶的相对丰度差异。这些代谢过程的第一步涉及淀粉和纤维素的分解,淀粉的分解主要通过3种途径进行,需要诸如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)等酶的参与。陈曲中这2种酶的丰度都低于新曲,这可能是由于淀粉在贮存过程中被消耗导致;纤维素的降解主要依靠β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)和纤维素1,4-β-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91),其能够通过乳酸菌(如魏斯氏菌、乳酸杆菌等)产生[28],这与2.3.2节中结果相对应;在酯类代谢合成途径中,丙酮酸脱羧转化成的乙酰辅酶A可以通过3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)、烯酰-辅酶A还原酶(EC 1.3.1.38)、脂肪酸合酶(EC 2.3.1.85)、乙酰辅酶A羧化酶(EC 6.4.1.2)等多种酶作用下生成脂肪酸,并通过与醇发生酯化反应转化为相应的酯类。TIE等[29]的研究表明,多种微生物(如细菌、霉菌和酵母菌)能够产生酯酶并催化脂肪酸乙酯的形成。有趣的是,本研究发现陈曲和新曲中这些酯酶的丰度并没有显著的差异,这意味着陈曲中更多的酯类风味物质可能更大程度上来源于贮存过程中的积累。在吡嗪类合成途径方面,陈曲表现出更高丰度的乙酰乳酸合酶(EC 2.2.1.6)和乙酰乳酸脱羧酶(EC 4.1.1.5);此外,陈曲的乙酰辅酶A水解酶(EC 3.1.2.1)、乙酰辅酶A乙酰转移酶(EC 2.3.1.9)和3-羟基酰基-辅酶A脱氢酶(EC 1.1.1.35)显著高于新曲,这些酶是合成乙酸和己酸过程中的关键酶,进一步解释了陈曲乙酸和己酸显著高于新曲的原因;同时,与乙醇合成有关的酶(EC 1.1.2.7、EC 1.1.2.8)在陈曲中被检测到更高的丰度,说明陈曲具有更好的酒精生成能力。整体来讲,与新曲相比,陈曲表现出淀粉利用能力更低,但酒精转化、有机酸合成及风味物质积累能力增强的代谢特征。这一发现为阐释大曲陈化机制提供了重要的理论依据。
a-大曲所含物质的关键消耗及合成路径;b-各类酶的代谢功能及丰度
图6 不同贮存时间大曲潜在功能差异预测
Fig.6 Prediction of potential functional differences in Daqu under different storage durations
3 结论与讨论
本研究以四川成都某酒厂2种不同贮存期大曲(陈曲和新曲)为研究对象,系统分析了两者在理化特性、微生物群落结构和挥发性风味物质组成等方面的差异。研究发现,陈曲在液化力、糖化力、酯化力和发酵力等关键理化指标上显著优于新曲,但酸度较高,乙酸和己酸含量更丰富。微生物分析显示,陈曲中Thermoascus相对丰度显著上升,而Aspergillus和Thermomyces丰度下降;Weissella和Pediococcus等细菌丰度明显增加。风味物质上,陈曲的酯类、酸类和吡嗪类物质含量更高,新曲则富含醛类和酮类。相关性分析表明,Thermoascus与多项理化指标及棕榈酸甲酯、苯乙醇、己酸乙酯等风味物质呈显著正相关。代谢途径分析进一步揭示,陈曲中乙酸和己酸的积累与乙酰辅酶A代谢关键酶的富集有关,吡嗪类物质的增加则与乙酰乳酸合酶等酶的高表达相关。研究结果表明,新曲较高的淀粉酶活性和较低的酸度特性,使其在基酒酿造中能够保障发酵效率和酒体纯净度;而陈曲显著的酯化能力和丰富的风味物质组成,特别是酯类、酸类和吡嗪类物质的积累,使其在提升酒体风味复杂性和陈香特征方面具有独特优势。这些发现为理解不同贮存期大曲的功能分化提供了科学依据,同时也从微生物-代谢-风味协同作用的角度,阐释了新陈大曲在白酒生产中差异化应用的理论基础。
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