葡萄汁有胞汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)是一种多功能酵母菌,目前被广泛应用于食品、化妆品和农业领域。在果酒酿造领域,H.uvarum作为一种非酿酒酵母,在风味增强方面具有重要作用。它是葡萄酒自然发酵初期的优势菌种,能够产生丰富的酯类、高级醇和萜烯类化合物,使酒体的果香和花香显著提升。例如,陶永胜等[1]的研究表明,H.uvarum糖苷酶使葡萄酒表现出温带水果、小浆果和花香特征。SUN等[2]的研究表明,H.uvarum与酿酒酵母混合发酵能够促进挥发性化合物2-苯乙醇和吲哚-3-乙醇的生成,增强葡萄酒的复杂香气。张阳等[3]发现H.uvarum与酿酒酵母混合发酵能够明显提高苹果酒的品质,增加其发酵香。在枸杞果酒发酵中,剧柠等[4]将H.uvarum与酿酒酵母以3∶1比例混合接种,显著提高了辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量,使酒体风味更加醇厚。
然而,在葡萄酒酿造过程中,与酿酒酵母共同发酵时,H.uvarum通常在发酵初期活跃,但随着乙醇积累(>5%),其活性迅速下降,酿酒酵母逐渐占据主导[2]。究其原因,乙醇是发酵过程中面临的主要非生物胁迫之一。乙醇胁迫能够导致酵母细胞膜通透性增加,使细胞内物质泄漏,造成膜蛋白功能紊乱[5]。高浓度乙醇还会破坏蛋白质的天然构象,使关键酶失活以及蛋白质聚集[6]。乙醇代谢过程中会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),使DNA损伤和脂质过氧化,严重时会引发菌体生长抑制与细胞死亡[7]。为应对乙醇胁迫,酵母进化出多种适应性机制,如通过基因表达调控、细胞膜结构与组成的调整减少膜对乙醇的敏感性[6]。乙醇胁迫还会诱导酵母应激蛋白表达以维持蛋白质稳态,调整碳代谢流向,激发抗氧化防御系统清除ROS,通过自噬作用清除受损细胞器和蛋白质[8]。
人们已经对乙醇胁迫下的酿酒酵母进行了大量研究,而有关非酿酒酵母H.uvarum的乙醇耐受情况虽有研究但对其响应机制报道甚少。研究表明,相比酿酒酵母,H.uvarum的乙醇耐受性明显较弱。刺梨来源H.uvarum菌株F13和WR-27菌株仅能耐受3%(体积分数)的乙醇,表明其对乙醇高度敏感[9-10]。低产乙醇菌株H.uvarum HuC-3-2仅能耐受4%vol的酒精度,当酒精度高于6%vol时,尽管其仍可以生长,但是生长趋势极其微弱[11]。目前关于H.uvarum的乙醇胁迫响应机制还未阐明。SUN等[2]研究了酿酒酵母和H.uvarum在混合发酵过程中随时间变化的转录组和代谢组变化,指出在混菌发酵中,H.uvarum可能通过乙醛酸旁路减少乙醇生成,维持代谢平衡。目前,利用转录组单独研究H.uvarum的乙醇胁迫响应情况还未见报道。本研究选用前期从乌海地区自然发酵的葡萄醪中筛选得到的1株乙醇耐受性相对较强的H.uvarum菌株GJ3,采用Illumina RNA测序(RNA-seq)分析其在6%乙醇胁迫下的转录组。从mRNA水平分析了H.uvarum对乙醇的响应机理,便于后期从基因水平干预改造该菌体,从而培养出更为适应发酵环境的优良菌种。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌体
H.uvarum菌株GJ3,内蒙古农业大学职业技术学院生物技术实验室选育并保藏。
1.1.2 试剂
YPD培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;无水乙醇(分析纯),广州化学试剂厂;TRIzol试剂、Oligo(dT)磁珠、dNTPs,美国Thermo Fisher科技公司;镁离子打断试剂盒、逆转录酶、RNaseH、DNA Polymerase Ⅰ、UDG酶,美国NEB公司。
1.2 仪器与设备
SX-700蒸汽灭菌器,上海天美生化仪器设备工程有限公司;HC-3018R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;SP-01生化培养箱,湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司;NanoDrop ND-1000超微量分光光度计,美国NanoDrop科技公司;Agilent5400片段分析仪,美国Agilent科技公司;2720 Thermal Cycler PCR仪,美国Thermo Fisher科技公司;H-9800 96孔荧光定量PCR仪,苏州合惠生物科技有限公司;Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌体活化
将在-80 ℃保存的菌株GJ3划线接种到YPD固体培养基上,28 ℃培养约24 h。挑取单菌落镜检后在YPD液体培养基中于28 ℃、180 r/min培养24～28 h后,置于4 ℃备用。
1.3.2 乙醇胁迫对酵母细胞生长影响
将前期活化的菌株GJ3挑取8环接种于100 mL YPD培养基中,于28 ℃、180 r/min培养约6 h至对数生长期,在室温下7 500 r/min 离心5 min。收集细胞悬液并分别重悬于含乙醇0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%(体积分数,下同)的新鲜YPD液体培养基中,于28 ℃、180 r/min继续培养8 h。期间每隔2 h测定菌液的OD600nm[12],设置3次生物学重复。
1.3.3 菌体收集
制备浓度为107 CFU/mL的菌株GJ3菌悬液,以10%的接菌量接种到200 mL YPD培养基中,在28 ℃,180 r/min摇床中培养6 h到对数中期。分别取30 mL菌液于室温下7 500 r/min离心5 min,收集菌体。选择一组细胞重悬在30 mL含6%乙醇的新鲜YPD液体培养基中作为乙醇胁迫处理组(M1、M2、M3),另一组重悬在30 mL新鲜YPD液体培养基中作为乙醇胁迫对照组(CK1、CK2、CK3)。在摇床中继续培养2 h后取样[12]。分别收集以上6个样本的菌悬液各5 mL,在4 ℃、14 000×g条件下离心10 min,弃去培养基后置于液氮中速冻1 h,-80 ℃冰箱中保存,用于转录组测序。
1.3.4 RNA 的提取、文库的构建和转录组测序
提取处理组和对照组菌株GJ3的总RNA,检测RNA的纯度和完整性。通过oligo(dT)磁珠富集mRNA,用镁离子打断试剂盒将mRNA片段化,通过逆转录酶合成cDNA第一条链。随后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase Ⅰ进行合成二链cDNA并进行纯化。将双链DNA的末端修复,加A尾并连接测序接头,通过AMPure XP beads磁珠筛选250～300 bp双链cDNA并通过PCR扩增纯化,得到最终的DNA扩增文库。文库质检合格后对RNA-seq进行Illumina Novaseq PE150双端测序。所有测序工作由上海百趣生物医学科技有限公司完成。
1.3.5 转录组数据分析
原始数据使用Cutadapt去除接头序列,再使用fastp过滤掉不合格的序列后得到高质量的有效数据。利用HISAT2软件进行有效测序数据与参考基因组(GCA_000968475.1 Huva2.0)的精确比对,便于后续分析。使用StringTie重构转录本并计算基因在各个样本中的表达水平,使用DESeq2分析处理组与对照组的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),以|log2FC|>=1且Pval<0.05作为筛选条件。为探究DEGs的可能功能,利用clusterProfiler软件进行GO功能注释和KEGG通路富集分析[13]。
1.3.6 DEGs的实时荧光定量反转录PCR(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)验证
挑选10个代表性基因(5个上调和5个下调)进行RT-qPCR以验证测序结果的有效性。目的基因的合成由上海百趣生物医学科技有限公司完成,引物序列见表1。以ACTIN为内参基因,PCR条件为95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,共40个循环。使用2-ΔΔCT方法计算每个基因的相对表达量[14-15]。
表1 RT-qPCR扩增目的基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of the target gene amplified by RT-qPCR
引物正向引物序列(5'→3')反向引物序列(5'→3')SHO1GCCATTTATCCTTACAGACCACCATCTTCCTTGPA1TATTGGGAACTGGTGACTAATCTTCTGGCTTGSTE2TTGATAAAGATCTAGCTGAAGGAACCGCTGAGTGTATUP1TGATAAGACCGTAAGAGGATTCAATGTCCCACASTE3GGCACTGACAGAGCATAGAACCTGACCCATTTVMA1TCCTCCAAAGGCTAAACACAACCGAAAGCACCVMA3ATTTACGGGTTAGTTGTCTAGGTTGTTGGGAAGVMA6AGGGCTAACCAAACAATGGAAGCGTCAACAGAVMA13TTTCTGGGAAGACAATTGAGCGGTTAGAGCATVPH1GAATTATACCCTCACCTCTTCAGATTGCTCGTActinATGATGTGGCTTATGTGAAAGGCTTGTTGAAAT
1.4 数据分析
用SPSS 22.0软件进行显著性差异分析(P<0.05),利用Origin 2019b绘制图表。实验结果用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 不同体积分数乙醇对菌株GJ3生长的影响
为探究H.uvarum对乙醇胁迫的敏感性,当H.uvarum在6 h进入对数中期时,分别用0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的乙醇对菌体进行处理,结果如图1所示。乙醇对H.uvarum 的抑制程度因体积分数不同而异,乙醇体积分数越高,抑制作用越强。具体地,用1%～6%乙醇处理2 h后,H.uvarum细胞均能继续生长,但速度较对照缓慢,当乙醇体积分数达6%时,H.uvarum生长最为缓慢;而用7%和8%乙醇处理2 h后,H.uvarum出现负增长。说明6%乙醇是H.uvarum的耐受上限,这种情况可能诱导细胞亚致死,而不至于使细胞死亡[16]。研究指出,刺梨来源H.uvarum菌株F13、WR-27菌株和低产乙醇菌株H.uvarum HuC-3-2,分别仅能耐受3%、3%、4%的乙醇[[9-11],而菌株GJ3能够耐受6%的乙醇,说明菌株GJ3对乙醇具有更强的耐受性。本研究为得到有效的转录组数据,用6%的乙醇处理菌株GJ3来研究其在乙醇胁迫下的转录机制。
图1 不同体积分数乙醇胁迫下菌株GJ3的生长状况
Fig.1 The growth status of H.uvarum strain GJ3 under different volume fractions of ethanol stress
2.2 测序数据的统计和质控报告
分别提取3个对照组(CK1、CK2和CK3)和3个处理组(M1、M2和M3)的总RNA样本,采用Illumina高通量测序技术对其进行转录组测序,结果如表2所示。经测序质量控制,共获得38.78 G质量碱基,平均测序错误率为0.01%,Q20和Q30碱基百分比分别在98%和96%以上,表明转录组测序数据准确可靠,可用于后续分析。
表2 测序数据统计表
Table 2 Statistical table of sequencing data
样品原始序列数/条总长度/G干净序列/条干净序列总长度/G平均测序错误率/%Q20/%Q30/%GC含量/%CK142 193 9006.3741 916 6506.3170.0199.1997.4137.10CK248 396 8467.3148 078 6807.2450.0199.1597.3137.13CK347 715 3807.2147 385 5187.1400.0199.1497.2937.13M140 141 3206.0639 808 6765.9910.0198.9896.8736.53M241 451 5346.2641 202 7386.2080.0199.1597.3236.11M339 334 1385.9439 046 9845.8830.0199.1097.1935.58
2.3 乙醇胁迫下的菌株GJ3差异表达基因分析
以FC≥2或FC≤0.5(即|log2FC|≥1)和FDR<0.05为标准对2组样品间的基因表达情况进行差异分析,筛选出菌株GJ3在乙醇胁迫条件下的DEGs。结果如图2所示,与对照组相比,处理组共鉴定出1 090个DEGs,其中上调基因有691个,占总差异表达的63.39%,下调基因有399个,占总差异表达的36.61%。
图2 差异表达基因火山图
Fig.2 Volcano plot of differentially expressed genes
2.4 差异表达基因的GO注释
本研究将上述DEGs中的上调和下调基因分别进行GO富集分析,来探究其生物学功能。GO富集分析分别描述基因的分子功能、细胞组分和生物过程。如图3-a所示,跨膜运输、DNA模板转录调控、DNA修复等生物过程相关基因上调表达,分子功能方面DNA结合转录因子活性、未折叠蛋白结合、铁离子结合等相关基因被激活,细胞组分中膜和细胞核相关基因也被激活。如图3-b所示,蛋白质水解、碳水化合物代谢过程、质子跨膜运输等生物过程相关基因下调表达,分子功能方面氧化还原酶活性、质子转运ATP酶活性、氧化还原酶活性、ABC型转运蛋白活性等相关基因活性被抑制,细胞组分中膜相关基因也下调表达。以上结果表明,乙醇胁迫主要影响菌株GJ3的细胞膜和细胞核中的分子结合功能及酶活性,进而影响了细胞的物质代谢、能量代谢及基因的表达与调控。
a-上调基因富集分析;b-下调基因富集分析
图3 差异表达基因GO富集柱状图
Fig.3 GO enrichment column of differentially expressed genes
2.5 差异表达基因的KEGG富集分析
为了解H.uvarum响应乙醇胁迫的基本机制,本研究利用KEGG数据库对筛选得到的DEGs进行富集分析以确定其显著富集的通路以及其参与的主要代谢途径和信号转导途径。基于差异分析和KEGG注释的结果,采用clusterProfiler软件,以Pval<0.05为阈值,找出显著富集的KEGG通路。结果如图4所示,KEGG富集散点图,富集程度由富集因子、P值和基因数来评估,本研究DEGs共有10个通路。进一步分析这些通路,共涉及四类一级通路和六类二级通路(表3)。其中,涉及新陈代谢的通路有4条(氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢),共45个基因;涉及细胞的运输与分解代谢过程通路有2条(吞噬体和溶酶体),共18个基因;此外还涉及遗传信息通路(RNA降解)和信号转导通路MAPK信号通路。对于单个的代谢通路,基因数量最多的是代谢途径(112个)和次生代谢产物的生物合成(55个),从广义上涵盖了所有属于该通路的基因,因此无法进行一级和二级分类。以上结果表明,乙醇胁迫下菌株GJ3主要富集通路与能量代谢、碳水化合物及其衍生物代谢、物质的运输与分解代谢、信号转导以及遗传信息有关,这与GO富集分析的结果一致。
图4 差异表达基因KEGG富集气泡图
Fig.4 Bubble map of KEGG enrichment of differentially expressed genes
表3 差异表达基因的KEGG富集分析
Table 3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes
通路ID通路描述差异基因数目该通路对应的一级分类该通路对应的二级分类sce01100代谢途径112未知未知sce01110次生代谢产物的生物合成55未知未知sce00190氧化磷酸化18新陈代谢能量代谢sce00010糖酵解/糖异生11新陈代谢碳水化合物代谢sce00500淀粉和蔗糖代谢8新陈代谢碳水化合物代谢sce00520氨基糖和核苷酸糖代谢8新陈代谢聚糖生物合成与代谢sce04011丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki-nase,MAPK)信号通路-酵母16环境信息处理信号转导sce03018RNA降解12遗传信息处理折叠、分选与降解sce04145吞噬体11细胞过程运输与分解代谢sce04142溶酶体7细胞过程运输与分解代谢
2.6 差异表达基因的RT-qPCR验证
本研究从转录组测序结果中选取10个表达差异显著的基因(SHO1、GPA1、STE2、TUP1、STE3、VMA1、VMA3、VMA6、VMA13、VPH1)进行RT-qPCR试验,用于验证其表达水平是否与测序结果一致。结果如图5 所示,RNA-Seq和RT-qPCR中DEGs的变化趋势一致,说明此次转录组测序数据的有效性和可靠性。
图5 差异表达基因的 RT-qPCR 验证
Fig.5 RT-qPCR validation of differentially expressed genes
2.7 乙醇胁迫下相关基因表达分析
2.7.1 能量代谢
氧化磷酸化是细胞能量代谢的核心途径,该过程是指在线粒体内膜上通过电子传递链和ATP合酶的作用,将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)或黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FADH)的化学能转化为ATP的过程[17]。PPA2编码线粒体无机焦磷酸酶,该酶可水解焦磷酸为磷酸,间接维持ATP合成所需磷酸/焦磷酸平衡。ATP1编码线粒体F-ATP合酶α亚基,该亚基是质子驱动ATP合成的催化核心。周安莲等[18]指出,乳酸胁迫下,酿酒酵母相关基因 ATP18、ATP2、ATP7、ATP14和ATP12的表达水平显著升高。SHH3编码PP2A催化亚基,该亚基具有线粒体蛋白去磷酸调控呼吸链复合体活性,维持氧化磷酸化的稳态。CYC1编码细胞色素c家族中的一种蛋白质同工型。细胞色素c是一种存在于线粒体内膜上的血红素蛋白,是电子在复合体Ⅲ→Ⅳ间传递呼吸链必需电子载体。
基于转录组数据,菌株GJ3在乙醇胁迫下的氧化磷酸化通路及其关键DEGs表达变化详见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044353,下同)。PPA2、ATP1、SHH3、CYC1的显著下调说明乙醇胁迫削弱了线粒体合成ATP的能力。COX基因编码细胞色素氧化酶,这种酶催化电子从细胞色素c转移到分子氧和质子泵穿过线粒体内膜以产生大量ATP。周安莲等[18]揭示乳酸胁迫下酿酒酵母相关基因COX13、COX12、COX7 和COX5A的表达水平显著升高。本研究中,COX10也有类似的结果,它是唯一一个在氧化磷酸化通路显著上调的基因,说明菌株GJ3可能通过促进细胞色素c氧化酶(COX)组装,维持电子传递链的功能,缓解乙醇诱导的氧化磷酸化障碍[19]。
至于氧化磷酸化通路中还有另外8个编码液泡型H+-ATP酶的基因,KEGG富集分析将其列为氧化磷酸化通路的参考酶基因,仅体现进化同源性,不直接参与线粒体ATP合成,它们对菌株GJ3的影响将在后面的吞噬体和溶酶体通路中介绍。
2.7.2 碳水化合物及其衍生物代谢
2.7.2.1 糖酵解/糖异生
参与糖酵解/糖异生的酶对细胞能量供应和碳代谢平衡至关重要。这些酶调控碳流向并影响细胞生长发育和乙醇胁迫响应。ACS2编码乙酰辅酶A合成酶2,它催化乙酸转化为乙酰辅酶A,具有调控脂质合成和能量代谢的重要作用。乙醇胁迫会导致乙酰辅酶A合成酶活性下降,使乙酰辅酶A供应不足,影响细胞膜稳定性[20]。GPM1和GPM2编码磷酸甘油酸变位酶,该酶催化3-磷酸甘油酸与2-磷酸甘油酸之间的互相转变。乙醇胁迫下,GPM1缺失会抑制糖异生,导致能量失衡。PAPINI等[21]发现酿酒酵母GPM1敲除菌株在甘油和乙醇条件下生长严重受损,但添加葡萄糖后能够正常生长,表明GPM1缺失影响糖异生依赖的代谢适应。而GPM1缺失使磷酸戊糖途径和乙醛酸循环基因上调,以补偿能量缺失。
PFK1基因编码磷酸果糖激酶,该酶催化6-磷酸葡萄糖生成1,6-二磷酸果糖。研究显示,PFK1失活突变使酿酒酵母类胡萝卜素产量显著提高,表明其失活导致糖酵解通量减少,可能促使碳代谢流向类胡萝卜素合成途径,同时增强细胞对乙醇胁迫的适应性[22]。PGI1基因编码的酶催化6-磷酸葡萄糖与6-磷酸果糖之间的互变,调控糖酵解和磷酸戊糖途径的代谢流分配。
基于转录组数据,菌株GJ3在乙醇胁迫下的糖酵解/糖异生通路(sce00010)及其关键DEGs表达变化如附表2所示。GPM1、GPM2、PGK1、ENO2、PFK1、PFK2的基因下调表明乙醇胁迫可能抑制碳代谢通量,使ATP和NADH的生成量减少以降低能量消耗,并避免有毒代谢物的积累。糖酵解过程受抑制也可能促使碳流向磷酸戊糖途径,以增强还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)供应,从而清除乙醇诱导的活性氧。而ACS2下调可能使脂质合成减少,影响细胞膜流动性,增强了乙醇对膜的破坏作用[20]。乙醇胁迫下,PGI1表达下调可减少糖酵解通量,增强磷酸戊糖途径和NADPH的供应,从而增强氧化应激防御能力[23]。
2.7.2.2 淀粉和蔗糖代谢
通常情况下,乙醇胁迫会显著抑制酵母细胞的淀粉和蔗糖的合成代谢,同时强烈激活其分解代谢,目的是提供能量和碳骨架,以应对毒性压力、修复损伤并维持基本生命活动。FKS3基因参与细胞壁1,3-β-葡聚糖合成,影响细胞壁完整性。杨歌等[24]研究了FKS3缺陷的Δfks3酿酒酵母菌株,它的生长性能和胁迫性能与原菌株相似,在发酵环境中抵抗外界环境能力和合成乙醇能力优于原始菌株,表明FKS3可能对乙醇胁迫有负面作用,其缺失反而增强乙醇耐受性。TPS1基因编码的海藻糖-6-磷酸合成酶催化6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸-葡萄糖生成6-磷酸海藻糖。海藻糖能够稳定蛋白质和细胞膜,防止乙醇诱导的变性。林贝等[25]克隆了自絮凝酵母的TPS1的启动子区域,构建了pYES2.0-PTPS1载体并转化酿酒酵母。在7%乙醇条件下,PTPS1活性强烈诱导,但不受高糖或高温影响,显示其对乙醇的特异性响应。
本研究在乙醇胁迫下,菌株GJ3的淀粉和蔗糖代谢通路(sce00500)及其关键DEGs表达变化见附表2。储能相关基因GSY1和TPS1下调的可能原因是细胞减少储能分子的合成,以优先维持基础代谢和应对乙醇胁迫。但TPS1通常在胁迫下积累以稳定蛋白质和膜结构,其下调可能使细胞更易受乙醇损伤[20,25]。而FKS3上调可能增强了细胞壁刚性,以抵抗乙醇引起的膜损伤和渗透压变化[24]。
2.7.2.3 氨基糖和核苷酸糖代谢
本研究在乙醇胁迫下,菌株GJ3的氨基糖和核苷酸糖代谢通路(sce00520)及其关键DEGs表达变化如附表2所示,主要涉及细胞结构和功能完整性方面。CTS2编码几丁质酶,参与细胞壁重塑和自噬过程,而乙醇胁迫酿酒酵母会引起细胞壁的应激响应。CDA2修饰几丁质,影响细胞壁的机械强度和免疫逃逸。有关CHS1基因的研究已有很多。砂藓(racomitrium canescens)的RcCHS1在脱水、高温胁迫下显著上调,推测其通过合成保护性代谢物增强胁迫耐受性[26]。甘草的GuCHS1在盐胁迫下表达量提升31.3倍,与抗氧化代谢物(甘草查尔酮A)积累相关[27]。本研究菌株GJ3的CTS2、CHS1和CDA2上调,表明酵母通过细胞壁重塑增强机械抗性,减少乙醇渗透导致的膜损伤。
PCM1编码磷酸乙酰葡糖胺变位酶,该酶催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转变为N-乙酰葡糖胺-6-磷酸,是几丁质(细胞壁关键组分)合成的关键酶。在乙醇胁迫下,PGI1和PCM1同时下调,表明酵母可能全面抑制合成代谢(如细胞壁和糖原合成),以集中资源应对氧化损伤和膜修复[20, 28]。
2.7.3 MAPK信号通路
MAPK信号通路是真核细胞中高度保守的信号转导系统,通过三级激酶级联反应(MAPKKK→MAPKK→MAPK)传递外界刺激,调控细胞增殖、分化、应激响应等多种生理过程。本研究的KEGG富集分析显示,有16个MAPK信号通路差异表达基因,其中12个上调,4个下调(附表3)。本研究对已注释到名称的7个上调基因进行分析。
STE2和STE3都编码G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs),分别响应α-因子和α-因子信息素,激活交配反应MAPK通路。STE18编码G蛋白γ亚基,与GPA1(Gα亚基)共同调控信号转导,使HOG-MAPK(高渗透压甘油响应)通路的激活[29]。本研究中STE2、STE3、STE18、GPA1上调说明G蛋白信号系统被激活,GPCRs和G蛋白亚基可能通过交配反应MAPK通路和HOG-MAPK通路间接调控乙醇胁迫响应。
SHO1基因编码的是一种跨膜感受器蛋白,是HOG-MAPK通路的膜定位传感器,触发HOG1磷酸化,促进甘油合成(GPD1)以维持渗透平衡。在700 g/L高糖胁迫下,蜂蜜接合酵母SHO1表达量提高3.51倍,导致甘油积累以保护细胞[30]。本研究中SHO1上调使渗透压传感器激活,进而促进甘油合成来响应乙醇胁迫。
TUP1是全局转录调控因子,抑制应激响应基因。在乙醇胁迫下,其上调可能解除对HOG-MAPK靶基因的抑制,增强应激响应[31]。至于FKS3基因,由于它也存在于淀粉和蔗糖代谢(sce00500)通路中,其功能在前文已述及。综合以上结果,酵母主要通过HOG-MAPK通路响应乙醇胁迫。
2.7.4 RNA降解
在乙醇胁迫响应中,RNA降解通路也起着至关重要的作用,该通路主要通过调控mRNA稳定性、清除受损RNA以及调整基因表达网络来帮助细胞适应或抵抗乙醇胁迫。RNA降解通路主要包括脱帽复合体、外泌体、RNA解旋酶和核糖核酸酶等。DCP1和DCP2主要编码脱帽复合体,脱帽复合体能够移除mRNA的5′端帽子结构,促进mRNA的降解。RRP40和RRP4等主要编码外泌体,外泌体负责降解错误折叠或受损的RNA,并在胁迫条件下调控关键基因的表达[32]。SKI2编码RNA解旋酶,参与RNA的解旋和降解。TRF5编码核糖核酸酶复合物,参与tRNA前体加工和rRNA成熟。MOT2编码RNA聚合酶Ⅱ介导的转录调控复合物,参与基因表达的抑制或激活。PFK1和PFK2并非典型的RNA降解通路组分,但在乙醇胁迫下,它们可能通过调控能量供应(ATP/NADPH水平),影响RNA降解酶的活性[20]。
乙醇胁迫下,本研究中菌株GJ3参与的RNA降解通路呈现选择性调控(附表4)。DCP1、DCP2和RRP4上调可能促进清除有害mRNA,而RRP40和SKI2下调保护部分应激相关转录本[20,32]。MOT2和TRF5的上调可能通过转录抑制和tRNA加工优化,调整细胞在乙醇胁迫下的基因表达模式。ENO2、PFK1和PFK2的下调可能减少糖酵解依赖,转而增强抗氧化和膜稳定性相关代谢[33]。
2.7.5 吞噬体和溶酶体通路
液泡H+-ATP酶(V-ATPase)由多个亚基(VMA1～VMA13、VPH1等)组成,是一种广泛存在于真核细胞中的跨膜蛋白复合物。乙醇胁迫会使H+的膜通透性增加,进而引起H+内流和细胞内酸化增加。V-ATPase 通过水解ATP,使细胞内的H+转运到液泡,从而维持细胞内pH稳态以应对乙醇胁迫。已有研究显示,酵母中编码V-ATPase的基因(如VMA1、VMA2、VMA4、VMA5、VMA6、VMA7、VPH1)缺失后对乙醇胁迫非常敏感[34-35]。VPH1缺失突变体(Δvph1)在乙醇胁迫下生长严重受限,表明液泡膜完整性对乙醇耐受至关重要[36]。在乙醇胁迫下,VMA11缺失突变体无法组装功能性V-ATPase,导致液泡无法酸化,细胞生长受抑制[37]。
本研究在乙醇胁迫下,菌株GJ3的吞噬体和溶酶体通路(sce04145和sce04142)及其关键DEGs表达变化见附表5。VMA1、VMA2、VMA3、VMA4、VMA6、VMA11、VMA13、VPH1均显著下调,这可能会使V-ATPase活性降低,导致液泡pH升高,进而影响自噬体和蛋白水解酶(如组织蛋白酶)的活性,加剧乙醇诱导的蛋白质毒性;同时可能会使液泡膜稳定性下降。此外,V-ATPase消耗ATP,编码该酶的大量基因下调可能减少能量浪费,但会引起能量代谢紊乱,同时也削弱了应激响应能力。
TUB2基因编码微管蛋白β链,功能是维持细胞骨架结构,参与囊泡运输和细胞分裂[7]。本研究中该基因显著下调,可能会使微管稳定性受损,影响液泡与自噬体融合,加剧乙醇诱导的细胞器损伤。CHC1基因编码网格蛋白重链,介导内吞作用和囊泡运输。TGL1基因编码三酰基甘油脂肪酶,能够水解脂滴,提供游离脂肪酸用于能量代谢[22]。本研究中TGL1和CHC1下调可能会引起脂代谢和囊泡运输紊乱,最终使膜流动性异常。
3 讨论与结论
在葡萄酒的酿造过程中,非酿酒酵母H.uvarum在生长和发酵过程中会不可避免地遭受乙醇胁迫。本研究探究了乙醇胁迫对菌株GJ3生长的影响,结果表明,乙醇抑制了其生长,乙醇体积分数越高抑制作用越明显。
酵母的乙醇响应机制涉及细胞膜稳定性、代谢调控、遗传信息处理、应激响应等多个方面。因此,对于非酿酒酵母H.uvarum在乙醇胁迫下的调控机制需要进行系统地分析。本研究通过转录组分析共鉴定出1 090个DEGs,其与能量代谢、碳水化合物及其衍生物代谢、细胞信号转导、遗传信息处理、运输与分解代谢等通路有关。
在乙醇胁迫下,菌株GJ3能量代谢相关基因PPA2、ATP1、SHH3、CYC1显著下调说明乙醇胁迫削弱了线粒体合成ATP的能力,而COX10显著上调说明酵母菌可能通过促进COX组装,维持电子传递链的功能,缓解乙醇诱导的氧化磷酸化障碍[20]。糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢以及氨基糖和核苷酸糖代谢相关基因多数下调和个别上调表明酵母可能通过下调碳代谢基因减少能量消耗和有毒产物积累,增强抗氧化防御;同时调整细胞壁相关基因表达以增强响应乙醇胁迫的机械抗性,并抑制合成代谢以集中资源应对膜损伤和氧化应激[21,29]。此外,MAPK信号通路相关的DEGs显著上调说明酵母主要通过HOG-MAPK通路响应乙醇胁迫。酵母还通过调控RNA降解相关基因选择性清除有害mRNA并保护应激转录本,同时抑制糖酵解关键基因以减少能量代谢,并优化基因表达模式以增强胁迫适应能力。而吞噬体和溶酶体通路相关基因(主要是V-ATPase的基因)普遍下调可能导致液泡酸化和蛋白水解功能受损,加剧蛋白质毒性;同时引发能量代谢紊乱与膜流动性异常,削弱细胞应激响应能力。
本研究结果为H.uvarum适应乙醇胁迫机理的深入探索提供了依据,为理解微生物的环境适应性提供新的见解。未来研究将重点解析关键胁迫响应基因的功能,并借助合成生物学手段对其进行定向改造,以构建适用于高体积分数乙醇响应的强化耐受型工程菌株。
[1] 陶永胜, 朱晓琳, 马得草, 等.葡萄汁有孢汉逊酵母糖苷酶增香酿造葡萄酒的潜力分析[J].农业机械学报, 2016, 47(10):280-286.TAO Y S, ZHU X L, MA D C, et al.Application of glycosidase from Hanseniaspora uvarum on wine aroma enhancement[J].Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2016, 47(10):280-286.
[2] SUN Q, UNIVERSITY N A, CENTER B, et al.Unraveling time-resolved transcriptional and metabolic shifts in the mixed fermentation of saccharomyces cerevisiae and Hanseniaspora uvarum[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025, 73(20):12418-12432.
[3] 张阳, 蒋媛, 贾伟豪, 等.葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混合发酵对嘎啦苹果酒品质的影响[J].现代食品科技, 2023, 39(5):53-61.ZHANG Y, JIANG Y, JIA W H, et al.Effect of mixed fermentation of Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae on the quality of gala cider[J].Modern Food Science and Technology, 2023, 39(5):53-61.
[4] 剧柠, 胡婕, 赵梅梅, 等.葡萄汁有孢汉逊酵母与酿酒酵母混种对发酵枸杞果酒的影响[J].食品工业科技, 2019, 40(6):106-113.JU N, HU J, ZHAO M M, et al.Effects of mixed cultures with Hanseniaspora uvarum and Saccharomyces cerevisiae on fermented wolfberry wine[J].Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(6):106-113.
[5] 何迎粉, 何荣荣, 刘敦华, 等.海藻糖与酿酒酵母乙醇耐受性相关性的研究进展[J].中国酿造, 2020, 39(11):1-4.HE Y F, HE R R, LIU D H, et al.Correlation between trehalose and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae[J].China Brewing, 2020, 39(11):1-4.
[6] JI X X, ZHANG Q, YANG B X, et al.Response mechanism of ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae strain ES-42 to increased ethanol during continuous ethanol fermentation[J].Microbial Cell Factories, 2025, 24(1):33.
[7] 张乐, 崔金娜, 刘伟, 等.酿酒酵母耐受机制研究进展[J].食品科学, 2024, 45(3):317-325.ZHANG L, CUI J N, LIU W, et al.Research progress on tolerance mechanism of Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2024, 45(3):317-325.
[8] JING H J, LIU H H, ZHANG L, et al.Ethanol induces autophagy regulated by mitochondrial ROS in Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of Microbiology and Biotechnology, 2018, 28(12):1982-1991.
[9] 赵湖冰, 黎华, 田野, 等.一株刺梨非酿酒酵母的分离鉴定、生理特性及混菌发酵研究[J].食品工业科技, 2020, 41(16):114-120.ZHAO H B, LI H, TIAN Y, et al.Isolation, identification, physiological characteristics and mixed fermentation of a non-Saccharomyces cerevisiae from Rosa roxburghii[J]. Science and Technology of Food Industry, 2020, 41(16):114-120.
[10] 李银凤, 刘昕, 付伟, 等.一株野生刺梨来源葡萄汁有孢汉逊酵母的鉴定及酿造学性能分析[J].食品科技, 2024, 49(7):18-23.LI Y F, LIU X, FU W, et al.Identification and oenological property analysis of a strain of Hanseniaspora uvarum isolated from wild Rosa roxburghii tratt[J].Food Science and Technology, 2024, 49(7):18-23.
[11] 冯文倩, 王倩, 刘延琳, 等.低产乙醇本土有孢汉逊酵母的筛选及酿造特性[J].食品与发酵工业, 2021, 47(21):9-17.FENG W Q, WANG Q, LIU Y L, et al.Screening and oenological properties of Hanseniaspora strains with low ethanol yield[J].Food and Fermentation Industries, 2021, 47(21):9-17.
[12] 沈东旭, 翁佩芳, 吴祖芳, 等.基于转录组学分析酿酒酵母PY01高密度培养的氧化胁迫应答机制[J].中国食品学报, 2024, 24(3):27-35.SHEN D X, WENG P F, WU Z F, et al.Oxidative stress response mechanism in high density culture of Saccharomyces cerevisiae PY01 based on transcriptome analysis[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2024, 24(3):27-35.
[13] MORTAZAVI A, WILLIAMS B A, MCCUE K, et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J].Nature Methods, 2008, 5(7):621-628.
[14] PINHEIRO C, GUILBERT N, LIPPENS L, et al.Identification and validation of extracellular vesicle reference genes for the normalization of RT-qPCR data[J].Journal of Extracellular Vesicles, 2024, 13(4):e12421.
[15] GORAICHUK I V, HARDEN M, SPACKMAN E, et al.The 28S rRNA RT-qPCR assay for host depletion evaluation to enhance avian virus detection in Illumina and Nanopore sequencing[J].Frontiers in Microbiology, 2024, 15:1328987.
[16] ZHAI Z Y, YANG Y, WANG H, et al.Global transcriptomic analysis of Lactobacillus plantarum CAUH2 in response to hydrogen peroxide stress[J].Food Microbiology, 2020, 87:103389.
[17] SETTEMBRE C, FRALDI A, MEDINA D L, et al.Signals from the lysosome:A control centre for cellular clearance and energy metabolism[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2013, 14(5):283-296.
[18] 周安莲, 廖泳宜, 杨玉婷, 等.酿酒酵母在乳酸胁迫下的应激响应及转录组学分析[J].食品与发酵工业, 2026, 52(6): 328-336.ZHOU A L, LIAO Y Y, YANG Y T, et al.Stress response and transcriptomic analysis of Saccharomyces cerevisiae under lactic acid stress[J].Food and Fermentation Industries, 2026, 52(6): 328-336.
[19] DAS S K, VASUDEVAN D M.Alcohol-induced oxidative stress[J].Life Sciences, 2007, 81(3):177-187.
[20] 高鹏, 丁健, 张许, 等.乙醇胁迫抑制毕赤酵母表达外源蛋白的转录组学分析[J].生物工程学报, 2016, 32(5):584-598.GAO P, DING J, ZHANG X, et al.Transcriptome analysis of Pichia pastoris in response to ethanol stress[J].Chinese Journal of Biotechnology, 2016, 32(5):584-598.
[21] PAPINI M, NOOKAEW I, SCALCINATI G, et al.Phosphoglycerate mutase knock-out mutant Saccharomyces cerevisiae:Physiological investigation and transcriptome analysis[J].Biotechnology Journal, 2010, 5(10):1016-1027.
[22] SU B L, LI A Z, DENG M R, et al.Identification of a novel metabolic engineering target for carotenoid production in Saccharomyces cerevisiae via ethanol-induced adaptive laboratory evolution[J].Bioresources and Bioprocessing, 2021, 8(1):47.
[23] 孙锦云. 代谢工程手段改造酿酒酵母PP途径提高木糖发酵能力[D].天津:天津大学, 2013.SUN J Y.Metabolic engineering of pentose phosphate pathway for improving xylose fermentation performance in Saccharomyces cerevisiae[D].Tianjin:Tianjin University, 2013.
[24] 杨歌, 王金晶, 李佳, 等.FKS家族基因对酿酒酵母压力耐性的影响[J].食品与生物技术学报, 2019, 38(10):126-134.YANG G, WANG J J, LI J, et al.Effects of FKS family genes on the ability of Saccharomyces cerevisiae stress resistance[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2019, 38(10):126-134.
[25] 林贝, 赵心清, 张秋美, 等.絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1启动子区的克隆和乙醇胁迫下启动子活性的变化[J].生物工程学报, 2010, 26(7):1014-1018.LIN B, ZHAO X Q, ZHANG Q M, et al.Cloning of the promoter region of the Trehalose-6-phosphate synthase gene TPS1 of the self-flocculating yeast and exploration of the promoter activity on ethanol stress[J].Chinese Journal of Biotechnology, 2010, 26(7):1014-1018.
[26] 马天意, 赵继发, 沙伟, 等.砂藓耐脱水胁迫相关基因RcCHS1的克隆及表达分析[J].分子植物育种, 2025, 23(13):4338-4344. MA T Y, ZHAO J F, SHA W, et al.Cloning and expression analysis of RcCHS1 gene related to dehydration stress tolerance in Racomitrium canescens[J].Molecular Plant Breeding, 2025, 23(13):4338-4344.
[27] 何梦媛, 姚华, 李国治, 等.甘草CHS基因家族鉴定、表达特性分析及其与甘草查尔酮A积累的关系研究[J].植物生理学报, 2022, 58(1):141-154.HE M Y, YAO H, LI G Z, et al.Identification of CHS gene family and analysis of its expression characteristics in relation to the accumulation of licochalcone A in Chinese licorice (Glycyrrhiza uralensis)[J].Plant Physiology Communications, 2022, 58(1):141-154.
[28] 赵素娟. 活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用[D].郑州:河南工业大学, 2012.ZHAO S J.The role of ROS in ethanol stress of Saccharomyces cerevisiae[D].Zhengzhou:Henan University of Technology, 2012.
[29] 张淑娴. 基于酿酒酵母原始株与乙醇适应株间的差异分析乙醇耐受性机制[D].北京:北京化工大学, 2014.ZHANG S X.Analysis the mechanism of ethanol tolerance based on the differences of parental strain and ethanol adapted strains of Saccharomyces cerevisiae[D]. Beijing:Beijing University of Chemical Technology, 2014.
[30] LIU G L, BI X Y, TAO C L, et al.Comparative transcriptomics analysis of Zygosaccharomyces mellis under high-glucose stress[J].Food Science and Human Wellness, 2021, 10(1):54-62.
[31] 陈英, 芦志龙, 张穗生, 等.Tup1基因缺失对酿酒酵母耐高糖性状的影响[J].广西科学院学报, 2020, 36(3):338-343.CHEN Y, LU Z L, ZHANG S S, et al.Effects of Tup1 gene deletion on high glucose tolerance of Saccharomy cescerevisiae[J].Journal of Guangxi Academy of Sciences, 2020, 36(3):338-343.
[32] 谢洋. 脱帽酶DCP2在拟南芥乙烯信号通路中作用机制的初步研究[D].杭州:浙江大学, 2021.XIE Y.Preliminary study on the functional mechanism of decapping enzyme DCP2 in ethylene signaling pathway in Arabidopsis[D].Hangzhou:Zhejiang University, 2021.
[33] SCHNEPPER A P, MARQUES L F, WOLF I R, et al.Potential global cis and trans regulation of lncRNAs in Saccharomyces cerevisiae subjected to ethanol stress[J].Gene, 2024, 920:148521.
[34] AUESUKAREE C, DAMNERNSAWAD A, KRUATRACHUE M, et al.Genome-wide identification of genes involved in tolerance to various environmental stresses in Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of Applied Genetics, 2009, 50(3):301-310.
[35] VAN VOORST F, HOUGHTON-LARSEN J, JØNSON L, et al.Genome-wide identification of genes required for growth of Saccharomyces cerevisiae under ethanol stress[J].Yeast, 2006, 23(5):351-359.
[36] MATSUURA K, TAKAGI H.Vacuolar functions are involved in stress-protective effect of intracellular proline in Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100(5):538-544.
[37] UMEMOTO N, OHYA Y, ANRAKU Y.VMA11, a novel gene that encodes a putative proteolipid, is indispensable for expression of yeast vacuolar membrane H(+)-ATPase activity[J].Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(36):24526-24532.