唾液酸(sialic acids,SAs)是一种带负电荷的九碳酸性氨基糖,具有吡喃糖结构的天然糖类化合物,在自然界中分布广泛,其最初由BLIX等[1]从牛颌下唾液腺黏蛋白中分离出来,因此得名。N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)是一种由α-酮醛糖酸和九碳骨架组成的具有重要功能性的九碳单糖[2],是唾液酸家族50多种成员中最常见的一种[3-5],其含量占整个唾液酸家族的99%以上,因此也常用唾液酸代指Neu5Ac。
Neu5Ac通常位于细胞表面糖脂和糖蛋白的末端,在细胞保护与识别、调节免疫应答等方面具有多种细胞生物学功能[6-8]。除此之外,Neu5Ac具有抗病毒、抗炎、抗癌等功能,在医药领域也发挥着重要作用[9]。快速的研究进展为Neu5Ac在人类营养中的作用提供了越来越多的证据,在2015年相继被欧盟、美国以及中国食品药品监督管理局认证为一种新的食品营养添加剂[10],为食品工业开发有效的膳食补充剂和营养食品开辟了巨大的前景。随着市场快速扩张对Neu5Ac产品需求的持续增长,开发经济高效、绿色可持续的生产方式尤为重要。目前,Neu5Ac的传统生产方法主要是从牛奶、燕窝、蛋黄等天然资源中提取,然而Neu5Ac在天然原料中含量较低,提纯分离困难,不适用于大规模生产。后续开发的化学合成法产物分离困难、酶法生产成本高、全细胞催化法操作步骤复杂等,不利于Neu5Ac的大规模工业化生产。合成生物学和代谢工程的快速发展为Neu5Ac产物的高效生物合成提供了新的策略。目前,Neu5Ac已在大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中实现异源从头合成[11-12]。前期研究中,本团队通过在大肠杆菌中构建Neu5Ac合成途径、优化前体物供应、减少副产物积累等,实现了Neu5Ac的高效生产,在5 L发酵罐发酵56 h,产量达到77.12 g/L,为目前报道的最高生产水平[13]。然而,目前的研究中,尚无在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中从头合成Neu5Ac的相关报道。
酿酒酵母作为典型真核模式生物,具有遗传背景清晰、遗传操作简单和不生产毒素等优点[14-15],这使其成为构建微生物细胞工厂的理想底盘细胞。此外,酿酒酵母具有真核生物的细胞结构和蛋白质加工修饰系统,能够正确折叠和修饰表达真核生物蛋白,使其具有与天然蛋白相似的活性和功能。除此之外,酿酒酵母不仅能够对复杂的糖蛋白进行正确的糖基化修饰,其作为食品级安全菌株,长期应用于食品加工行业,这是原核生物底盘细胞难以实现的。鉴于这些优势,本研究尝试在酿酒酵母中构建Neu5Ac的生物合成路径。
本研究以酿酒酵母BY4741为出发菌株,首先将谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶编码基因GFA1、磷酸葡萄糖胺乙酰转移酶编码基因GNA1和来源于大肠杆菌的果糖-1-磷酸磷酸酶编码基因yqaB基因整合在酿酒酵母基因组上,并通过敲除竞争途径强化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)合成通路、调节关键酶表达量以增加前体供应,构建了一株可以从头合成Neu5Ac的菌株。以此菌株作为平台菌株,进一步引入异源表达合成Neu5Ac两个关键基因,并通过增加关键酶拷贝数,最终获得了以单一葡萄糖为碳源在摇瓶发酵96 h可产生158.5 mg/L Neu5Ac的工程酵母菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒
本研究所用的菌株与质粒信息详见表1。基因克隆与基因组编辑所用的引物信息见表2。
表1 本研究所用菌株
Table 1 Strains used in this study
菌株特征来源E.coli DH5αWildtype本实验室BY4741His3Δ1, Leu2Δ0, Met15Δ0, Ura3Δ0本实验室NAG1BY4741, YGR-204C::PTEF1-GFA1本研究NAG2NAG1, YCL-049C::PTPI1-GNA1本研究NAG3NAG2, YCL-001 W::PFBA1-yqaB本研究NAG4NAG3, ΔPFK27本研究NAG5NAG4, ΔPFK26本研究NAG6NAG5, GLO1::PTEF1-GFA1本研究NAG7NAG5, YPR-003C::PTPI1-GNA1本研究NAG8NAG6, YPR-003C::PTPI1-GNA1本研究NAG9NAG8, QDR1::PFBA1-yqaB本研究NEU1NAG9, 208a::PTDH3-age本研究NEU2NEU1, YHR142 W::PGPM1-neuB本研究NEU3NEU2, ADP1::PTDH3-age本研究NEU4NEU2, LPP1::PGPM1-neuB本研究NEU5NEU2, ADP1::PTDH3-age;LPP1::PGPM1-neuB本研究PlasmidspRS41-Cas9 NrsR, Cas9本实验室pRS42-gRNA HygR, gRNA本实验室
表2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物名称 序列(5'-3')长度/bpGFA1-FACTACAAAAAACACATACATAAACTAAAAATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAA 57GFA1-R TCATAAATCATAAGAAATTCGCCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGC 48YGR204C-UF ATGATAGATCTGAATGCAACACCG 24YGR204C-URAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATTGTTTTGCTTATTCCCATCTTCAT52YGR204C-DFGAAATAAGTAAACAATATATTGCTGCCTTTACAGGTCCTAAAGGATTTAGCCC53YGR204C-DRCAGTTTTTTGTTCTCAACAGGCC57GNA1-FACTACAAAAAACACATACATAAACTAAAAATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAA48GNA1-RTCATAAATCATAAGAAATTCGCCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGC 48YCL049C-UFTCTGCTTCTTCTACCAGGGGTC 22YCL049C-URCCAACCTGATGGGTTCCTAGATATATTTGAATACCAAAGCTGGACCAC48YCL049C-DFGTCCTCAGAGGACAAAATGTAGCGCTTGGTCCAGGT 36YCL049C-DRTTTCATATCCTAAAATTAAAGGGAAAATA29yqaB-FTATAACCATAACCAAGTAATACATATTCAAAATGTATGAAAGATATGCTGGTTTGA56yqaB-RTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTACAACAATCTAACATCAACAGCATC 50YCL001W-UFATTATGCTCCCCTGGATTTTATG23YCL001W-URCAAGCCAGCGGTGCCAGTTGGAGGATGGTATATTTTAAGACACAGCCT48YCL001W-DFACATATATTGGTCAATCGGTTTTAATTTCTTCTTTGCTACATATTGCTACCACT 54YCL001W-DR GCGGACATTAAGGACGAACAG21PFK27-UFCAAGTATTGCCCAAAAGACTACATG25PFK27-URCGAAACAAATTACCTTACGCGATAACTCCATCTACCTCCCGCC43PFK27-DFGGCGGGAGGTAGATGGAGTTATCGCGTAAGGTAATTTGTTTCG43PFK27-DRTATAGCGTATAGTAGGCACGTGGTAG26PFK26-UFTTAAACGTGACTTTGGCTGCG21PFK26-URGATAGTGGATCAAAGTTAGTGATTGTCATGATCTAATCCTACTTCTGCATCTTC54PFK26-DFGATGAAGATGCAGAAGTAGGATTAGATCATGACAATCACTAACTTTGATCCACT54PFK26-DRATGTTCAAACCAGTAGACTTCTCTGAA27
续表2
引物名称 序列(5'-3')长度/bpGLO1-UFTGATTGAACTTGTTACCTACTGAGCC26GLO1-URAAAAGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATTGATATCCCGTATTTCTAGTTAGTGACG 56GLO1-DF GAAATAAGTAAACAATATATTGCTGCCTTTAAAGCCCCTTGTTTATTCAGTGTC54GLO1-DR ATTGTCAACCCTAGCTAAGCCATAG25YPR003C-UFCGTTGTTATTTGCTTGCGCT 20YPR003C-URTCTTCCACCAACCTGATGGGTTCCTAGATATAGTTTTTGCTGTTACCTTCTGCAC55YPR003C-DF GGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAGGACAAAACTTTATGTCGCCTGGCACT50YPR003C-DRTTGGCGACTTTAGCATGGAC20QDR1-UF TCTCTTTCCGTCTAAGGCTTCTACC 25QDR1-UR TGTTCAAGCCAGCGGTGCCAGTTGGAAACGAATCTGTCACCAAGAAATGTC51QDR1-DF GACATATATTGGTCAATCGGTTTTAATTTGGAATGTGCTAGAATTAAAGGGGTA54QDR1-DR AGTACACCAGAGCATATTCAGTCAAGT 27age-FGCGGCCGCATGGGTAAAAACTTGCAAG27age-RCAATTTGAAGCTTTGTCTTAAGAATTC27208-age-UFGATTGGAAGGGTCTAGTCTATCAGC25208-age-URGAAATGGCAGTATTGATAATGATAAACTCGCTAGTATTTCTGATTTTGTTGCACTC56208-age-DFTGCCTGGACTGATTTTAAGTTGTTTGCTTTATAGTTAATGATCACGACGGC51208-age-DRCTATTAAAGAATAATTTTCGCAAGGTAC28neuB-FATGCAGAATAACAATGAATTTAAAATTG28neuB-RGCTCAAATTAAAAAAACTGATATTGAATAA30YHR142W-UFAAATTTTGGCAGTACTATTTAAAATGC27YHR142W-URAATCTTAAAGTCATACATTGCACGACTACAAAATCATGTATAATTGTTGAGTTCG55YHR142W-DFTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAGGAACGCATTCATAAATATTGGTG51YHR142W-DRCTACCAATAGGGATACCAGTAATTGACA28ADP1-UFGTCTTGAGTTGAAGTCAGGAATCTA25ADP1-URGAAATGGCAGTATTGATAATGATAAACTCCAGAGAGCAATCATCACCTGC50ADP1-DFGCCTGGACTGATTTTAAGTTGTTTCCCATAAGAGCACAAAATGACAC47ADP1-DRCCCTTAGCACCACACAACAC20LPP1-UFGGAGGTCAGGTATACATCTATCAACAA27LPP1-URAATCTTAAAGTCATACATTGCACGACTACTACTTTCAGTACATGATAATTGGTCTATG58LPP1-DFTCGAATAAACACACATAAACAAACAAACGTTGATGTAGGAGTTTCTCACTCTT53LPP1-DRGAGATTTATTGTTGGCAACTTTCTTAC27
1.1.2 主要试剂
限制性内切酶、Primer STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶,TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、Cycle Pure Kit D6492试剂盒、Gel Extraction Kit D2500试剂盒,Omage生物科技有限公司;酿酒酵母质粒提取盒,北京索莱宝生物科技有限公司;基因、引物合成及测序,苏州金唯智生物科技有限公司。
1.1.3 主要培养基配方
LB培养基(g/L):酵母粉5,蛋白胨10,NaCl 5。使用去离子水超声定容后,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
YPD培养基(g/L):酵母粉10,蛋白胨20,葡萄糖20,使用去离子水超声定容后,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
合成完全培养基(synthetic complete,SC)(g/L):葡萄糖20,无氨基酵母氮源6.7,DO Supplement-Ura 2,尿嘧啶0.02。用去离子水超声定容后,115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
GE041-B PCR扩增仪,厦门亿辰科技有限公司;TGL-12R-台式高速冷冻离心机,山东百欧医疗科技有限公司;SPX-100 标准型生化培养箱,上海赛伦生物技术股份有限公司;U3000高效液相色谱仪,美国Thermo公司;UV-6000紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 gRNA质粒构建
利用chopchop(https://chopchop.cbu.uib.nohttps//chopchop.cbu.uib.no/)选择待整合/敲除位点附近的PAM序列(5′-NGG-3′),并通过合成线性化引物将相应的20 bp的gRNA序列引入单链DNA中,之后通过PCR退火形成双链片段。将双链片段与线性化gRNA载体按照同源重组连接反应体系(2 μL 5×CEⅡ Buffer, 50～200 ng gRNA载体,50～200 ng目的双链目的片段,1 μL Exnase®Ⅱ重组酶,ddH2O,5 μL)化转至E.coli DH5α感受态中,筛选阳性克隆并提取质粒。
1.3.2 酵母基因组提取
将酿酒酵母接种到YPD摇管中,30 ℃、220 r/min振荡培养24 h。将菌体转移至2 mL离心管中,12 000 r/min条件下,收集菌体。在离心管加入约与菌体量等同的石英砂、200 μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-EDTA buffer,TE)、200 μL破菌缓冲液、200 μL酚氯仿,振荡涡旋10 min,13 000 r/min收集菌体,取上层清液于1.5 mL EP管中,即为提取到的基因组。加入1 mL无水乙醇,颠倒振荡,离心3 min,放入37 ℃烘箱烘干至无酒精味,加入50 μL去离子水,测浓度即可。
1.3.3 重组菌株的构建
本研究利用酿酒酵母内源性同源重组机制,将外源基因整合到基因组中,以NAG1菌株的构建为例。
同源臂及表达框扩增:本研究采用SnapGene软件设计针对YGR-204c位点的引物,包括上游同源臂引物(YGR204C-UF和YGR204C-UR)、下游同源臂引物(YGR204C-DF和YGR204C-DR),以及目的基因GFA1的特异性引物(GFA1-F和GFA1-R)。在构建过程中将组成型启动子PTEF1置于GFA1基因上游,终止子TTDH1置于GFA1基因下游以实现目的基因的有效表达。随后,以酿酒酵母BY4741基因组为模板,扩增上下游同源臂、启动子、终止子及目标基因片段。最后,利用重叠PCR将扩增片段拼接,构建完整的供体DNA片段。
酿酒酵母转化:根据七号染色体基因位点YGR-204C序列寻找合适的靶序列,利用同源重组,将合成后的片段整合到gRNA上。将构建好的gRNA与转化大片段通过酿酒酵母醋酸锂转化法[16],转入BY4741感受态中。
阳性克隆筛选:转化子孵育完成后,使用无菌水洗2次,并将其涂布在相应抗性平板上,30 ℃恒温培养2～3 d,获得单菌落。通过酵母菌落PCR验证,获得阳性菌株,即为NAG1重组菌株。
1.3.4 摇瓶发酵
在无菌条件下,从-80 ℃冰箱保菌管中取50～100 μL菌液,接种到含YPD培养基的摇管中,30 ℃摇床培养24 h后,以原始OD600nm值约为0.1转接至装有50 mL种子培养基的500 mL圆底三角瓶中,用9层纱布封口,在30 ℃、220 r/min条件下培养12 h。种子培养基成分为:葡萄糖20 g/L,无氨基酵母氮源6.7 g/L,DO Supplement-Ura 2 g/L,尿嘧啶20 mg/L,消泡剂1滴。将培养好的种子培养液按10%～15%接种量接种到50 mL SC发酵培养基中,30 ℃、220 r/min条件下培养至发酵结束。
1.3.5 发酵液中各成分的的测定方法
本研究采用HPLC对发酵液中GlcNAc、Neu5Ac、葡萄糖等组分进行测定分析。所用色谱柱为Aminex®HPX-87H色谱柱(7.8 mm×300 mm);检测器为RID-20A折光率检测器;流动相为5 mmol/L硫酸溶液;柱温设定37 ℃,时间设定30 min,流速设定0.5 mL/min。测定前首先配制不同梯度的色谱级标准品溶液(线性范围在0.05～1 g/L),按照上述方法测定出各物质对应的峰面积,根据浓度关系绘制各检测成分的标准曲线。测定时,将待测样品于13 000 r/min下离心,取上清液,稀释至合适浓度后用0.22 μm滤膜过滤至液相瓶中,最后进行检测。
1.4 数据统计学分析
发酵数据代表3组平行发酵数据的平均值与标准差。利用t检验双尾分布对2组发酵数据进行单向方差分析。当0.01<P<0.05时用“*”标示,表示数据差异显著;当P<0.01时用“**”标示,表示数据差异极显著。
2 结果与分析
2.1 在酿酒酵母中从头构建GlcNAc途径
2.1.1 前体物GlcNAc合成途径的构建
在酿酒酵母GlcNAc合成途径中,2个关键的酶是谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶和磷酸葡萄糖胺乙酰转移酶[17]。酿酒酵母从头合成Neu5Ac,以果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate,F-6-P)为起始前体物(图1)。为了实现目标产物的高效合成,需要强化GlcNAc合成通路。在GlcNAc合成途径中,一方面F-6-P在6-磷酸果糖激酶作用下生成1,6-二磷酸果糖(F-B-P)进入糖酵解途径,并生成前体物质PEP;另一方面F-6-P在谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶作用下生成GlcN6P,磷酸葡萄糖胺乙酰转移酶将6-磷酸氨基葡萄糖转化成GlcNAc-6P。同时整合GFA1与GNA1使菌株具有一定的生产GlcNAc的能力,但产量过低。DENG等[18]在大肠杆菌中过表达果糖-1-磷酸磷酸酶,使得GlcNAc产量获得巨大提升。此外,LEE等[19]通过将大肠杆菌来源的yqaB基因引入酿酒酵母中,显著促进了GlcNAc-6-P去磷酸化为GlcNAc。上述研究表明,大肠杆菌来源的yqaB基因对产物的合成有着较为明显的影响。因此为了进一步提高GlcNAc合成效率,本研究尝试引入大肠来源的果糖-1-磷酸磷酸酶,以催化GlcNAc-6P生成GlcNAc从而提高酿酒酵母生产GlcNAc的能力。
图1 酿酒酵母中Neu5Ac合成代谢途径
Fig.1 The synthetic metabolic pathway of Neu5Ac in S.cerevisiae
注:葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphatase,G-6-P);果糖-2,6-二磷酸(fructose 2,6-biphosphate,F-2,6-BP);葡萄糖胺-6-磷酸(glucosamine 6-phosphate,GlcN-6-P);N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(N-acetylglucosamine 6-phosphorus,GlcNAc-6-P);N-乙酰氨基葡萄糖-2-异构酶(N-acetylglucosamine-2-isomerase,AGE);N-乙酰甘露糖(N-acetylmannose,ManNAc);1,6-二磷酸果糖(fructose 1,6-bisphosptase,F-1,6-P);甘油-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate,G-3-P);二羟丙酮磷酸(glycerone-phosphate,Glycerone-P);葡萄糖-1,3-磷酸(glycerate-1,3-biphosphate,G-1,3-P);磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid,PEP)
本研究在出发菌株BY4741中,依次进行了GFA1、GNA1和yqaB基因的整合(途径构建流程如图2-a所示),得到了NAG1、NAG2和NAG3菌株。并以BY4741出发菌株作为对照,对4株菌株进行96 h 摇瓶发酵测试,结果如图2-b所示。尽管出发菌株BY4741中存在内源性GFA1和GNA1基因,但其自身并没有生产分泌GlcNAc的能力。GFA1基因编码的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶作为GlcNAc合成途径中关键限速酶,通过强启动子过表达了GFA1基因,以确保将中心碳代谢流拉向GlcNAc合成途径。如图2-b所示,只有在同时过表达了GNA1基因后,在菌株NAG2中才检测到目标产物GlcNAc的积累,产量为32 mg/L,说明内源性GFA1与GNA1基因编码的酶具有活性,但需要依赖一定表达强度才能积累目标产物GlcNAc。同时也说明酿酒酵母BY4741中存在发挥相应功能的脱磷酸酶。进一步过表达yqaB基因的NAG3菌株将GlcNAc的产量提高到53 mg/L,相比于NAG2菌株,产量提高了65.63%,由此可见,大肠杆菌来源的yqaB基因具有良好的脱磷酸基团功能。
a-酿酒酵母中GlcNAc合成构建示意图;b-合成途径构建对细胞生长与GlcNAc合成的影响
图2 前体物GlcNAc合成途径的构建
Fig.2 Construction of the precursor GlcNAc pathway
注:图中“-”表示基因未整合,“+”表示基因整合(图4-a同);“**”表示均在P<0.01水平上显著(下同)。
2.2 强化GlcNAc合成途径
2.2.1 6-磷酸果糖-2-激酶编码基因PFK26/PFK27的敲除及其影响
如图2-a所示,GlcNAc的生物合成直接与中心碳代谢存在前体物竞争关系,细胞生长代谢所消耗的葡萄糖严重限制了GlcNAc的产量。F-6-P不仅是合成GlcNAc的关键前体,同时也是F-2,6-BP的前体物质,其在糖酵解过程中也起着重要作用[20]。果糖-2,6-二磷酸激酶是糖酵解的关键调控酶,能够将果糖-6-磷酸果糖合成F-2,6-BP[21]。而在酿酒酵母中果糖-2,6-二磷酸激酶由同工酶基因PFK26、PFK27进行控制。
为了进一步提高GlcNAc合成的转化率,以NAG3作为出发菌株,分别依次进行了果糖-2,6-二磷酸激酶编码基因PFK26、PFK27的敲除,依次得到了NAG4和NAG5重组菌株。经过摇瓶发酵测试,NAG5表现出最优的GlcNAc合成能力,摇瓶产量达到88 mg/L,相较于NAG3菌株增加了66.1%;而只敲除PFK26的重组菌株NAG4,其摇瓶产量只有73 mg/L,相比于NAG3菌株仅增长了37.7%(图3-a)。这一结果表明,只敲除一个同工酶编码基因,细胞内的6-磷酸果糖-2-激酶仍然发挥作用,与合成GlcNAc通路形成竞争,进而影响GlcNAc的生物合成。
a-通过消除分支代谢途径提高N-GlcNAc产量;b-关键基因的拷贝数优化
图3 强化前体物GlcNAc合成途径
Fig.3 Strengthen the synthetic pathway of the precursor GlcNAc
注:“-”表示基因未敲除,“o”表示基因敲除,“×1”表示一个拷贝,“×2”表示双拷贝“*”表示均在P<0.05水平上显著(下同)。
2.2.2 关键基因的组合优化
组合优化策略包括在DNA水平上改变基因拷贝数,在mRNA水平上通过控制转录输出和转录稳定性,在蛋白质水平上改变蛋白质稳定性和蛋白质共定位,在代谢物水平上调控动态代谢流量[22]。因此,本研究选择在DNA水平上增加基因拷贝数来进行组合优化策略。
在NAG5中已经成功构建了完整的GlcNAc代谢通路,并鉴定出3个基因作为GlcNAc合成的关键基因:GFA1、GNA1和yqaB。通过增加目标基因的细胞内拷贝数,使更多蛋白参与酶促反应,是增强代谢通路效率常用且有效的策略之一[23]。本研究通过增加上述关键基因的拷贝数提高GlcNAc产量。通过CRISPR-Cas9技术,在菌株NAG5的GLO1位点和YPR-003C位点分别整合GFA1和GNA1构建菌株NAG6和NAG7。摇瓶测试结果表明,NAG6和NAG7菌株的产量分别达到105.3 mg/L和108.3 mg/L,与未改造的NAG5菌株相比分别提高了16.7%和20%(图3-b)。另外,对于细胞生长来说,菌株NAG5、NAG6和NAG7的OD600nm值分别为10.4、8.5、9.2。相对于NAG5菌株,多拷贝GNA1基因的菌株NAG7对生长的影响较小,进而在YPR-003C位点整合GNA1构建菌株NAG8,其产量显著提高至136 mg/L,相比NAG5菌株增加了51.1%。
此外,当3个基因在NAG9菌株中同时过表达时,对菌株NAG9进行摇瓶发酵,GlcNAc产量进一步提升至142.5 mg/L,比NAG5菌株高出1.62倍,表明通过组合过表达关键酶可以显著增强GlcNAc的合成能力,为后续的代谢工程改造奠定了基础。
2.3 在酿酒酵母中从头合成Neu5Ac
在age和neuB的作用下由GlcNAc合成Neu5Ac是最主要的合成途径[24]。GlcNAc在N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的催化下转化为N-乙酰甘露糖胺(N-acetylmannosamine,ManNAc),随后在Neu5Ac合成酶的催化下与PEP合成Neu5Ac。在本团队前期研究中,通过在大肠杆菌中引入集胞藻(Anabaena sp.CH1)来源的age与脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)来源的neuB基因,实现了Neu5Ac的高效合成。
本研究通过在GlcNAc合成菌株NAG9中依次引入上述来源的age和neuB基因,分别得到菌株NEU1和NEU2,成功实现了Neu5Ac的从头合成。本研究以葡萄糖作为单一碳源对NAG9菌株以及打通合成Neu5Ac途径的NEU1和NEU2菌株进行摇瓶发酵测试,培养96 h,对发酵液进行HPLC分析,结果如图3-a所示:菌株NEU1和NEU2中均检测到Neu5Ac物质,NEU1和NEU2菌株的Neu5Ac产量分别达到17.7 mg/L和73 mg/L,GlcNAc产量分别达到119 mg/L和109 mg/L。这一结果表明,关键基因neuB的表达对提高合成Neu5Ac的合成效率有着显著影响。
由于在发酵液中仍然检测到前体GlcNAc的剩余,表明其糖基化过程有待进一步提高。推测该现象可能源于关键酶的催化效率供给不足,因此,本研究继续针对age和neuB这2个关键基因进行优化。为了进一步提高Neu5Ac产量,在菌株NEU2中分别进行N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构基因age和Neu5Ac合成基因neuB的双拷贝过表达以及二者的同时双拷贝过表达,依次得到了NEU3、NEU4和NEU5菌株。以葡萄糖为碳源,进行摇瓶发酵。从图4-b可以看出,菌株NEU3中age基因的过表达在相同碳源条件下对菌体的生长与Neu5Ac生产都影响不大,与先前只过表达一个age基因表达所发挥作用相一致。与对照菌株NEU2相比,neuB的双拷贝过表达(菌株NEU4)对菌株合成Neu5Ac有一定的影响,发酵96 h,Neu5Ac产量达到125 mg/L,说明neuB基因在Neu5Ac代谢合成途径方面具有显著作用。而关键基因age和neuB两者同时双拷贝的NEU5菌株,Neu5Ac产量提高到158.5 mg/L,进一步说明增加关键基因的拷贝数能够提高Neu5Ac的产量。然而,菌株NEU5的生物量低于菌株NEU4,可能增加基因的拷贝数会给菌株的正常生长带来一定的负担。此外,NEU5菌株中仍有少量GlcNAc的剩余,而NEU5菌株Neu5Ac的产量较NEU4菌株提升明显,推测PEP供给不足,后续可继续调控PEP充分供应,平衡前体物GlcNAc与PEP的供应与消耗。
a-从N-乙酰氨基葡萄糖合成Neu5Ac;b-优化拷贝数对Neu5Ac产量的影响
图4 在酿酒酵母中从头合成Neu5Ac
Fig.4 De novo synthesis of Neu5Ac in S.cerevisiae
注:“++”表示该基因整合2个拷贝数。
3 讨论
作为SAs家族中的核心成员,Neu5Ac以其独特的生物学功能与多元的应用场景,在功能性食品、医药研发及化妆品制造等领域展现出非凡的应用潜力。根据市场调研数据所揭示,Neu5Ac在医药领域的市场份额约占唾液酸总需求的46%,食品领域占据29%的份额,而化妆品与其他领域则分别贡献了15%与10%的市场需求[25]。唾液酸的全球市场规模在2024年已跃升至5.6亿美元,且预计将以7.5%的复合年增长率稳健前行,至2033年有望突破10.8亿美元大关[26]。这一数据不仅彰显了Neu5Ac在多领域的广泛应用,也预示着Neu5Ac高效生产技术的迫切需求与广阔前景。随着合成生物学与系统代谢工程等前沿技术的发展,微生物发酵技术因具有操作简单、易于控制、成本低效益好等优点,成为生产Neu5Ac的主要方法。
目前,一些微生物已经被系统代谢基因工程改造用于生产Neu5Ac。DANG等[26]对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌利用代谢工程生产Neu5Ac的研究进展分析发现,大肠杆菌凭借其生长速度快、发酵用时短、基因编辑系统完善的优势,成为发酵合成Neu5Ac最常用的宿主。然而,大肠杆菌高密度发酵仍存在明显的瓶颈,即内毒素容易释放到发酵液中,导致产品污染[27]。而枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性模式菌,无致病性,不含内毒素,是公认的食品安全菌株,这些特性使其成为重要的发酵工业菌株。此外,在大肠杆菌中的Neu5Ac产量已经达到了报道的最高水平77.12 g/L[13],超过枯草芽孢杆菌的30.10 g/L[12],这种差异可能一方面源于上述2种宿主细胞本身的生长和代谢的差异,另一方面是SUN等[13]用非磷酸转移酶系统(non-phosphotransferase system,non-PTS)系统替代了大肠杆菌自身的PTS葡萄糖转运方式,从而避免了在底物摄取过程中消耗PEP,增加了PEP在胞内的可用量。相比之下,酿酒酵母不仅使用不同的糖转运机制,不会大量消耗PEP,还拥有非常强大的糖酵解途径,能够产生大量的PEP,为Neu5Ac的合成提供了更充足的前体池。再者,生产的Neu5Ac通常积累在胞内或周质空间中,需经过细胞破碎才能释放,且对于大肠杆菌而言,细胞破碎会释放大量内毒素,严重污染产品。而酿酒酵母作为真核生物,它具有将特定代谢物分泌到胞外的天然能力,可通过基因工程改造,使酿酒酵母将合成的Neu5Ac主动分泌到发酵液中。
本研究通过构建酿酒酵母微生物细胞工厂,首次实现了以葡萄糖为单一碳源的发酵法合成Neu5Ac。首先以一株酿酒酵母BY4741作为出发菌株,通过关键酶的密码子优化、多拷贝整合提升表达量、减少支路碳流竞争、引入Neu5Ac合成途径和优化前体物供应等策略实现了从头合成Neu5Ac。结果表明,在酿酒酵母中引入GFA1和GNA1基因能催化合成前体GlcNAc,进一步过表达yqaB基因,菌株NAG3合成GlcNAc的产量达到53 mg/L。为协调菌体生长与生产,对菌株NAG3中6-磷酸果糖-2-激酶基因PFK26/PFK27进行敲除可进一步提升GlcNAc产量。结合多拷贝整合,菌株NAG9合成GlcNAc产量提高至142.5 mg/L。通过引入AGE途径实现了Neu5Ac从头合成,摇瓶发酵96 h生产73 mg/L Neu5Ac。最后,通过增加age和neuB拷贝数将Neu5Ac产量提高到158.5 mg/L,相比优化前提升了53.9%。但随着在菌株NAG9中引入age与neuB基因,生长出现明显下降,且在菌株培养过程中,双拷贝菌株的生长比单拷贝菌株相对缓慢,导致这种现象的原因可能是该合成途径直接与中心碳代谢竞争关键前体物F-6-P与PEP,过强的合成途径基因表达会直接影响细胞生长。因此,在后续的研究中,本课题组将通过精细化调控关键基因表达,如采用动态调控方式调节细胞代谢,利用生长偶联型启动子控制相关基因表达,动态调控生长与生产之间的平衡,优化PEP在细胞生长与产物合成中的平衡分配,进一步提升Neu5Ac的合成效率。尽管本研究成功实现了在工程化酿酒酵母中从头合成Neu5Ac,但最终产量仍难以满足工业化需求,后续可以针对PEP途径和Neu5Ac途径进行进一步优化并推动Neu5Ac的微生物合成向工业化应用迈进。
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