番石榴发酵液对氧化应激损伤的防护作用

番石榴是一种天然植物,隶属于桃金娘科番石榴属,主要分布于热带和亚热带地区,番石榴中包含多酚、黄酮类、多糖等化学成分,在抗炎,抗氧化,抗菌和抗真菌等方向发挥作用。不同部位番石榴的有效成分和生物活性也有较为显著的特点:邝高波等[1]从番石榴果实多酚粗提物中分离出4种组分都具有抗氧化能力和清除自由基活性。随着对植物体内有效成分提取技术的深入研究,微生物发酵技术逐渐与植物研究融合。微生物发酵技术利用微生物的生物酶,在特定的温度和压力条件下,将植物中的大分子物质转化为小分子物质。这一技术使得植物的有效成分在提取和分离过程中更为容易,同时能够降低植物的副作用,产生新的活性成分,提高有效成分的提取率,并减少传统化学提取方法可能造成的环境污染。

过氧化氢(H2O2)是一种常见的氧自由基来源,在机体内部或外部环境因素的刺激下,产生自由基,对机体产生伤害。常用的研究方法是利用H2O2诱导人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblasts,HSFs)建立损伤模型,用于对物质成分的氧化应激损伤的防御功效进行评价。其中,抗氧化酶活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量等是重要的评价指标,多种功效成分可以通过该指标来发挥抵抗氧化应激的功效。JAK-STAT信号通路在衰老细胞中具有高度激活性,通过调节下游基因(BC2、MCL-1)来减缓细胞的衰老以及衰老相关的功能障碍。

因此,本文利用微生物发酵技术制备番石榴发酵液,在生化水平进行自由基清除能力评价,在细胞水平,建立H2O2诱导的HSFs氧化应激损伤模型,评价番石榴发酵液抵抗氧化应激损伤的能力,为其在医药与日化原料抗氧化等方面的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HSFs,中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;成纤维细胞培养基(fibroblast medium,FM),ScienCell公司;DMEM培养基、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素(1×105 U/L)、2.5 g/L胰蛋白酶(含EDTA),美国Gibco生命技术公司;CCK-8试剂,北京百瑞吉生物技术有限公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、脂质氧化产物MDA检测试剂盒、过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒、I型胶原蛋白(collagen type I,COL-I)ELISA检测试剂盒、透明质酸(hyaluronic acid,HA)ELISA试剂盒,碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

WJ-80A-II型CO2恒温培养箱,上海圣科仪器设备有限公司;荧光倒置显微镜(CKX53),日本Olympus公司;Infinite M200 PRO荧光酶标仪、Sunrise酶标仪,瑞士TECAN公司;SPx-250BF-2生化培养箱,上海福玛实验设备有限公司;Quant Studio 3荧光定量PCR仪,美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 实验方法

1.3.1 番石榴发酵液和番石榴水提液的制备

取新鲜的番石榴,用去离子水洗涤,在60 ℃下低温烘干,粉碎,过50目筛。取10 g粉碎的番石榴粉末溶解在200 mL去离子水中,121 ℃灭菌15 min,静置冷却后,接种活化的乳酸菌种子液,在45 ℃静置发酵8～15 h,发酵结束后经过灭菌、离心、分离上清液等操作,获得番石榴发酵液;取10 g粉碎的番石榴粉末溶解在200 mL去离子水中,121 ℃灭菌15 min,静置冷却后,水浴加热90 ℃条件下浸提1 h,在4 800 r/min条件下,离心30 min,之后分离上清液获得番石榴水提液。

1.3.2 活性物质含量的测定

根据参考文献[2],利用苯酚-硫酸法,以D-葡萄糖为标准品,在490 nm波长处测定其吸光度,对10%(体积分数,下同)番石榴发酵液中总糖含量进行测定;根据参考文献[3],采用亚硝酸盐比色法,以芦丁为标准品,在510 nm波长处测定其吸光度,对10%番石榴发酵液和10%(体积分数,下同)番石榴水提液中黄酮类化合物的含量进行测定;根据参考文献[4],采用Folin-Ciocalteu法,在酶标仪上测定760 nm处吸光度,对10%番石榴发酵液和10%番石榴水提液中总酚类化合物的含量进行测定;根据参考文献[5],以牛血清白蛋白为标准品,用福林酚法在650 nm的波长处测定吸光度,对10%番石榴发酵液和10%番石榴水提液中多肽类化合物的含量进行测定;使用植物总糖的还原糖检测试剂盒(DNS微板法)、BCA蛋白定量检测试剂盒测定10%番石榴发酵液和10%番石榴水提液中还原糖和总蛋白的含量,具体步骤请参考试剂盒的说明书。

1.3.3 体外抗氧化活性测定

根据参考文献[6],进行体外DPPH自由基清除能力实验。番石榴水提液和番石榴发酵液体积分数均为3.125%、6.25%、12.5%、25%、50%、100%(体积分数,下同)。根据参考文献[7],进行体外羟自由基(·OH)清除能力实验。番石榴水提液和番石榴发酵液体积分数同样设置为3.125%、6.25%、12.5%、25%、50%、100%。

1.3.4 细胞培养及细胞存活率测定

在DMEM中加入10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青霉素-链霉素(1×105 U/L)用于培养成纤维细胞,细胞在37 ℃、5% CO2的湿润气氛中培养2～3 d,当细胞融合程度达到80%～90%时,将细胞以每孔1×104的细胞密度接种于96孔板中,置于37 ℃、5% CO2的湿润气氛中培养24 h,设置空白组(番石榴发酵液体积分数为0)和样品组(番石榴发酵液体积分数分别为0.3125%、0.625%、1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%)。在培养24 h的96孔板中加入不同体积分数的样品后,以换液的形式每孔加入CCK-8溶液10 μL,在培养箱中放置2 h,使用酶标仪在450 nm波长处测量OD值,计算细胞存活率。

1.3.5 H2O2诱导的损伤模型的建立

将成纤维细胞接种于96孔板,细胞数为1×104个/孔,并在37 ℃和5% CO2下培养24 h,然后每孔加入100 μL不同浓度的H2O2(0～2 000 μmol/mL)刺激细胞,之后采用CCK-8方法(同1.3.4节)检测细胞存活率,在450 nm处测量OD值。最终选择细胞存活率约为50%的H2O2浓度(1 000 μmol/L,4 h)作为建模条件。

1.3.6 ROS含量的测定

将HSFs以约3×105个/孔的密度接种于6孔板中,培养细胞24 h,使用1 000 μmol/L H2O2损伤4 h建立H2O2诱导的损伤模型,用PBS清洗后,每孔加入2 mL样品液,培养24 h后倒掉培养液,并用PBS轻洗2次。在每个孔中加入2 mL的10 μmol/L DCFH-DA溶液,培养20 min后取出并弃去,用1 mL无血清培养基洗涤3次以完全去除DCFH-DA探针。每个孔中加入1 mL PBS,用荧光显微镜拍摄荧光照片,实验全程避光,用细胞刮刀收集细胞,将上述细胞接种至黑色透明底96孔板中,每孔100 μL,设置激发波长488 nm,发射波长525 nm,用荧光酶标仪测定荧光值。

1.3.7 细胞内CAT活性、COL-Ⅰ、HA和MDA含量的测定

将HSFs接种于6孔板中,每孔接种3×105个细胞,培养24 h,直到细胞贴壁达到约80%。使用PBS洗涤2次,然后模型组和样品组加入2 mL H2O2溶液(1 000 μmol/L),对照组加入2 mL无血清的DMEM培养基,刺激4 h,再用PBS清洗2次,随后,样品组加入2 mL 10%的番石榴发酵液,对照组和模型组则加入2 mL无血清DMEM培养基,以50 μg/mL维生素C作为阳性对照,该质量浓度下细胞存活率大约为80%。所有组别均在37 ℃细胞培养箱中继续培养24 h,培养结束后,吸取孔内培养液,进行离心处理,收集上清液备用,随后使用试剂盒检测CAT活性、COL-Ⅰ、HA和MDA含量。

将HSFs接种于6孔板,密度为5×105个/孔,接种24 h。按照1.3.6节的样品处理方式处理细胞,随后收集细胞,按照说明书使用TriQuick总RNA提取试剂提取成纤维细胞中的RNA。使用FastQuant cDNA kit进行cDNA第一链合成反应,进一步将反转录获得的cDNA使用Fast Super evgreen®qPCR Master Mix和qRT-PCR进行检测,引物序列如表1所示。

1.4 数据处理

实验数据利用GraphPad Prism 9.5.0软件进行图片绘制,利用SPSS 19.0数据处理软件进行统计学处理,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义,所得结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 活性物质含量

按照1.3.2节检测方法,对番石榴水提液和番石榴发酵液中总糖、多糖、还原糖、多肽、蛋白质、总酚和黄酮等含量进行测定,结果如表2所示。番石榴发酵液的总糖、多糖、还原糖、多肽、蛋白质和黄酮含量均高于番石榴水提液,表明发酵过程有效提高了生物活性物质的含量。蛋白质和多肽在发酵过程中有重要作用,尤其是在代谢过程中,它们可能是微生物生长和酶活性的重要组成部分。较高的蛋白质含量表明发酵过程中微生物或原料中有较多的蛋白质被转化或保持在发酵液中,可能与微生物的代谢活动相关。

2.2 自由基清除能力的测定

图1为不同体积分数番石榴发酵液的自由基清除能力,由图1可知,随着体积分数的提高,发酵液和水提液对DPPH自由基和·OH的清除能力均逐渐升高。番石榴提取物的自由基清除能力已有报道[8],本研究所采用的乳酸菌发酵方式并没有降低番石榴的抗氧化功效。

进一步分析发现,番石榴发酵液在清除·OH方面的能力较弱,其清除50% DPPH自由基的体积分数为2.33%,番石榴水提液清除50% DPPH自由基的体积分数为4.40%;番石榴发酵液清除50%·OH所需的体积分数为74.16%,番石榴水提液清除50%·OH所需的体积分数为88.10%,结果表明番石榴发酵液清除DPPH自由基和·OH 清除能力均优于番石榴水提液。

·OH是生物体内活性最强、破坏性最大的自由基之一,具有极高的反应活性,主要通过夺取电子或氢原子引发链式氧化反应,其清除机制通常需要抗氧化剂直接提供电子或通过螯合金属离子(如Fe2+)阻断Fenton反应;DPPH自由基是一种人工合成的稳定自由基(脂溶性),其清除机制为抗氧化剂提供质子或电子使其单电子配对。据报道,多糖类物质(如苦荞多糖)因含有酚类化合物或特定单糖组成(如葡萄糖醛酸),可能在DPPH自由基清除中表现优异,但对·OH的清除能力可能较弱[9],这与本研究结果相似。尽管番石榴发酵液对·OH的清除能力并不优异,也可能和反应体系pH、金属离子等因素干扰有关。该结果也进一步说明了番石榴发酵液未来作为抗氧化剂的选择性和环境依赖性。

2.3 对细胞存活率的影响

本研究探讨了体积分数为0.312 5%～40%番石榴发酵液和阳性对照维生素C对HSFs存活率的影响(图2)。实验结果表明,当发酵液占比为0.312 5%～5%时,番石榴发酵液对HSFs表现出显著的增殖效果(P<0.001),其中在10%体积分数时,细胞存活率与空白组相比无显著性差异(图2-A)。这表明番石榴发酵液在10%以下体积分数时,对HSFs几乎无细胞毒性,且在一定体积分数范围内具有显著的增殖作用。维生素C在质量浓度≤50 μg/mL时,细胞存活率均在80%以上,后期选择50 μg/mL维生素C作为阳性对照上样质量浓度(图2-B)。图2-C为H2O2建模条件的摸索,选择50%细胞存活率条件(1 000 μmol/L)作为建模条件。进一步,本研究探讨了样品对H2O2诱导的细胞损伤模型的保护作用(图2-D)。结果表明,阳性对照维生素C及番石榴发酵液预处理均可显著减轻H2O2所致的细胞损伤,细胞存活率均显著高于模型组。

2.4 番石榴发酵液对ROS的抑制作用

紫外线照射会引起氧化应激反应,促进ROS的产生,使用DCFH-DA荧光探针可以检测HSFs中ROS水平。如图3所示,未经H2O2损伤的对照组的ROS含量较低,荧光较少,强度较弱;经过H2O2损伤后,与对照组相比,模型组ROS含量较高,绿色荧光显著增加,荧光强度增强,表明H2O2的处理能够诱导细胞产生较高水平的ROS,进而可能引发氧化应激反应。然而,当加入阳性对照(维生素C)和番石榴发酵液后,细胞内的ROS水平显著下降,荧光信号减弱,表明番石榴发酵液具有明显的抗氧化作用,其效果与阳性对照(维生素C)相当,荧光强度比值为1.06。番石榴提取物也具有降低细胞ROS水平的作用,有研究利用2,2′-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐诱导细胞氧化损伤,与对照组相比,细胞内ROS水平显著升高(P<0.05),利用番石榴粗提取物预处理后,细胞内ROS水平显著降低(P<0.05),与对照组相比,荧光强度比值为1.6[10]。与番石榴粗提取物相比,番石榴发酵液降低细胞ROS水平的作用更为显著,表明番石榴发酵液在抗氧化方面的活性较为突出,能够有效清除多种自由基,这进一步验证了番石榴发酵液具有良好的抗氧化活性。

2.5 番石榴发酵液对细胞CAT活性、MDA含量、COL-I、HA分泌的影响

CAT是一种酶类清除剂,可以通过将H2O2分解为氧和水,清除体内的自由基,降低H2O2对细胞损伤。MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物质,MDA水平升高可引发氧化应激反应,导致细胞损伤甚至细胞死亡。COL-I是重要的胶原蛋白之一,其含量和比例不仅影响皮肤弹性和机械强度,而且对原纤维直径具有决定性作用。HA是皮肤的主要成分,发挥着组织水合作用和生物力学特性的作用,皮肤中的HA含量随着年龄的增长而减少。本研究对番石榴发酵液在H2O2的损伤的HSFs中CAT、MDA、COL-I、HA水平的影响进行测定,以判断其防护氧化应激损伤的效果。

如图4所示,H2O2处理显著抑制了HSFs中CAT活性、COL-I和HA的分泌水平,同时显著促进了MDA的积累,表明H2O2成功诱导了细胞损伤模型。随后,分别加入阳性对照维生素C和番石榴发酵液处理H2O2损伤细胞后,发现CAT、COL-I和HA的表达水平均显著提高,而MDA含量显著降低。值得注意的是,番石榴发酵液在抑制H2O2诱导的细胞MDA积累以及促进COL-I表达方面均优于50 μg/mL维生素C处理组。

2.6 番石榴发酵液对JAK-STAT信号通路相关基因表达的影响

JAK-STAT信号通路是介导炎症反应促进皮肤氧化应激反应重要的信号通路,当细胞因子与受体结合后,激活JAK激酶,进而磷酸化STAT蛋白,使其形成二聚体并进入细胞核调控基因表达[11]。该信号通路的激活促进促炎细胞因子(如IL-6、TNF-α)的表达,间接增加ROS的产生。此外,STAT蛋白可能直接调控抗氧化酶的表达,如超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶,从而影响氧化应激水平[12]。靶向JAK2-STAT1信号转导,可以干扰该通路关键蛋白JAK2的磷酸化,从而阻断下游STAT1蛋白的磷酸化[13]。

如图5所示,本实验通过qPCR技术检测了H2O2诱导损伤对JAK-STAT信号通路相关基因表达的影响。实验结果表明,H2O2处理后,JAK2和STAT1基因的表达水平呈现显著上调趋势(P<0.05)。然而,当细胞经番石榴发酵液处理后,JAK2和STAT1的表达水平显著下降(P<0.05),表明番石榴发酵液可能通过抑制JAK-STAT信号通路的活化发挥保护作用。

Bcl-2和MCL-1作为Bcl-2家族核心抗凋亡成员,在氧化应激损伤的调控中发挥关键作用[14-15]。进一步分析下游基因的表达情况发现,H2O2处理导致Bcl-2基因的表达显著上调(P<0.05),而番石榴发酵液处理后,Bcl-2的表达水平明显降低(P<0.05)。此外,MCL-1基因在H2O2处理后也呈现显著上调趋势(P<0.05),而经过番石榴发酵液处理后,其表达水平显著下降(P<0.05)。这与以往文献报道有所不同,Bcl-2和MCL-1的激活具有保护细胞免受氧化应激损伤的作用。在氧化应激(如H2O2处理)下,MCL-1通过直接与促凋亡蛋白Bax结合,阻止其线粒体膜插入和寡聚化,从而抑制线粒体通透性转换孔的开放,减少ROS爆发和细胞色素释放[16-17]。Bcl-2过表达能够抑制氧化应激诱导的线粒体膜电位崩溃,并通过抑制促凋亡蛋白Bak的激活,减少ROS生成。在肝细胞中,Bcl-2与MCL-1的双重缺失会显著增强线粒体氧化损伤和DNA氧化产物(如8-羟基脱氧鸟苷)的积累[18-19]。初步分析,可能存在其他代偿通路抵消抗凋亡因子被抑制所造成的细胞内部生物过程的改变。

3 结论与讨论

在体外抗氧化研究中,自由基清除实验扮演着关键角色,因为自由基的过量产生可能导致氧化应激反应,损害细胞结构并促进疾病发生[13]。细胞氧化模型被广泛应用于评估植物化学物质对人体健康的影响,可以通过测定DPPH自由基和·OH清除能力,CAT活性、MDA水平、COL-I含量、HA含量、ROS水平以及炎症因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)表达,全面评估其抗氧化能力及影响细胞氧化状态的能力。

利用微生物发酵技术探索防护氧化应激损伤的潜在功效原料是一个重要途径。微生物发酵可转化原料中的成分,产生具有抗氧化功能的活性物质。本课题对番石榴水提液和番石榴发酵液中活性物质含量进行测定,结果发现总糖、蛋白物质的含量均有一定程度的增加,表明微生物发酵在样品制备过程中的营养富集作用。多糖、还原糖、多肽含量的增加,可能是由于微生物对大分子糖类及蛋白质的分解作用。此外,黄酮类成分得到了一定程度的提高,可能与微生物分解番石榴屏障类成分使得番石榴黄酮得以溶出有关,另一方面原因可能是与微生物本身黄酮类代谢产物的积累有关。从其抗氧化活性指标来看,番石榴发酵液具有非常优异的DPPH自由基清除能力(IC50=2.33%),高于发酵前(IC50=4.40%)样品。尽管·OH清除能力并不优异,但也从结果中得出发酵液的略微优势。这与番石榴处理方式导致的成分的变化极为相关,基于成分测试结果,本研究已经得知发酵过程使糖类、多肽类、黄酮类成分含量提高,这些成分的抗氧化功效是已有报道的[1-7,20]。尽管总酚含量并没有在发酵后得到提升,但是并不能否认其在抗氧化活性方面的作用,其种类的变化以及抗氧化作用机制的差异是需要考虑的重点。另外,微生物发酵代谢产物的积累也有助于最终发酵液对氧化应激损伤的保护作用[21]。本课题组前期已对酵母菌[22]、裂褶菌[23]、乳酸菌[24-25]等进行了代谢产物应对氧化应激损伤的相关研究,均表现出较好的防护作用。课题组前期利用酿酒酵母对海地蘑菇进行发酵处理,发酵液在光损伤诱导的皮肤HaCaT细胞模型和H2O2诱导的HSF细胞模型上均具有更为显著的保护作用[22]。裂褶菌(Schizophyllum commune)制备的3种谷物(大米、青稞、燕麦)发酵液均具有非常显著的保护细胞氧化损伤的作用,经研究发现,PI3K-AKT信号通路从中发挥重要调控作用[23]。此外,利用乳酸菌发酵制备的一系列植物发酵液也具有显著的抵抗细胞衰老、修复细胞损伤等活性[24-25],这些都为番石榴的深加工利用提供了理论支持。

番石榴中含有多种有效成分,通过微生物发酵技术可以提高番石榴中有效成分的利用率,还能降低植物的毒副作用。由本研究结果可知,利用乳酸菌制备的番石榴发酵液在体外实验中表现出显著的自由基清除能力,尤其是对DPPH自由基和·OH的清除能力随着发酵液体积分数的增加而增强。ROS是氧化应激的主要产物,而MDA是脂质过氧化的标志性产物,二者在皮肤衰老过程中起着重要作用。在细胞水平,番石榴发酵液能够有效降低ROS和MDA的产生和积累,提高了抗氧化酶CAT的水平。此外,损伤细胞的COL-I和HA水平也得到了不同程度的提高。有研究表明,薏苡仁发酵提取物和水提取物与对照组相比,超氧化物歧化酶和CAT的活性和mRNA表达降低了近一半。与模型组相比,在2%(体积分数)下,薏苡仁发酵提取物和水提取物均显著提高了超氧化物歧化酶和CAT的活性和mRNA表达,且薏苡仁发酵提取物的影响更显著。用薏苡仁发酵提取物和水提取物处理的细胞显示蛋白水解酶COL-I和HA的活性显著增加,mRNA表达增加3倍以上。此外,MMP-1的酶活性显著降低,薏苡仁发酵提取物处理的细胞mRNA表达水平接近未损伤细胞模型[26]。虽然发酵底物不同,但是仍然可以说明植物发酵提取物能够显著提高H2O2诱导损伤成纤维细胞中CAT、COL-I和HA含量和抑制MDA的积累。这些结果不仅验证了番石榴发酵液作为天然抗氧化剂的潜力,也为其作为抗衰老功效原料的研发提供了理论支持。

JAK2-STAT1信号通路在炎症反应和细胞存活中起着重要作用。JAK2-STAT1通路的过度激活会驱动促炎细胞因子(如TNF-α、IL-6)的释放,加剧炎症损伤。此外,JAK2-STAT1可与TLR4、NF-κB等通路形成正反馈环,放大炎症信号[27]。本实验发现,在转录水平,番石榴发酵液对JAK2-STAT1信号通路的激活有显著的抑制作用,尽管课题后期并没有在蛋白水平进一步进行验证,但这也为其抵抗氧化应激损伤奠定了一定的理论基础。

值得注意的是,番石榴发酵液对Bcl-2和MCL-1的表达也具有抑制作用。Bcl-2和MCL-1是Bcl-2家族中关键的抗凋亡蛋白,Bcl-2和MCL-1的抑制被报道可能加剧线粒体氧化应激,Bcl-2和MCL-1通过结合促凋亡蛋白(如Bax、Bak)维持线粒体外膜完整性,当两者被抑制时,Bax/Bak寡聚化并插入线粒体膜,导致膜电位崩溃和线粒体通透性转换孔开放,释放大量ROS(如超氧阴离子、H2O2)[28]。番石榴发酵液发挥地抗氧化应激损伤功效的机制可能存在其他代偿通路[29]用以抵消该促凋亡蛋白抑制所造成的细胞伤害。

在安全性方面,番石榴发酵液对HSFs的毒性影响较小,表明其具有较高的安全性和适用性,这对于其在医药与日化原料中的应用至关重要。此外,该结果还提示番石榴发酵液可能在较高浓度下仍能保持较低的细胞毒性,为后续开发高浓度活性成分的产品提供了可能性。

综上所述,基于对番石榴发酵液多方面抗氧化和细胞保护机制的分析,本研究认为其作为一种潜在的抗衰老功效性原料,有望应用于未来功效性食品、功效护肤品的开发中,但仍需进一步的机制、临床和长期安全性评估。

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