黄蘑菇,学名黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens),又名皇菇、黄环菌、金蘑菇,是青藏高原独特的地理环境和多样气候条件下孕育的特色菇种,是与牧草共生的菌根菌[1],一般生长在海拔3 000～4 300 m的高山草甸或草地上。黄蘑菇目前仍为野生资源,尚未实现人工栽培[2],野生黄蘑菇不仅菌肉肥厚、口感鲜嫩,而且富含氨基酸、多肽、蛋白质、维生素、挥发油、菌类多糖及多种微量元素等营养与活性组分。研究表明,其菌丝和发酵液具有与天麻相似的功效和药理作用,同时具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤活性[3],属珍贵的药食同源真菌。新鲜黄蘑菇采后生理代谢旺盛,若未能及时采取有效的保鲜措施,极易出现失水萎蔫、组织软化和微生物腐败等质量问题,严重限制其流通与综合利用[4]。脱水干制处理可显著延长黄蘑菇的贮存时间,并降低运输成本,是一种常用的加工保藏方式。然而,该处理在延长保质期的同时,也可能引发诸如褐变等品质下降问题。褐变反应不仅直接影响黄蘑菇的外观品质,还可能加速其他品质的下降,如营养成分的损失和风味的改变。因此,探索干燥过程中黄蘑菇的褐变机制并制定有效的抑制策略,对于提升其贮藏稳定性、加工品质及商业价值具有重要的理论与应用意义。国内外关于黄绿蜜环菌及近缘食药用真菌的研究多聚焦于活性成分解析与功能评价[5],报道其多糖、肽类与挥发性组分具有显著抗氧化[6]、免疫调节[7]与抗肿瘤潜力;然而,针对其采后品质劣变与加工适宜性,尤其是干制过程中褐变机理的系统性研究仍显不足。
干燥过程中的褐变主要包括酶促与非酶两大类。酶促褐变关键酶包括多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninamonia-lyase, PAL)等[8],其中PPO是果蔬褐变主要调控酶,可使酚类物质催化氧化形成黑色褐变产物[9];POD在H2O2或衍生物存在下催化酚类底物发生聚合反应形成黑棕色物质,可与PPO协同作用引起组织褐变[10]。PAL是苯丙烷类物质代谢途径中重要限速酶[11],也是植物通过苯丙烷途径合成酚类化合物的关键合成酶,通过调控该途径催化生成褐变底物酚类化合物间接参与酶促褐变反应。总酚为多酚氧化酶酶促褐变的主要底物。将总酚变化与颜色参数变化进行相关性分析,可识别酶促褐变是否为主导路径。
非酶褐变是一个无酶催化的反应过程,其反应机制复杂,涉及多个中间产物。反应类型主要包括美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸降解反应和多元酚氧化缩合反应[12]。美拉德反应指的是在还原糖的羰基与蛋白质、肽或氨基酸的游离氨基的存在下形成羰氨反应,最后经过一系列重排、脱水、缩合及聚合反应生成黑褐色美拉德产物[13]。还原糖作为美拉德反应的关键羰基供体[14],其水平直接决定非酶促褐变的底物负荷;干燥升温与细胞结构破裂可促使糖类释放,监测其变化有助于判断中后期是否存在美拉德反应增强的趋势。总氨基酸的高低决定美拉德反应氨基供体的可及性与供给强度[15],并与还原糖的协同变化可用于评估非酶促褐变的反应驱动力。可溶性蛋白含量反映蛋白变性与水解过程。干燥加热可致蛋白变性与水解,释放更多游离氨基,间接提高美拉德底物可及性;维生素C在无氧和有氧条件下易发生降解反应,经降解产生的酮木糖或二羰基化合物可作为美拉德反应的中间产物参与反应生成还原酮和糠醛等小分子物质。维生素C的快速损耗常指示抗氧化屏障削弱,并可能伴随中后期褐变途径的转强。酚类化合物是果蔬褐变关键物质,对果蔬褐变作用除了作为酶促褐变反应底物外,还可通过自身氧化缩合反应诱导褐变发生[16]。其结构易被氧化成邻醌,而邻醌物质不稳定,易与蛋白质等聚合生成褐色物质,导致褐变发生。
为探究不同干燥处理方式对青海黄蘑菇褐变行为的影响及机制,本文分别采用25 ℃控温风干(temperature controlled drying,TCD,常温)、60 ℃热风干燥(hot air drying,HAD,高温)及-53 ℃真空冷冻干燥(vacuum freeze drying,VFD,低温)3种工艺处理新鲜黄蘑菇样品,对比分析不同处理组的褐变差异及其内在成因,为制定高效褐变控制策略奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄蘑菇,采自青海祁连县;POD活力检测试剂盒、PAL活力检测试剂盒、维生素C含量检测试剂盒、总氨基酸含量检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;考马斯亮蓝(G250)、福林酚试剂、没食子酸标准品,北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐缓冲液,平根科技有限公司;标准蛋白质溶液,伊势久生物科技有限责任公司;邻苯二酚、3-5二硝基水杨酸、碳酸钠,均为分析纯,青海莱茵尔生物科技有限责任公司;
1.2 仪器与设备
DHG 9070 A电热鼓风干燥箱,上海-科学仪器有限公司;ADCI-60-C测色色差仪,北京辰泰克仪器技术有限公司;THZ-103 B恒温摇床,上海一恒科学仪器有限公司;Coolsafe 55-9 Coo1S冷冻干燥机,Gene Company Limited基因有限公司;UV 1780全波长计紫外分光光度,岛津仪器(苏州)有限公司;H/T 16 MM台式高速离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;*JSM-6610LV扫描电子显微镜,JEOL LTD日本电子。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
原材料的准备:新鲜黄蘑菇采用干冰保鲜运输至实验室后,筛选出菇体完整、菇盖未开伞、无病虫害、无机械伤的黄蘑菇用于实验,以避免因暴露表面积不同而产生的实验误差。对筛选好的新鲜黄蘑菇进行清洗,然后用纸吸干表面水分后用于实验。
HAD:从已完成初步筛选的黄蘑菇中,进一步挑选出大小均匀、颜色均一的个体,将挑选好的新鲜黄蘑菇均匀摆放至托盘上,再放置鼓风干燥箱网盘上。干燥温度为60 ℃、风速为1 m/s、装载量约为2.5 kg/m3;干燥过程中,每间隔3 h随机选取15个黄蘑菇样本,迅速放入-80 ℃冰箱冷冻保存,以备后续相关生理生化指标的测定。干燥过程持续到黄蘑菇达到恒重为止。21 h后完成干燥。
TCD:将挑选好的新鲜黄蘑菇个体均匀摆放至托盘上,再放置恒温摇床的网盘上,调节温度为25 ℃、转速为0 r/min、风速为1 m/s、装载量约为2.5 kg/m3,然后每间隔6 h随机选取15个黄蘑菇样本,迅速放入-80 ℃冰箱冷冻保存,以备后续相关生理生化指标的测定,干燥过程持续到黄蘑菇达到恒重为止。48 h后完成干燥。
VFD:将挑选好的新鲜黄蘑菇均匀摆放至托盘上,再放入-80 ℃冰箱中预冷12 h,然后迅速放入冻干机的搁板上,冷阱温度为-53 ℃、真空度为0.1 MPa、装载量约为2.5 kg/m3。然后每间隔6 h随机选取15个黄蘑菇样本,迅速放入-80 ℃冰箱冷冻保存,以备后续相关生理生化指标的测定。干燥过程持续到黄蘑菇达到恒重为止。24 h后完成干燥。
磨粉:将定期采集的黄蘑菇样品在液氮条件下研磨成均匀粉末,最后用80目筛进行过筛处理。
1.3.2 指标测定
1.3.2.1 干基含水率
含水量的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,按公式(1)计算干基含水率。
干基含水率
(1)
式中:mt,t时刻样品的质量,g;m,样品干物质的质量,g。
1.3.2.2 干燥速率
干燥速率计算如公式(2)所示:
(2)
式中:DR,干燥速率,g/(g·h);Mt1、Mt2,干燥到t1和t2时刻样品的干基水分含量,g/g。
1.3.2.3 色差
采用自动色差计测定,结果采用L*值、a*值、b*值和色差ΔE值表示。每组样品平行测定3次,总色差值ΔE按公式(3)计算:
(3)
式中:L*、a*、b*,样品干燥后的色泽值;L0、a0、b0,鲜样的色泽;ΔE,处理样品与新鲜黄蘑菇之间的总色差值,值越小表示黄蘑菇色泽与鲜样之间的变化越小。
1.3.2.4 扫描电镜
将样品均匀平铺于贴有导电胶的扫描电子显微镜样品座上,喷金处理,于加速电压10.00 kV下对样品进行扫描,放大250、3 000、5 000倍观察样品微观结构[17]。
1.3.2.5 褐变度的测定
参考朱莉莉等[18]的方法,并略作修改。准确称取0.25 g样品置于10 mL离心管中,加入95%(体积分数)乙醇5 mL,涡旋使粉末安全溶解后静置提取1 h。过滤后以8 000 r/min离心20 min,取上清液,5倍稀释,在420 nm测定吸光度,以A420nm表征褐变度。
1.3.2.6 PPO活性测定
参照闵照永[19]的方法并稍作改动。准确称取样品0.5 g,加入磷酸盐缓冲溶液5 mL(pH 6.5,0.1 mol/L),涡旋振荡至粉末完全溶解后,放入冰箱(温度为4 ℃)浸提12 h。然后将提取液分装离心管调平后放入离心机中分离(转速为4 000 r/min,时长为15 min)即得到粗酶液。取分离后的上清液1 mL与4 mL的磷酸盐缓冲液混合均匀并水浴(温度为37 ℃)3 min后,再加入1 mL的邻苯二酚溶液(0.1 mol/L),继续水浴15 min后置于紫外可见分光光度计中在420 nm波长处测定吸光值。PPO活性计算如公式(4)所示:
(4)
式中:X,样品中多酚氧化酶的活力,U;A,吸光度;0.001为活力单位换算系数;m,样品质量,g;t,反应时间,min。
1.3.2.7 POD活性测定
采用POD活力检测试剂盒测定。
1.3.2.8 PAL活性测定
采用PAL活力检测试剂盒测定。
1.3.2.9 还原糖含量
参照曾志恒等[20]的方法并稍作改动。
标准曲线的绘制:取7支25 mL干净的刻度比色管,编号为0～6,分别加入1.0 g/L葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,补加蒸馏水至2.0 mL,然后分别加3,5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL,将各管摇匀,沸水浴5 min,取出后立即放人盛有冷水的烧杯中冷却至室温,以蒸馏水定容。在540 nm波长下,以0号管进行调零,测定各管的吸光值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标,以吸光度值为纵坐标得到标准曲线y=0.362 2x+0.052 3,R2=0.999。
准确称取0.6 g样品置于15 mL刻度试管中,加入5 mL(50 ℃)预热水研磨后涡旋振荡至粉末完全溶解,然后再补预热水至10 mL,50 ℃水浴15 min,使还原糖充分浸出。取出冷却后,过滤浸提液,将过滤液分装离心管调平后放入离心机中分离(转速为5 000 r/min,时长为10 min),然后用4.0 mL蒸馏水洗残渣,再次离心,将2次离心的上清液全部收集在25 mL容量瓶中,用蒸馏水定容,作为待测液备用。取2.0 mL还原糖待测液,其他步骤同上。根据标准曲线计算样品中还原糖的含量。
1.3.2.10 总酚含量
参照高锦运等[21]的方法并稍作改动。
绘制标准曲线:分别精密移取1 mg/mL没食子酸标准品溶液0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 mL于9个容量为25 mL的棕色容量瓶中,依次加入1.0 mL去离子水和2.0 mL福林酚试剂,静置3 min后加入150 g/L碳酸钠溶液2.4 mL,迅速用去离子水定容,混匀后于45 ℃水温箱中避光显色70 min。以不加样品的混合液为空白对照,于765 nm波长处测定溶液吸光度,以没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标,以吸光度值为纵坐标得到标准曲线y = 0.117 0x+0.022 8,R2=0.998 4。
准确称取样品0.5 g于10 mL离心管中,加入50%乙醇溶液4 mL后涡旋振荡至粉末完全溶解,然后再水浴浸提45 min(45 ℃),将浸提液调平后放入离心机中分离(转速为3 000 r/min,时长为3 min)。收集上清液于50 mL容量瓶中,在沉淀中加入50%乙醇溶液3 mL再浸提2次。合并3次滤液于50 mL容量瓶中,用50%乙醇溶液定容即为总酚待测液。准确吸取1.0 mL待测液,其他步骤同上。根据标准曲线计算样品中总酚的含量。
1.3.2.11 可溶性蛋白含量
参照张军等[22]的方法并稍作改动。
标准曲线的制备:取6支干净的25 mL刻度比色管,编为0～5号,分别准确加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 100 μg/mL的标准蛋白质溶液,然后分别补加蒸馏水至1.0 mL,摇匀,然后各加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250溶液,充分混匀,避光静置2 min,以0管为对照,测定在595 nm波长处的吸光度,以标准蛋白质质量浓度(μg/mL)为横坐标,以吸光度值为纵坐标得到标准曲线y=0.012 4x+2.036 0,R2=0.996 6。准确称取样品0.25 g,加入5 mL蒸馏水后涡旋振荡至粉末完全溶解,将混合液调平后放入离心机中分离(转速为5 000 r/min,时长为10 min)。将得到的上清液稀释10倍,吸取1.0 mL后摇匀,其他步骤同上。根据标准曲线计算样品中可溶性蛋白的含量。
1.3.2.12 维生素C含量
采用维生素C含量检测试剂盒测定。
1.3.2.13 总氨基酸含量
采用总氨基酸含量检测试剂盒测定。
1.4 数据处理与分析
实验均重复3次,采用Excel 2019统计数据、SPSS 27.0分析显著性、Origin 2024、GraphPad Prism 10软件作图。实验结果表示为“平均值±标准差”。
2 结果与分析
2.1 不同干燥方式对黄蘑菇干燥特性的影响
2.1.1 不同干燥方式对黄蘑菇的外观的影响
不同干燥方式对黄蘑菇外观的影响如图1所示,不同干燥方式对样品颜色的影响存在显著差异。HAD处理组样品初期呈浅黄色,6 h后色泽逐渐加深,至9 h时发生明显褐变,12～24 h进一步转变为深褐色,并伴随硬痂形成[23],其褐变速率最快、程度最深。TCD处理组样品初始同样为浅黄色,3～6 h逐渐转为橙黄色,9 h后开始向棕色过渡,15 h出现显著褐变,最终于12～24 h形成棕褐色,且样品至24 h时仍保持松软状态。该过程褐变进展较为缓慢,色泽变化呈明显的阶段性特征。相比之下,VFD处理组样品在0 h呈鲜黄色,自3 h直至24 h始终保持浅黄色调,色泽稳定、形态完整,几乎未发生可视的褐变现象。
图1 不同干燥方式对黄蘑菇外观的影响
Fig.1 Effect of different drying methods on the appearance of A.luteo-virens
2.1.2 不同干燥方式对黄蘑菇的微观结构的影响
不同干燥方式对黄蘑菇微观结构的影响如图2所示。VFD组样品呈现清晰的层状结构,壁薄光滑,褶皱浅,结构完整性较好。这得益于冻干过程中水分冻结升华机制,冰晶对细胞结构破坏小,利于维持多孔舒展形态。TCD组样品呈片状团聚,边界模糊,孔隙稀少,褶皱分布不均,这可能由于风干过程中水分缓慢蒸发形成的浓度梯度促使溶质迁移和颗粒聚集,同时内应力导致结构开裂。
图2 不同干燥方式对黄蘑菇的微观结构的影响
Fig.2 Effect of different drying methods on the microstructure of A.luteo-virens
HAD组样品团聚明显,孔隙狭小不规则,局部坍塌,褶皱深乱,可能因高温快速脱水引起细胞急剧收缩,导致结构塌陷。
2.1.3 不同干燥方式对黄蘑菇尺寸大小的影响
不同干燥方式对黄蘑菇尺寸大小的影响由图3所示。3种不同干燥方式下,黄蘑菇的菌盖直径、菌柄长度、菌盖厚度均随干燥时间延长呈下降趋势,说明干燥过程中水分流失会导致黄蘑菇物理形态收缩,且前期0～12 h左右尺寸衰减速率普遍更快,后期逐渐趋于稳定,反映出黄蘑菇干燥存在快速收缩再到缓慢定型的阶段特征。HAD组尺寸收缩最快,说明高温使水分快速蒸发,形态急剧收缩。TCD组变化居中,温和干燥使收缩更平缓,但耗时较长。VFD组收尺寸变化最小,冻干过程通过升华有效保持了原始形态,结构维持能力最优。
a-菌菇直径的变化;b-菌柄长度的变化;c-菌盖厚度的变化
图3 不同干燥方式对黄蘑菇尺寸大小的影响
Fig.3 Effect of different drying methods on the size of A.luteo-virens
2.1.4 不同干燥方式对黄蘑菇的质量、水分含量、干基含水率、干燥速率的影响
不同干燥方式对黄蘑菇的质量、水分含量、干基含水率、干燥速率的影响如图4所示,黄蘑菇的干燥过程表现为水分逐步脱除与菇体质量持续下降。不同干燥机制导致水分脱除速率及最终含水状态存在显著差异,到达干燥终点的时间也存在显著差异。如电子版增强出版附图1-b和附图1-c(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044581,以下附图同)所示,不同干燥方式下,水分含量与干基含水率均随时间延长逐渐降低并趋近于0,表明3种方法均能有效脱水,且VFD处理组脱水更彻底。由电子版增强出版附图1-d所示,干燥速率随干基含水量变化均呈现先升后降的趋势,说明前期水分迁移迅速,后期逐渐趋缓。HAD组和TCD组均未观察到明显的恒速干燥阶段,其干燥过程主要受降速阶段主导。该现象与莲子及杏鲍菇在热风干燥过程中的相关研究结论相一致[24-25]。其原因可能源于干燥过程中菇体发生的显著收缩,导致内部传热与传质阻力增大,从而抑制了恒速干燥期的形成。相比之下,VFD组在干基含水量为23.57～12.72 g/g保持较高且稳定的干燥速率[约3.32～3.39 g/(g·h)],表明其存在明显的恒速干燥阶段。
2.1.5 不同干燥方式对黄蘑菇的L*值、a*值、b*值和ΔE值的影响
色泽是干制品感官品质的关键指标。L*代表明度,值越高则越亮;a*为正表示偏红,为负表示偏绿;b*为正表示偏黄,为负表示偏蓝;各值绝对值越大,相应色调越强。ΔE为总色差,值越大表示颜色差异越明显。通常ΔE>3.5时,肉眼可觉察到明显色差[26]。
不同干燥方式对黄蘑菇的L*值、a*值、b*值和ΔE值的影响如表1所示,与鲜样相比,HAD和TCD组的L*值分别下降31.35%和27.74%,ΔE分别增加了51.91%和41.74%。这可能归因于水分迁移致结构塌陷,以及热效应促进酶促与非酶褐变共同作用所致的色素沉积[27]。相比之下,VFD处理组的L*值相较于新鲜黄蘑菇提高了13.65%。这主要得益于低温、无氧环境有效抑制酶促与非酶褐变,减少了深色物质生成,同时冰晶升华形成的多孔结构增强光散射,提高了表观明度[28]。HAD和TCD组a*值上升、b*值下降,表明红度加深、黄度减弱,与程晶晶等[26]研究中结论一致。而VFD组a*、b*值与鲜样最接近,颜色变化最小。
表1 不同干燥方式对黄蘑菇的L*值、a*值、b*值和ΔE值的影响
Table 1 Effect of different drying methods on the L*,a*,b*, and ΔE values of A.luteo-virens
样品L*a*b*ΔE新鲜样品71.13±1.25b13.62±0.34c53.36±0.16a—HAD样品40.84±0.82d26.30±0.15a13.86±0.87d51.91±0.41aTCD样品43.72±0.98c23.54±0.16b23.87±0.10c41.74±1.27bVFD样品79.27±0.81a11.51±0.20d42.43±0.57b14.79±0.92c
注:不同小写字母表示各组间差异显著(P<0.05)。
2.2 不同干燥方式对黄蘑菇的酶促褐变和非酶褐变指标的影响
2.2.1 热风干燥过程酶促褐变和非酶褐变指标的变化
由电子版增强出版附图2可以看出,HAD处理组,褐变度从初始的0.52上升至6.38,褐变程度加重了约12.3倍;PPO活性和POD活性均呈先下降后回升的变化趋势。在干燥初期和中期,PPO与POD活性迅速下降,两者活性分别从初始的540.31和510.30 U/g下降至最低点252.13和74.13 U/g,后期略有回升。PAL的活性呈先上升后下降趋势,从78.64 U/g增至101.92 U/g,之后回落至87.87 U/g。总酚含量前期呈显著上升态势,后期略有下降,从3.55 mg/g提升到12.72 mg/g,后又下降至11.01 mg/g,并且总酚含量的提升集中在开始干燥的3～15 h。出现这些现象可能是因为,干燥刚开始的3 h内PPO与POD活性虽呈快速下降趋势,但其绝对活性仍高于PAL,此时酚类物质被优先氧化为邻醌,进一步聚合生成褐色素,同时瞬时高温亦可通过断裂酚羟基或破坏糖苷键而直接造成部分酚类损失,故总酚含量短期降低。3～15 h,PAL活性增强驱动多酚合成,且PPO和POD后期活性受限,酚类合成速率超过降解速率,同时,干燥导致细胞内部高聚物间的共价键可能断裂,有助于酚酸等物质的释放及提取,使得总酚积累显著。18～24 h总酚含量又出现下降,可能因多酚物质自身氧化缩合或其与酶促褐变中间产物反应所致。本研究中PPO与POD活性的变化趋势与曾镇[29]研究结果基本一致,但该研究未报告干燥后期酶活回升的现象。多酚含量的变化与尚红梅等[30]研究一致。综上所述,总酚含量的变化是PPO与POD催化酚类降解与PAL介导酚类合成两者之间动态平衡的结果,共同调节酶促褐变反应的进程。
还原糖含量和可溶性蛋白含量总体呈持续下降趋势,还原糖含量0～3 h从初始的30.86 mg/g上升至43.85 mg/g,再持续下降至2.46 mg/g。可溶性蛋白含量从初始的22.67 mg/g下降至11.49 mg/g。总氨基酸含量总体呈上升态势,从初始的0.89 μmol/mg上升至1.54 μmol/mg。与WEN等[31]、刘芹等[32]研究结果一致。出现这些指标的变化可能是因为,干燥初期,多糖类物质降解以及溶质富集,导致还原糖含量出现短暂升高。同时蛋白质发生热降解,受热分解可能产生大量的多肽,进而形成游离氨基酸[29],导致可溶性蛋白含量降低。蛋白质降解产生氨基酸的速率大于美拉德反应消耗氨基酸的速率,游离氨基酸会逐步积累。干燥中后期还原糖的游离羰基与氨基酸的游离氨基快速发生亲核加成,并经重排生成5-羟甲基糠醛等中间产物,随后聚合形成褐色高分子产物,使得还原糖和氨基酸被消耗。维生素C含量从278.20 μg/g降至81.68 μg/g,维生素C损耗了70.63%。在热的作用下,维生素C极不稳定,极易氧化裂解,热风促使抗坏血酸迅速氧化为脱氢抗坏血酸并进一步裂解,生成褐色呋喃类产物,且氨基酸等含氮化合物可与转化后的抗坏血酸发生美拉德反应,加剧褐变。维生素C含量下降表明可能产生由抗坏血酸引起的非酶褐变[33]。
2.2.2 控温风干过程酶促褐变和非酶褐变指标的变化
由电子版增强出版附图3可以看出,TCD处理过程中,总酚含量、PAL、POD和PPO活性整体均呈现先上升后波动下降的趋势。PPO活性从初始540.31 U先升至12 h的537.63 U,后持续下降至30 h的403.74 U,最终小幅回升;POD活性从560.30 U/g升高至12 h的724.30 U/g,之后降至24 h的587.63 U/g,并在后期趋于稳定;PAL活性从78.64 U/g迅速上升,于24 h达到峰值147.83 U/g,之后降至110.42 U/g。总酚含量从初始的3.55 mg/g波动上升至36 h的8.79 mg/g,最终轻微回落至7.74 mg/g。出现这些指标变化的原因可能是,在干燥初期,环境温度与物料温度梯度小,酶蛋白结构相对稳定,PPO、POD活性因轻度干燥胁迫触发酶活力短暂上调,所以呈上升趋势。随干燥进行,水分持续蒸发导致物料内部渗透压升高,同时环境湿度波动引发酶蛋白逐步变性,PPO、POD活性受结构破坏影响持续下降,酶促氧化作用减弱。与此同时,组织逐渐衰老使细胞膜通透性增大,自由基和过氧化物进入细胞,刺激细胞启动PAL防御机制来提高植物的抗逆性;至风干后期,细胞膜结构受损,使PAL活性降低[34]。尽管PAL能参与酚类物质合成,但此阶段酶促氧化消耗酚类物质的作用更占主导,同时可能受相关条件影响,酚类物质有一定损失,总酚含量上升相对平缓。控温风干过程中的褐变程度及总酚含量变化也是PPO、POD分解酚类物质与PAL合成酚类物质的动态平衡,以及酚类物质迁移等因素共同作用的结果。这些因素相互影响,揭示了TCD处理下褐变相关酶的响应机制及酚类代谢的复杂调控特征。
可溶性蛋白含量先下降后有波动变化、总氨基酸含量随时间延长整体呈上升趋势、还原糖含量呈先下降后波动上升,还原糖从初始的30.86 mg/g先下降至12 h的26.26 mg/g,之后升至29.08 mg/g。可溶性蛋白含量从初始22.67 mg/g下降至16.06 mg/g,总氨基酸含量从初始的0.89 μmol/mg上升至1.68 μmol/mg。发生上述变化的原因可能是,干燥前期,呼吸旺盛,还原糖作为呼吸作用底物被消耗,且部分游离还原糖随表层水分蒸发而流失,所以导致前期的短暂下降。蛋白质在相关酶作用下降解产生小分子肽和游离氨基酸,导致可溶性蛋白含量下降,且黄蘑菇自身代谢消耗氨基酸的速率低于降解速率,导致氨基酸积累;干燥中期,物料细胞因渗透压失衡破裂,储存于液泡或细胞基质中的还原糖被大量释放,同时,非还原糖在相关酶的作用下分解为还原糖,导致还原糖含量上升,干燥后期,酶活性受抑制,美拉德反应开始成为还原糖和游离氨基酸消耗的主要途径,但由于蛋白质降解产生的氨基酸量远大于消耗总量,且干燥后期水分过低限制了美拉德反应的速率,因此总氨基酸含量整体呈上升趋势。维生素C含量从278.20 μg/g下降至182.99 μg/g,损耗了34.22%。表明在TCD处理中也可能产生了由抗坏血酸引起的非酶褐变。
2.2.3 真空冷冻干燥过程酶促褐变和非酶褐变指标的变化
从电子版增强出版附图4可以看出,VFD处理过程中,PPO、POD和PAL的活性均出现不同程度的下降,其中PAL的活性下降幅度相对较小,推测在预冻阶段酶活性可能已发生显著降低,而干燥阶段则基本维持了这一状态;同时,总酚含量保持稳定,表明酚类物质未发生明显氧化,也未因细胞结构破坏而大量渗出。这一结果说明VFD处理有效抑制了褐变反应的发生,且对还原糖、可溶性的蛋白、维生素C等营养物质保留最好。
2.3 不同干燥方式下黄蘑菇的褐变相关性分析
为探究影响不同干燥条件下褐变的主导途径,对干燥过程中的酶活性、色泽、营养成分进行Pearson相关性分析。由电子版增强出版附图5可知,HAD、TCD处理组,L*值与褐变度呈显著负相关(P<0.01),而VFD组呈现出弱相关性,说明亮度越低,褐变度越高;ΔE值与褐变度显著正相关(P<0.01),即褐变度越高,样品色泽偏离初始状态越明显。
HAD处理组,PAL活性、总氨基酸含量与褐变度呈正相关,相关系数分别约0.42、0.44,总酚与褐变度呈显著正相关,相关系数约0.84(P<0.01);PPO活性、POD活性、还原糖含量、可溶性蛋白含量、维生素C含量与褐变度显著负相关,相关系数分别约-0.78、-0.90、-0.90、-0.95、-0.94(P<0.01)。上述结果说明,在热风干燥条件下,非酶褐变起主导作用,酚类物质的积累为褐变提供底物,而PPO和POD在热加工过程中活性下降,酶促褐变减弱。TCD处理组,PAL活性、总酚含量、总氨基酸含量与褐变度呈显著正相关,相关系数分别约0.69(P<0.05)、0.95(P<0.01)、0.89(P<0.01);PPO活性、POD活性、可溶性蛋白含量、维生素C含量与褐变度显著负相关,相关系数约-0.80、-0.62、-0.96、-0.91、0.69(P<0.05),还原糖含量与褐变度无相关性。该组褐变主要受酶促反应主导,脱水胁迫激活PAL促进多酚合成,PPO、POD催化其氧化成褐色产物,后期因底物消耗及反馈抑制使酶活下降;蛋白酶促进蛋白质降解为氨基酸,进一步协同促进褐变。非酶褐变在低温条件下贡献较小。相比之下,VFD处理组中各指标与褐变度的相关性均较弱。在真空冷冻干燥过程中酶活得以保留但无法发挥作用,同时缺乏反应所需的热、水和氧气,营养和活性成分得以最大限度的保留。
2.4 不同干燥方式下黄蘑菇的褐变主成分分析
如电子版增强出版附图6所示,第一主成分(PC1)与第二主成分(PC2)的方差解释率分别为71.4%与16.3%,前两者累计贡献率达87.7%,这表明PC1和PC2能够涵盖原始数据中绝大部分的信息变异,基于这2个主成分开展分析具有可靠的统计学意义,可有效反映不同干燥方式下各指标的综合差异。变量载荷显示:维生素C、还原糖、可溶性蛋白与总氨基酸在PC1上呈显著正载荷,且载荷向量夹角较小,提示这些营养相关指标之间存在较强正相关;总酚、褐变度、ΔE与L*在PC1上整体为负载荷,其中总酚、褐变度与ΔE夹角较小而与L*方向相反,表明亮度降低与褐变加剧协同变化,且总酚含量越高,作为褐变原料的储备就越充足。当存在活性酶时,能更高效地启动褐变反应。HAD组主要位于PC1负向,且与总酚、褐变度与ΔE的载荷方向一致,表明在HAD条件下与褐变相关的变化更为突出、色差更大、亮度更低。从样本与载荷向量的相对关系看,HAD组与褐变相关指标的关联强于TCD与VFD。TCD组样本在PC1正向形成较为集中的簇,且其聚集区与PPO、PAL载荷方向具有较高重合度,提示控温风干在相对温和的热环境下更有利于保留关键酶活性与部分营养成分。VFD组样本远离PC1负向并单独成簇,位于与HAD、TCD相对隔离的区域;从载荷关联看,VFD在PC1正向(酶活性与营养相关)的得分相对较低,但在色泽保持与褐变抑制方面表现更优。这与真空冷冻干燥在低温升华条件下对褐变反应的抑制特征相一致,即尽管冰晶形成与升华过程可能对酶结构与部分营养造成一定影响,导致其水平有所下降,但其可最大限度抑制褐变等劣变反应,从而更好地维持产品色泽与整体感官品质。上述推断基于载荷-得分的方向性与样本聚类特征,具体机制尚需结合动力学与理化指标进一步验证。
3 结论与讨论
在本研究中,我们探讨了不同干燥处理方式(HAD、TCD、VFD)对青海黄蘑菇褐变行为与关键生化指标的影响;结合相关性分析阐明各组分含量变化与颜色参数的关系,明确颜色变化的物质基础,并通过主成分分析对多指标降维以识别并判定主导褐变反应类型。关键指标具备指示价值:ΔE与褐变度呈显著正相关,可作为直观评价指标;PPO、POD、PAL活性及总酚含量可监测酶促褐变动态;还原糖、可溶性蛋白、游离氨基酸与维生素C含量变化可反映美拉德反应等非酶褐变程度。基于上述指标,可实现干燥过程中的褐变监测与过程调控。结果显示,不同干燥过程通过温度、氧气与水分形态的差异性调控,主导了不同的褐变路径,从而显著影响产品色泽、组织结构与营养保持。VFD处理因低温、无氧环境及冰晶升华作用,有效抑制了PPO、POD和PAL的活性,同时降低美拉德反应与抗坏血酸氧化等非酶褐变的发生概率,因而基本避免褐变产生,有效维持菇体色泽、完整形态与多孔微观结构,并最大限度保留还原糖、可溶性蛋白与维生素C等营养成分。TCD处理过程中,TCD处理组在温和温度下使PPO、POD与PAL保留一定活性,PAL生成的多酚底物与PPO、POD催化共同推动以酶促褐变为主的色泽加深。HAD则因高温强烈激发非酶褐变机制:干燥前期以抗坏血酸褐变和多酚酶促氧化为主,中后期美拉德反应占主导;还原糖与氨基酸反应、维生素C的热降解共同加剧褐变,致使菇体发生严重色泽劣变。综上所述,青海黄蘑菇在不同干燥条件下的褐变机制存在明显区别:HAD以热驱动非酶褐变为主,TCD以持续酶促褐变为特征,而VFD则从酶活性与反应环境两端实现对褐变的有效阻断。本研究初步阐明了青海黄蘑菇在不同干燥过程中的主要褐变途径,并为高原食用菌褐变控制提供了理论参考。未来可联用抗氧化预处理、分段控温与复合干燥等策略,系统优化黄蘑菇干燥工艺,在兼顾效率与成本的前提下显著提升品质。
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