慕萨莱思是新疆特有的传统发酵饮品,以阿瓦提红葡萄或和田红葡萄为原料,经榨汁、浓缩和自然发酵工艺制成,具有原生态、天然、绿色的特点。作为中国独特的含酒精自然发酵饮料,慕萨莱思在感官特性、营养价值和功能活性方面展现出鲜明的地域特色。其发酵过程中产生的醇类、酯类、醛类、酸类、酚类及萜烯类等物质,不仅赋予其独特的风味,还使其具备活血、降血脂、补肾强身、调节胆固醇及心脑血管保健等功能,适合不同年龄段人群饮用[1]。
近年来,随着消费者对健康饮品需求的增长,功能酒市场迅速扩大。其在传统酿造基础上融入特定功能性成分,以满足养生、保健或特定生理调节需求,其品质受原料、工艺、微生物群落及功能成分稳定性等因素影响[2]。南疆民间在制作慕萨莱思时,常添加枸杞、红花、肉苁蓉、藏红花等地方特色辅料,以增强其保健功效并丰富风味多样性[3]。其中,肉苁蓉作为一种传统中药材,富含多糖、氨基酸、苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类及生物碱等活性成分,具有滋补肾阳、调节神经内分泌、抗疲劳等作用,被誉为“沙漠人参”[4-5]。
然而,目前慕萨莱思肉苁蓉的产业化仍面临生产标准缺失、工艺技术不完善及风味物质研究不足等问题,制约了其市场推广与品质提升。本研究以肉苁蓉为辅料,优化慕萨莱思的发酵工艺,并采用GC-MS与非靶向代谢组学技术,系统解析其香气成分及差异代谢物,旨在为肉苁蓉慕萨莱思的标准化生产、风味调控及功能强化提供理论依据与技术支撑,推动这一传统饮品的现代化发展与价值挖掘。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
管花肉苁蓉,选取源于新疆和田地区的肉质饱满、无霉变杂质的一级市售品;和田红葡萄,选取源于新疆和田地区的品相完整、果香浓郁的市售品;甲醇、乙腈,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;甲酸,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;L-2-氯苯丙氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
08-2T恒温磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;57330-U固相微萃取装置、57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS相微萃取针,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;6890 N-5973气相色谱质谱联用仪,安捷伦科技(中国)有限公司;5430R冷冻离心机,艾本德(上海)国际贸易有限公司;TL-48R高通量组织研磨仪,上海净信实业发展有限公司;SCIENTZ-1LS真空浓缩仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;Vanquish Flex超高效液相色谱仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SDAJ-0.5葡萄酒中式生产线,山东安吉生物发酵装备技术有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程
工艺流程如图1所示,主要分为3步,首先对肉苁蓉进行处理,经人工分选,将肉苁蓉切片,蒸煮备用。其次对和田红葡萄进行处理,经清洗、挑选,去梗、破皮,采用压榨设备提取葡萄汁,再经加热浓缩工艺,调整葡萄汁浓度指标。最后将蒸煮后的肉苁蓉产物与浓缩葡萄汁混合,发酵,控制温度、时间等参数,完成发酵,再将其澄清即可获得肉苁蓉慕萨莱思。
图1 肉苁蓉慕萨莱思制备工艺流程图
Fig.1 Flowchart of the production process for Cistanche Musalais
1.3.2 肉苁蓉的制备
参考宫霞等[6]的制备方法稍作改动,选取品质优良,无变质的干肉苁蓉,去皮,切片,用纱布包裹在锅中蒸20 min,备用。
1.3.3 葡萄汁的制备
和田红葡萄初始糖度18°Brix,去除腐烂变质以及成熟度不一的葡萄,清洗后,去皮,压榨,对葡萄汁进行高温熬煮(浓缩),以糖度为标准,在糖度分别达到26、29、32°Brix时结束浓缩,冷却至室温备用。
1.3.4 肉苁蓉慕萨莱思的发酵工艺
将蒸煮后的肉苁蓉按不同添加量(3%、5%、7%,质量分数)加入到浓缩后的600 mL葡萄汁中,置于发酵罐中发酵,在发酵过程中每24 h测一次残糖,记录发酵情况,残糖降低至4 g/L时,发酵结束,提取上清液,85 ℃杀菌30 min,得到肉苁蓉慕萨莱思。
1.3.5 肉苁蓉慕萨莱思单因素试验设计
分别考察肉苁蓉添加量(3%、5%、7%)、初始糖度(26、29、32°Brix)、发酵温度(22、25、28 ℃)对肉苁蓉慕萨莱思理化特性和活性的影响。
1.3.6 分析检测
酒精度、可溶性固形物、总酸:采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法检测。
总黄酮含量测定:参考许海棠等[7]的方法,以芦丁质量浓度(X)为横坐标,波长510 nm处吸光值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到标准曲线回归方程为:Y=0.804 3X-0.027 8,R2=0.999 9,线性关系良好。
多酚含量测定:采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量[8],以没食子酸含量(X)为横坐标,波长760 nm处吸光值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到标准曲线回归方程为:Y=0.417 7X+0.104 8,R2=0.997 5,线性关系良好。
1.3.7 GC-MS分析
选取糖度32°Brix,发酵温度25 ℃,肉苁蓉添加量7%实验组与不添加肉苁蓉空白组2组样品进行GC-MS检测。
样品前处理:称取样品置于20 mL萃取瓶中,加入100 μL 50 μg/mL苯乙酸异戊酯作为内标,密封,置于60 ℃水浴中,磁力搅拌速度250 r/min,平衡20 min后,插入萃取针萃取30 min。萃取针使用前,在气质进样口活化20 min(250 ℃)。
GC-MS条件:HP-INNOWax色谱柱(60 m×250 μm×0.25 μm),样口温度250 ℃,气质接口温度250 ℃,载气流速1.5 mL/min,分流比4∶1。升温程序:初始40 ℃,保持5 min,5 ℃/min升温到250 ℃保持10 min。离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,EI电离70 eV,全扫描35～550 da。
1.3.8 非靶向代谢组学
1.3.8.1 样品前处理
选取糖度32 °Bx,发酵温度25 ℃,肉苁蓉添加量7%实验组与不添加肉苁蓉空白组两组样品,各组对应的生物学重复均为3例,共计6例样本。样本解冻后涡旋混匀,移取300 μL样品至1.5 mL离心管中,12 000 r/min、4 ℃离心15 min。移取100 μL上清液于2 mL离心管中,液氮速冻后使用冷冻干燥机冻干;加入1 mL预冷的甲醇∶乙腈(1∶1,体积比),涡旋振荡30 s;放入-20 ℃冰箱中冷冻30 min;12 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液850 μL真空浓缩至尽干;加入150 μL 50%甲醇(含5 ppm 2-氯苯丙氨酸)复溶,涡旋振荡30 s;12 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液过0.22 μm滤膜,过滤液加入到检测瓶中;取样品过滤液各10～20 μL混合成一个QC样品,用于评价仪器稳定性和数据可靠性,5个样本(含5个)以下不做QC。
1.3.8.2 分析条件
色谱条件:使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 A, 1.8 μm,2.1 mm×100 mm),流速0.4 mL/min,柱温40 ℃,自动进样器8 ℃,进样量2 μL。流动相A为0.1%(体积分数)甲酸水,流动相B为乙腈(含0.1%(体积分数)甲酸)。质谱条件:喷雾电压3.5 kV/-3.0 kV,鞘气40 arb,辅助气10 arb,毛细管温度320 ℃,辅助气温度300 ℃,一级分辨率60 000,扫描范围70～1 000 m/z,AGC Target Standard,Max IT 100 ms,筛选响应前4的离子进行二级碎裂,动态排除时间为4 s,二级分辨率15 000,HCD碰撞能30%。
1.3.8.3 代谢物结构分析
代谢物的鉴定基于派森诺PSNGM(PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database)数据库进行,该库包含标准品自建库、mzCloud库(https://www.mzcloud.org/)、LIPID MAPS(https://www.lipidmaps.org/)、HMDB(https://hmdb.ca/)、MoNA(https://mona.fiehnlab.ucda vis.edu/)、NIST_2020_MSMS以及AI预测MSMS图谱库。
1.3.8.3 多元统计分析
采取多元统计分析对6种样本代谢物数据进行主成分分析(principal components analysis,PCA),解析肉苁蓉慕萨莱思与慕萨莱思的代谢物差异特征。通过分析OPLS-DA模型的变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)、差异倍数值(fold change)以及P值,从中筛选出不同品种间的差异代谢物,并进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路等分析的生物学信息挖掘[9]。
2 结果与分析
2.1 肉苁蓉慕萨莱思单因素试验分析
肉苁蓉慕萨莱思单因素试验结果如图2所示。可溶性固形物主要反映了发酵后残留在酒体中的糖分及其他可溶性物质的总量,初始糖度越高,最终残留的可溶性固形物含量也越高。同一初始糖度和肉苁蓉添加量下,发酵温度25 ℃时固形物含量略低于22 ℃和28 ℃,25 ℃时酵母酵母发酵活性较高,消耗部分糖分,但可能因为糖度基数高,消耗未显著降低总量,导致差异较小。肉苁蓉添加量3%、5%、7%组间误差棒重叠,无显著差异,说明肉苁蓉添加量对可溶性固形物总量影响可忽略,主要受初始糖度影响。
a-可溶性固形物;b-酒精度;c-总酸;d-总黄酮;e-总酚
图2 不同工艺条件下肉苁蓉慕萨莱思的理化指标与活性成分含量
Fig.2 Physicochemical indicators and bioactive compound contents of Cistanche Musalais under different processing conditions
注:每组图从左至右分别为初始糖度26°Brix、29°Brix、32°Brix;不同小写字母代表组间具有显著性差异(P<0.05)。
酒精度是衡量发酵效率最直接的指标,酒精是酵母利用糖分进行发酵的主要产物[10]。32°Brix组的酒精度显著高于26°Brix和29°Brix组,初始糖度为酵母提供了更充分的发酵底物,从而能够生成更多酒精。在25 ℃条件下,几乎所有初始糖度和肉苁蓉添加量组合下的酒精度都达到了峰值,这一结果与LI等[11]的研究结论一致。温度过低(22 ℃)会抑制酵母活性,导致发酵缓慢或不完全;温度过高(28 ℃)则可能使酵母过早衰亡或产生副产物,同样影响酒精的最终产率。在25 ℃下,7%的肉苁蓉添加量能产生最高的酒精度。这表明肉苁蓉中的某些成分可能促进了酵母的生长和发酵活力。
总酸含量影响酒的口感和稳定性。酸主要来自于原料本身以及发酵过程中酵母等微生物的代谢产物,酸过量,酒体会呈尖酸感和不愉快的醋味,故其含量应控制在较低水平[12]。22 ℃条件下总酸的含量显著高于25 ℃和28 ℃,原因是22 ℃对乳酸菌偏低,低温会显著抑制乳酸菌的生长和代谢活性,导致苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)进行得非常缓慢、不完全,甚至根本无法启动,酒液中大量的苹果酸没有被转化,保留下来,使得测得的总酸含量明显偏高。而25 ℃和28 ℃两个温度是乳酸菌进行MLF的理想温度范围。乳酸菌在此温度下活性很强,能够快速、彻底地将苹果酸转化为乳酸[13],故测得总酸含量偏低。相对而言,初始糖度和肉苁蓉添加量这2个因素对总酸的影响模式不太一致,但总体来看,25 ℃配合7%添加量的组,其总酸含量通常处于一个适中的范围。酸度过低则酒体寡淡,过高则尖酸刺口,适中最佳。总黄酮含量与多酚含量这2项指标直接衡量酒体的功能性成分和抗氧化活性,其含量主要来源于添加的肉苁蓉。肉苁蓉添加量影响最为显著,在大多数初始糖度和发酵温度下,7%添加量组的黄酮和多酚含量最高,5%次之,3%最低。这直接证明了增加肉苁蓉用量是提升产品功能性的最有效手段。25 ℃条件下的黄酮和多酚含量表现优异。温度过高(28 ℃)可能导致这些热敏性的活性物质部分降解或氧化;温度过低(22 ℃)则可能不利于其从原料中充分溶出。要最大化慕萨莱思的健康价值(总黄酮和总多酚含量),肉苁蓉添加量7%是关键,并以25 ℃的温和发酵温度来保护和有效提取这些成分。
综上数据分析,确定不同处理组下最佳工艺条件为:初始糖度32°Brix、发酵温度25 ℃、肉苁蓉添加量7%。这是一个兼顾了发酵效率、产品品质和功能性的平衡点,这与ABUDUREHEMAN等[14]的研究结果有所不同,TANG等[15]发现,传统慕萨莱思的核心功能微生物为Blautia、Leuconostoc、Lactiplantibacillus、Rhodococcus、Thermoascus,其中Thermoascus(热曲霉属)主导甘氨酸、乙酰胺、红曲内酯等关键代谢物合成,高糖度(°Brix值)开放发酵环境引入多碳源可激活次级代谢,并指出糖度水平直接影响酚类合成途径(KEGG富集的shikimate途径)。温晓丽[16]发现苯丙烷代谢途径(shikimate途径)能够促进酚类前体物质积累。高糖环境(32°Brix)促进耐渗酵母(如Saccharomyces)优势生长,抑制杂菌,传统慕萨莱思依赖Thermoascus合成酚类[15],肉苁蓉慕萨莱思中酵母可直接利用肉苁蓉前体物高效生成酚类[17]。故确定最佳工艺条件为:初始糖度32°Brix、发酵温度25 ℃、肉苁蓉添加量7%。此时肉苁蓉慕萨莱思可溶性固形物的含量为(21.9±1.1)%,酒精度(12.6±0.6)%vol,总酸(3.82±0.19) g/L,总黄酮(0.80±0.01) g/L,多酚(0.60±0.00) g/L。
2.2 肉苁蓉-慕萨莱思挥发性风味物质分析
电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044593,下同)为肉苁蓉慕萨莱思和慕萨莱思部分香气成分种类及相对含量的试验结果。共鉴定出38种香气成分,包括24种酯类、6种醇类、2种酮类、2种醛类以及其他。
酯类是构成水果香气和酒体香气的主要物质,包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯及苯乙酸异戊酯等,乙酸乙酯(水果,甜香)在B组(7%实验组)6.418%的含量远高于A组(对照组)2.417%。草酸二乙酯(芳香)仅在B组检测到(0.521%),酯类是在酯酶的作用下由有机酸和醇合成的[18],肉苁蓉可能提供了促进酯酶活性的物质,或者其本身含有的酶类参与了反应,肉苁蓉的添加可能促进了产酯能力更强的酵母菌或酯香酵母的生长,抑制了其他非产酯微生物。相较于A组,B组出现了丙烯酸-2-乙基己酯、苯甲酰甲酸乙酯、水杨酸乙酯、己基戊酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈油酸乙酯、油酸乙酯7种新增酯类,这些新酯类的出现极有可能是肉苁蓉中的特定脂肪酸或芳香酸作为前提底物,被微生物利用并参与了酯化反应,肉苁蓉中的某些活性成分(如苯乙醇苷类)在酶的作用下被切割成糖和苷元,苷元极不稳定,继续被微生物代谢或发生非酶促的化学变化转化成脂肪酸,再与酒体中的醇类反应生成酯类[19]。苯乙酸异戊酯是酒体蜂蜜香与花香的主要来源,其阈值低,少量即可显著提升香气层次感。棕榈酸乙酯与辛酸乙酯形成果味与脂肪香的复合香气[20]。酯类物质都能增强慕萨莱思葡萄酒的果香特质。其中,低分子量的酯类与醛类化合物是构成酒体风味特征的重要元素,这些成分主要作为发酵过程中的次生香气产物形成[21]。
醇类是主要风味,风味成分包括异丁醇,异戊醇等,乙醇、异戊醇、异丁醇在B组的含量均低于A组,乙醇含量的降低与酯类含量的升高相呼应,表明碳流向从积累酒精转向了合成风味酯类,这是一个积极的发酵方向。异戊醇等高级醇主要由支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的代谢产生(Ehrlich途径)[22],其含量的降低可能意味着肉苁蓉的添加抑制了相关菌株的过度生长或调控了氨基酸的代谢流,研究表明适量的高级醇能赋予果酒一定的香气和口感,但大多数高级醇的呈味阈值较低,且有些高级醇具有苦涩味,如异丁醇具有极强的苦味[23],肉苁蓉慕萨莱思高级醇总量降低,饮后舒适度可能更高。
醛类、酮类及其他物质也被检测到,但相较于其他类香气化合物其种类和相对含量较少。B组出现了A组没有的2,5-二羟基苯乙酮(甜香、花香),2,5-二羟基苯乙酮的出现可能直接源于肉苁蓉中苯乙醇苷类成分(如松果菊苷、毛蕊花糖苷)的微生物降解。
GC-MS表明,肉苁蓉的添加显著改变了慕萨莱思的挥发性风味质谱。乙酸乙酯(水果香、甜香)和棕榈酸乙酯(果味与脂肪香)是构成其浓郁果香特征的最主要物质。其含量在肉苁蓉慕萨莱思中分别为6.42%和3.75%显著高于传统产品的2.42%和1.18%;异丁醇(具有苦味)含量从传统产品的3.98%降至2.11%,这一变化有效降低了饮品的苦涩感,提升了风味的舒适度与协调性;肉苁蓉的引入带来了如2,5-二羟基苯乙酮(甜香、花香)等新的香气成分,这些物质可能源于肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的微生物降解,共同构成了产品风味更多样化的特点,表明肉苁蓉的添加成功引导发酵过程朝着生成更多优质风味的方向推进。
2.3 肉苁蓉慕萨莱思代谢组学分析
2.3.1 肉苁蓉慕萨莱思非挥发性代谢物
基于UPLC-MS/MS分析,采用本地自建数据库和公共数据库共鉴定出11类化合物。由图3-a可知,有机杂环化合物占比最多,占总鉴定物含量的28.1%,其次是有机酸及其衍生物,占比总代谢物含量的18.6%,脂质和脂质样分子占比13.8%,类苯甲类化合物占比12.3%,有机氧化合物占比9.6%,苯甲烷类和聚酮类占比7.0%,生物碱及其衍生物占比4.2%,有机氮化合物占比3.3%,核苷、核苷酸和类似物占比1.9%,其他占比0.8%。
a-肉苁蓉慕萨莱思非挥发性代谢物分类及占比;b-PCA得分图;c-PLS-DA得分图;d-PLS-DA模型置换检验图;e-OPLS-DA得分图;f-OPLS-DA模型S-plot载荷散点图;g-差异代谢物火山图(VIP≥1,P<0.05);h-差异代谢物的KEGG通路富集分析图
图3 肉苁蓉慕萨莱思与传统慕萨莱思的非靶向代谢组学多元统计分析结果
Fig.3 Multivariate statistical analysis of non-targeted metabolomics data comparing Cistanche Musalais and traditional Musalais
有机杂环化合物是酒体重要的风味物质之一,在果酒的风味成分中,呋喃类和吡嗪类化合物是体现风味的关键特征化合物[24],吡嗪类具有低阈值和高气味等特点,呋喃类是杂环芳香族化合物,是一种低沸点,高挥发性的脂溶性化合物,他们在酒体风味的形成中发挥着关键的作用,同时也有益于人体健康[25]。有机酸及其衍生物是葡萄酒的重要成分,其含量和种类是影响酒体风味,色泽和稳定的重要因素[26]。有机酸是三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环的重要产物,葡萄糖在酶的作用下生成丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下生成乙酰辅酶A,随后进入TCA循环产生柠檬酸,苹果酸,琥珀酸等有机酸。此外,还在代谢产物中发现具有降血脂和降血糖的葫芦巴碱以及具有抗癌、抗炎、抗氧化、保肝利胆和抗糖尿病的番红花素。
2.3.2 肉苁蓉慕萨莱思中非挥发性代谢物主成分分析与正交偏最小二乘-判别分析
图3-b为肉苁蓉慕萨莱思对照组(A)和7%实验组(B)基于所有鉴定代谢物的PCA得分图,由图3-b可知,同一平行的2个主成分表达了约57.8%的总变异,其中PC1和PC2分别占42.8%和15.2%。这表明PC1和PC2共同承载了原始变量的大部分信息,能够代表不同处理组中有机物的主要特征[27]。总体样本的PCA图显示,组内样本聚集在一起,A和B组间差异明显,说明是否添加肉苁蓉的慕萨莱思代谢物存在显著差异,实验系统稳定性良好,数据可靠。
由图3-e可知,对2组数据进一步采用OPLS-DA统计学方法进一步筛选差异代谢物和区分不同有机物对样品的贡献。扩大组间差异,得分图中所有点置于95%的置信区间内,A和B组间分离明显,说明两者非挥发性代谢物的组成和含量存在较大差异。将变量数据和分类信息分为2个数据集,并通过投影和判别计算表明分析结果具有可靠性[28],借助分组信息挖掘组间差异。在图3-c中,以2个样品组中识别出非挥发性代谢物作为因变量、不同处理组作为自变量绘制了PLS-DA得分图。该图显示出与PCA相同的趋势,即组间样本分布更为集中。通过随机改变分类变量顺序建立相应模型时,R2X和R2Y分别表示PLS-DA分类模型在X、Y矩阵中解释的信息百分比。其数值越接近1,模型性能越好,且两者差异不应过大[29],通过交叉验证计算得的Q2值用于评估PLS-DA模型的预测能力,其中较大的Q2值表明预测性能更优。图3-d展示了通过PLS-DA方法进行200次连续置换检验获得的模型性能指标结果:R2Y=1,Q2=0.866,200次随机排列后R2和Q2交于正半轴,数值都趋近于1且左边值小于右边,说明该模型有效。在PLS-DA模型中,VIP值被用于进一步区分不同处理的慕萨莱思中不同代谢物质的贡献[30]。
绘制S-plot-Loading散点图,寻找组间含量差异较大的化合物,点的离散程度表明差异的显著性,距离越远表示差异越显著。结果表明,OPLS-DA能有效地区分2组酒,这为后续的代谢物筛选和深入研究提供了坚实的基础。
2.3.3 关键差异代谢物层级聚类分析
在OPLS-DA模型的基础上,结合VIP>1且P<0.05筛选目标差异活性化合物。共寻找到差异化合物230个,其中上调化合物125个,下调化合物64个,由于本实验所检测到的差异代谢物数量较多,故选取丰度前50的代谢物进行层级聚类分析,2组样本间的差异代谢物热图如附图1所示,根据组间不同物质的表达值,每一行对应一种代谢物,每列代表一个样品[31]。红色表示高表达含量,蓝色表示低表达含量,同一组中3个平行组的样品颜色相似,表明重复性好,表达趋势一致。由附图1可以看出,葡萄汁在微生物的作用下产生氨基酸、葡萄糖、有机酸以及萜类化合物等,TANG等[15]详细描述了慕萨莱思发酵过程中微生物群落的自然演替(如曲霉、葡萄糖酸杆菌、酵母的更替)及其对应的代谢物变化。A组的代谢模式与之相符,代表了固有的微生物平衡。然而,肉苁蓉并非惰性物质,其含有的生物活性成分(如PhGs)具有一定的抗菌或抑菌活性[32],这会打破原有的微生物平衡。异罗汉果醇、番红花素B、穿心莲内酯等物质在B组(7%实验组)中含量较高,在A组(对照组)中含量较低,原因是B组相较于A组添加了7%的肉苁蓉,肉苁蓉本身具有极强的抗氧化性,化性,其丰富的抗氧化剂(苯乙醇苷类)为整个体系提供了抗氧化环境,有效地减少异罗汉果醇、番红花素B、穿心莲内酯等物质的氧化分解。L(+)-鸟氨酸、L(+)-瓜氨酸、维生素B7等代谢物在B组含量较低,而在A组含量较高,说明在添加肉苁蓉后,他作为强有力的外界因素,打破原有的微生物平衡,抑制部分功能菌株的生长,改变主流微生物的代谢方向。说明肉苁蓉慕萨莱思相较于传统慕萨莱思具有潜在功能益处。
2.3.4 肉苁蓉慕萨莱思功能性成分分析
本研究通过非靶向代谢组学技术,不仅揭示了风味的形成机制,更鉴定出多种显著富集的功能性活性成分,这为开发肉苁蓉慕萨莱思提供了直接的化学物质基础。葫芦巴碱(trigonelline)在实验组中含量显著上调。该成分已被多项研究证实具有降血糖、降血脂和神经保护作用[33];番红花素作为一种强效的水溶性抗氧化剂,其含量在实验组中同样显著增加。该化合物以其抗炎、抗焦虑和潜在的抗癌活性而闻名;在最佳工艺下(7%添加量,25 ℃),肉苁蓉慕萨莱思的总黄酮和总酚含量分别达到0.80 g/L和0.60 g/L,其抗氧化能力相较于传统产品得到显著强化。这些功能成分的富集主要源于肉苁蓉原料本身的贡献(如苯乙醇苷类、多糖等)[4-5],同时也可能与发酵过程中微生物代谢对活性物质的转化和富集作用有关。
2.3.5 关键差异代谢物火山图分析
差异火山图提供了一种直观的方式来展现代谢物表达量的差异变化,采用VIP≥1,P<0.05为标准,共寻找到差异化合物230个,其中上调化合物125个,下调化合物64个,结果见图3-g。横轴表示折叠变化的log2的对数,纵轴表示显著P值的log10的对数。具有显著差异的代谢物:满足FC≥1且P<0.05 的代谢物用红色表示,满足FC≤1且P<0.05的代谢物用蓝色表示。无显著差异的代谢物以灰色表示。在P<0.05和VIP>1显著性条件下,相对含量变化最显著的前20种化合物如附表2所示,其中上调幅度最大的是糖苷衍生物(log2FC=2.60,FC=6.06),该化合物是一种苯乙醇糖苷衍生物。其含量发生最显著的上调,强烈表明它可能直接来源于肉苁蓉本身的特征性成分。肉苁蓉富含苯乙醇苷类(PhGs)化合物,如松果菊苷、毛蕊花糖苷等。在发酵过程中,这些原型苷类可能在微生物酶的作用下发生水解、糖基转移或分子重排,生成此类新型苷类衍生物。差异代谢物分析显示,多种氨基酸及其衍生物,如(E)-N5-(1-氨基亚乙基)-L-鸟氨酸(log2FC=1.76,上调)、曲格噁唑烷(log2FC=1.80,上调)和蛋氨酸乙酯(log2FC=-1.46,下调)发生显著变化,这与TANG等[15]研究结果相吻合,研究指出,微生物利用高糖环境合成氨基酸是风味形成的前提。肉苁蓉的添加可能为微生物提供了额外的氮源或前体刺激,不仅强化了氨基酸代谢通路的流量,更引导其向特定方向转化,生成了一系列具有特殊风味的氨基酸衍生物。
2.3.6 KEGG代谢通路分析
通过对关键差异代谢物进行KEGG通路富集分析,结果见图3-h。由图3-h可知,前20个重要通路为ABC转运蛋白(ABC-binding cassette transporte proteins)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)、嘌呤代谢(purine metabolism)、氨酰基-tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)、D-氨基酸代谢(D-aminoacid metabolism)、色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)、代谢途径(metabolic pathways)、蓉烷,哌啶和吡啶生物碱生物合成(tropane,piperidineandpyridinealkaloid biosynthesis)、氰氨基酸代谢(cyanoamino acid metabolism)、类黄酮生物合成(flavonoid biosynthesis)、2-氧代羧酸代谢(2-oxocarboxylic acid metabolism)、芥子油苷生物合成(glucosinolate biosynthesis)、黄酮和黄酮醇生物合成(Flavone and flavonol biosynthesis)、咖啡因代谢(caffeine metabolism)、赖氨酸降解(lysine degradation)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine, aspartate and glutamate metabolism)、嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、维生素B6代谢(vitamin B6 metabolism);其中蓝色代表新陈代谢通路,橙色代表环境信息处理通路,绿色代表遗传信息通路;ABC转运蛋白、氨基酸的生物合成、精氨酸生物合成、嘌呤代谢、氨酰基-tRNA生物合成、D-氨基酸代谢,这5条代谢通路显著,富集的化合物数量分别为138个、128个、23个、101个、52个。其中,ABC转运蛋白在微生物细胞膜物质的转运中起着核心作用,通过ATP的水解驱动底物(如糖类、氨基酸、抗生素)的跨膜转运,直接影响微生物的营养获取和环境适应性[34]。葡萄糖酸杆菌利用ABC转运蛋白有效地摄取乙醇底物并驱动乙酸发酵[35]。氨酰基tRNA生物合成是蛋白质翻译中的关键限速步骤。氨基酸代谢在果酒发酵过程中发挥重要作用,其代谢产物可转化为香叶醇等多种特征性香气化合物,是果酒香气形成的关键途径[36]。
3 结论
本研究以新疆和田红葡萄与肉苁蓉为原料,确定肉苁蓉慕萨莱思制备工艺,最佳条件为初始糖度32°Brix、发酵温度25 ℃、肉苁蓉添加量7%,此条件下酒精度(12.6±0.6) %vol,总酸(3.82±0.19) g/L,总黄酮(0.80±0.01) g/L,多酚(0.60±0.00) g/L。肉苁蓉慕萨莱思和传统慕萨莱思基于GC-MS共检测到38种香气成分,其中24种酯类,6种醇类,2种酮类,2种醛类以及其他。添加肉苁蓉的慕萨莱思相较于传统慕萨莱思,关键酯类物质含量显著升高,例如乙酸乙酯(6.42% vs 2.42%)和棕榈酸乙酯(3.75% vs 1.18%);而异丁醇(2.11% vs 3.98%)等高级醇含量显著降低。代谢组学分析显示,添加肉苁蓉后共筛选出230种代谢物显著差异(VIP≥1,P<0.05),包括125种上调物质(如异罗汉果醇、番红花素B)和64种下调物质[如L(+)-鸟氨酸、L(+)-瓜氨酸],KEGG通路富集分析结果显示,差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白,氨基酸的生物合成等通路,葫芦巴碱和番红花素及黄酮多酚等多种功能性活性物质在肉苁蓉慕萨莱思显著富集,并具有潜在保健功能;氨基酸生物合成途径在特征风味的形成中起重要作用。本研究为肉苁蓉在慕萨莱思中的应用提供理论依据。为了更深入地阐明哪些化合物是真正贡献特征风味的关键物质,后续研究可结合气相色谱-嗅闻技术(gas chromatography-olfactory,GC-O)对高含量的挥发性成分进行嗅闻鉴定,以确定其对整体风味的实际贡献度(FD因子)。同时,可采用定量质谱技术(如MRM)对葫芦巴碱、番红花素等关键功能成分进行绝对定量,从而更精确地评估其健康价值。
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