碳水化合物,通常被称为糖类,广泛存在于自然界的生物体中。常见的糖类形式包括单糖、二糖、糖醇、低聚糖和多糖等,它们不仅是重要的功能性物质,也是食品中不可或缺的营养成分,同时也是肠道微生物的能量来源。葡萄糖、蔗糖和乳糖是微生物优先利用的碳源物质。木糖醇和麦芽糖醇是食品中最常用的代糖。鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖和半乳糖醛酸是天然多糖的重要单糖组成成分。
碳水化合物是菌体生长繁殖的关键营养物质,碳水化合物种类不同会导致菌体的碳源利用代谢能力出现差异,菌体生长速率,代谢酶活性和菌体密度都会产生差异[1]。微生物的碳源利用谱也是其重要的生理生化特性。传统方法会利用菌株代谢产酸导致酸碱指示剂变色的特性来验证微生物对不同碳源的利用能力,该方法虽然简单,但是不适宜用于所有菌株,而且每个碳源要分开配制,更不能研究在复杂组合碳源体系下,微生物对不同碳源的利用顺序。因此,能够快速准确监测微生物在复杂混合碳源中对不同碳源代谢能力差异与顺序的方法显得尤为重要。
非淀粉多糖不能被人体消化吸收,到达大肠后被肠道菌群分解并发挥特定生理功能,JIMENEZ等[2]研究指出,拟杆菌降解果胶产生的半乳糖醛酸,可作为指示胃肠道内微生物与病原菌关系的信号分子。由于肠道中的糖的本底含量极低,因此开发一种兼具低检测限、多类型及覆盖多组分分析能力的糖类物质定量方法,对研究非淀粉多糖的降解研究也具有重要意义。
糖的分析主要有生物学方法和仪器分析方法,其中生物学方法的检测范围较窄,仅能对少数种类的糖进行测定。大多数糖类分析都是使用仪器分析方法,4种主要色谱技术与各种检测器相结合进行,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)[3-4]、液质联用(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)[5]、气质联用(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)[6]、毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)[7]及离子色谱法(ion chromatography, IC)[8-11]等技术。由于糖类的热不稳定性和低挥发性,糖类物质基本不具备紫外和荧光吸收特性,样品衍生是气相、液相和毛细管电泳方法经常要面对的。与同等度灵敏度的仪器方法相比,离子色谱法在测定糖类成分时,样品前处理简单,无需衍生化,且具有较强的专一性,因此在糖类含量测定中受到广泛关注[12]。
糖类化合物结构上的羟基具有弱酸性,在强碱性介质中会部分或全部以阴离子形式存在,同时其结构中还存在疏水部分。糖类化合物依据糖类pKa值差异和疏水作用差异,可以在阴离子交换柱上实现有效分离,配合具有较高的灵敏度的脉冲安培检测器可以实现低含量糖类物质的检测[13-14]。
离子色谱隶属于液相色谱技术范畴,其对未知组分的定性能力存在先天局限。近年来,随着除盐抑制器的引入,离子色谱仪与质谱联用的技术也被应用于糖类化合物的定性和定量分析[15]。当前能够同时监测多种类型的碳水化合物的离子色谱方法仍较为有限[9,16-18]。文献[19-21]报道,采用Dionex CarboPacTM MA1、PA20、PA10及PA100色谱柱,已实现糖醇、单糖、二糖与糖醛酸的同时分离;另有文献指出[22-23],PA1与PA10色谱柱同样具备分离多类型碳水化合物的能力。微生物发酵体系中碳水化合物组成复杂而难以鉴定,为此本研究拟通过优化离子色谱条件,建立一种可同时测定糖醇、单糖、二糖、糖醛酸等多类型碳水化合物,并尽可能覆盖更多组分的分析方法。在此基础上,进一步验证该方法在研究微生物碳源利用偏好性中的可行性,以期为微生物碳代谢相关研究提供新的技术选择与思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤藓糖醇(纯度>99%)、木糖醇(纯度>99%)、山梨糖醇(纯度>98%)、甘露醇(纯度>99%)、海藻糖(纯度>99%)、岩藻糖(纯度>98%)、麦芽糖醇(纯度>95%)、鼠李糖(纯度>98%)、氨基半乳糖盐酸盐(纯度>98%)、氨基葡萄糖盐酸盐(纯度>99%)、D-果糖(纯度>99%)、乳糖(纯度>98%),上海安谱实验科技股份有限公司;半乳糖(纯度>99%)、葡萄糖(无水,纯度>99.5%)、D-甘露糖(纯度>99%)、D-葡萄糖醛酸(纯度>98%)、醋酸钠(纯度>99.9%),美国Sigma公司;木糖(纯度>99%,Fluka)、蔗糖(纯度>95%)、麦芽糖一水合物(纯度>95%)、核糖(纯度>98%)、阿拉伯糖(纯度>98%)、半乳糖醛酸一水合物(纯度>97%)、氢氧化钠溶液(质量分数为50%),国药集团化学试剂有限公司;实验用水,Milli-Q超纯水机制得。
1.2 仪器与设备
ICS5000+离子色谱仪(配备ED5000电化学检测器、Chromeleon7.2色谱工作站,低温AS-AP自动进样器),美国Thermo Scientific公司;Au工作电极、PH-Ag/AgCl复合参比电极,Dionex Carbo PacTM PA100 Analytical(4 mm×250 mm),Dionex Carbo PacTM PA100 Guard(4 mm×50 mm);Milli-Q超纯水仪,美国Milli-pore公司;ME104E/02电子天平,瑞士梅特勒-托利多仪器公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制
精密称取适量赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、岩藻糖、麦芽糖醇、鼠李糖、氨基半乳糖、阿拉伯糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖、核糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等标准品(精确至0.000 1 g),采用超纯水溶解定容至100 mL,获得质量浓度为2 000 mg/L的标准混合储备液。采用超纯水将标准混合储备液稀释成一定质量浓度的标准混合工作液,于4 ℃避光冷藏保存,现配现用。
1.3.2 样品处理方法
本实验所用的发酵液样品为嗜热链球菌发酵液,样品经过离心,上清液采用超纯水稀释500倍后,过0.22 μm水相滤膜后进样分析。
1.3.3 仪器条件样品
离子色谱条件:Dionex CarboPacTM PA100 Analytical(4 mm×250 mm),Dionex CarboPacTM PA100 Guard(4 mm×50 mm);积分脉冲安培检测模式;工作电极:Gold(Au);参比电极:AgCl电极;电位波形:Gold,Carbo,Quad;流动相:A相:NaOAc (1 000 mmol/L),B相:NaOH淋洗液(200 mmol/L),C相:NaOH淋洗液(25 mmol/L),D相:去离子水;流速:0.45 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。梯度淋洗条件见表1。
表1 离子色谱梯度淋洗条件
Table 1 Gradient elution conditions of ion chromatography
时间/minA相体积分数/%B相体积分数/%C相体积分数/%D相体积分数/%曲线0.00020.080.0510.00020.080.0510.1015.0085528.0015.0085528.10100.000540.00100.000540.11550.0035555.01550.0035555.10100.000565.00100.000565.1002080575.00020805
1.4 数据处理分析
采用Chromeleon 7.2.10ES 色谱分析软件采集谱图及处理原始数据。采用Excel 2016、Origin 2025b软件进行后续数据分析与图表绘制。
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化
2.1.1 色谱柱的选择
在强碱性溶液环境下,糖类化合物在阴离子交换分离柱上的作用机制涵盖阴离子交换与疏水性吸附,其保留行为主要取决于化合物的电荷数量、分子尺寸、化学组成及结构特征。具体而言,糖醇作为糖类醛基或酮基被还原的产物,因酸性极弱,在离子色谱柱上的保留能力较弱;而糖醛酸分子含羧基、酸性较强,与阴离子交换柱固定相的结合力则相对更强[13]。
通过对PA1、PA20、MA1及PA100 4种色谱柱的实验对比发现,PA100色谱柱可在相对较短的分析时间内实现多类型碳水化合物的分离,且具备覆盖更多组分的能力,同时展现出峰形尖锐、灵敏度高的优势,适用于发酵液体系中多类型、多组分碳水化合物的检测需求。因此最终选择PA100作为本实验的色谱柱。
2.1.2 梯度淋洗液的选择
在初步分离的过程中观察到,使用PA100色谱柱时,随着NaOH浓度的提升,糖类物质的保留能力逐渐减弱。其出峰顺序大致为:糖醇类组分、单糖类组分、二糖类组分、糖醛酸和低聚糖类组分。需要注意的是,低聚糖和糖醛酸类组分必须通过具有强淋洗能力的乙酸钠洗脱后才会出峰。
根据保留强度,将22种组分分为4个类别。第一类为弱保留组,包含组分1～6:组分1为赤藓糖醇,组分2为木糖醇,组分3为山梨糖醇,组分4为甘露醇;组分5为海藻糖;组分为6岩藻糖。第二类为中等强度保留组,包含组分7～15:组分7为麦芽糖醇,组分8为鼠李糖,组分9为氨基半乳糖,组分10为阿拉伯糖,组分11为氨基葡萄糖,组分12为半乳糖,组分13为葡萄糖,组分14为甘露糖,组分15为木糖。第三类为强保留组,包含组分16～19:组分16为果糖,组分17为核糖,组分18为蔗糖,组分19为乳糖。最后,极强保留组包括组分20～22:组分20为麦芽糖,组分21为半乳糖醛酸,组分22为葡萄糖醛酸。
为了有效分离22种组分并提升检测的灵敏度与分离效果,进行了多次实验对比,依据淋洗时间和洗脱浓度,最终确定了多级梯度洗脱的最佳条件(表1)。在这些最优淋洗条件下,4 mg/L的混合标准溶液的离子色谱图如图1所示。
图1 二十二种组分混合标准溶液的离子色谱图
Fig.1 Chromatogram of a standard mixture of 22 sugars
注:图中数字1～22对应色谱峰分别代表1.赤藓糖醇(erythritol);2.木糖醇(xylitol);3.山梨糖醇(sorbitol);4.甘露醇(mannitol);5.海藻糖(trehalose);6.岩藻糖(fucose);7.麦芽糖醇(maltitol);8.鼠李糖(rat plum sugar);9.氨基半乳糖(amino galactose);10.阿拉伯糖(arabinose);11.氨基葡萄糖(glucosamine);12.半乳糖(galactose);13.葡萄糖(glucose);14.甘露糖(mannose);15.木糖(xylose);16.果糖(fructose);17.核糖(ribose);18.蔗糖(sucrose);19.乳糖(lactose);20.麦芽糖(maltose);21.半乳糖醛酸(galacturonic acid);22.葡萄糖醛酸(glucuronic acid)(下同)。
洗脱过程被划分为5个时间段:0～10 min、10～28 min、28.1～40 min、40.1～55 min,而55.1～75 min则用于系统的冲洗和平衡时间。初始淋洗浓度是整个多级梯度淋洗条件的基础,调整这一浓度会直接影响到首批洗脱组分的分离选择性。在0～10 min的初始阶段,设置了5、7.5、10 mmol/L的NaOH始浓度,结果显示NaOH浓度的变化对糖醇类组分的分离效果影响不大,均能实现组分1～6的分离。然而,较低的初始洗脱浓度为后续后续组分的分离提供了更大的大选择空间,因此最终选择5 mmol/L的NaOH作为0～10 min的洗脱浓度。在固定0～10 min时间的淋洗液浓度的基础上,进一步针对10～28 min的淋洗液浓度进行优化。后续其他时间段的淋洗液浓度优化,均参照此思路进行。
在10～28 min的时间范围内,依次使用了20、30、40 mmol/L的NaOH的浓度,均能有效分离组分7～组分15(图2-a～图2-c)。然而,40 mmol/L的NaOH浓度对组分7～组分15为高浓度时分离度效果不佳,而20 mmol/L的NaOH洗脱浓度则导致组分7～组分15的峰高降低,不仅影响检测的灵敏度,还会对后续组分16～组分19的分离产生影响。因此,决定将30 mmol/L的NaOH作为10～28 min时间段的洗脱浓度。
a-20 mmol/L NaOH;b-30 mmol/L NaOH;c-40 mmol/L NaOH
图2 组分7～组分15在不同淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.2 Chromatogram of a standard mixture of 22 sugars for components 7-15 at different initial concentrations
在28.1～40 min的时间段内,依次采用了160、180、200 mmol/L的NaOH来洗脱二糖,发现对组分16～组分19分离度效果影响不大,但是200 mmol/L的NaOH洗脱浓度有助于后续组分20的快速分离(图3-a～图3-c)。因此,在28.1～40 min的时间段选择200 mmol/L的NaOH作为洗脱浓度。
a-160 mmol/L NaOH;b-180 mmol/L NaOH;c-200 mmol/L NaOH
图3 组分16～组分19在不同淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.3 Ion chromatogram of mixed standard solution for components 16-19 at different initial concentrations
在进行洗脱时,强保留的糖醛酸和低聚糖类组分需要通过具有强洗脱能力的乙酸钠来实现洗脱。因此,在40.1～55 min的时间段内,保持NaOH的浓度为100 mmol/L,并分别设置了100、150、200 mmol/L NaOAc与NaOH配合进行洗脱(图4-a～图4-c)。较低浓度的乙酸钠有助于糖醛酸的分离,但也会相应延长分离的时间。因此,在这一段时间内,乙酸钠的洗脱浓度可以根据样品的复杂性进行调整。在本方法中,选择了浓度为100 mmol/L的NaOH与150 mmol/L的NaOAc进行搭配。
a-100 mmol/L NaOH+100 mmol/L NaAc;b-100 mmol/L NaOH+150 mmol/L NaAc;c-100 mmol/L NaOH+200 mmol/L NaAc
图4 组分20～组分22在不同淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.4 Ion chromatogram of mixed standard solution for components 20-22 at different initial concentrations
通过调整NaOH溶液和NaOAc溶液的浓度,以提高糖类化合物的分离效果。本文使用1 000 mmol/L NaOAc、0.20 mmol/L和0.025 mmol/L的NaOH溶液以及水,采用四元梯度洗脱法,成功在55 min内实现了22种糖的良好分离。
2.1.3 柱温的选择
色谱柱的温度是影响分析方法灵敏度、选择性和稳定性的重要因素。在相同实验条件下,我们研究了26、28、30、32、35 ℃的色谱柱温度下各组分的分离效果,结果如图5-a～图5-e所示。由图5可以看出,尽管22种组分的整体保留时间没有显著变化,但温度对各个组分的分离度影响却各不相同。特别是组分4和组分5的分离度受温度影响较大,在26 ℃时这2个组分完全分开,而在35 ℃是几乎无法分离,表明高温对它们的分离不利。相反,组分7～组分10、组分18～组分19的分离度随着温度的升高而改善,在26 ℃ 时这些相邻组分几乎重叠,但在30 ℃时它们基本上得以分离。色谱柱温度升高时,组分5、组分7、组分9、组分18相较于相邻组分被洗脱的速率更快。糖类物质在色谱柱上的保留过程表现为放热反应,温度升高会导致其保留能力减弱,但不同糖类受温度影响的程度存在差异。结合文献推测[13],组分5、组分7、组分9、组分18可能因分子质量较大,在与固定相结合的保留过程中放热量更高,受温度变化的影响更为显著;温度升高时,这类组分的保留能力减弱程度更大,因此能更快被洗脱。
a-26 ℃;b-28 ℃;c-30 ℃;d-32 ℃;e-35 ℃
图5 不同柱温下混合标准溶液的离子色谱图
Fig.5 Ion chromatograms of a mixed standard solution at different column temperatures
同时,随着柱温的升高,各组分峰形均变得更加尖锐,从而提高了灵敏度。但综合考虑多组分的整体分离效果和灵敏度,最终选择30 ℃作为实验的柱温。
2.1.4 流速的选择
在相同实验条件下,研究了流速为0.35、0.40、0.45、0.50、0.55 mL/min下22种组分的分离效果(图6-a～图6-e)。结果显示,随着流速的提高,整体分离时所需时间减少,各组分的峰形变得更加尖锐,有助于提升被检测组分的灵敏度。流动相流速的变化对组分7与组分8、组分16～组分20的分离度产生显著影响。当流速为0.35 mL/min时,组分7与组分8出现峰重叠,且组分16～组分20的分离效果亦不理想;当流速提升至0.4 mL/min时,上述组分均能与相邻峰实现有效分离。流速增大后,组分7、组分16、组分18、组分20相较于相邻组分被洗脱的速率更快。推测其原因可能在于:这些组分的分子结构存在差异,导致其与色谱柱固定相的吸附作用相对较弱,在洗脱过程中受动力学洗脱因素的影响更大,进而随流速增加更快被洗脱。需说明的是,该结论暂未通过系统验证实验证实,仅为一般性推测。综合考虑,流速设定在0.4 min/mL或0.45 mL/min较为合适。
a-0.35 mL/min;b-0.40 mL/min;c-0.45 mL/min;d-0.50 mL/min;e-0.55 mL/min
图6 不同流速下混合标准溶液色谱图
Fig.6 Ion chromatograms of a mixed standard solution at different flow rates
2.2 方法验证
2.2.1 线性范围与检出限
配制了22种组分的混合标准溶液,质量浓度分别为0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/L,共计9个不同的浓度水平。分析在1.3.3节仪器条件下进行,以各待测物质的质量浓度(X)作为横坐标,峰面积(Y)作为纵坐标,拟合出线性方程。同时,计算待测组分的检出限(S/N=3)。由表2可知,赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇和海藻糖的线性范围均为0.10～6.0 mg/L,而其余17种组分的线性范围均为0.10～10 mg/L。所有22种组分的线性相关系数(r2)均>0.995,检出限为5.0～98 μg/L。
表2 二十二种组分的线性范围,线性方程,相关系数及检出限
Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficient and limits of detection of the 22 components
序号组分线性范围线性范围r2检出限/(μg/L)(S/N=3)1赤藓糖醇0.10～6.0Y=2.081 9X+0.385 00.995 15.42木糖醇0.10～6.0Y=1.450 3X+0.124 00.998 98.53山梨糖醇0.10～6.0Y=2.005X+0.230 70.998 08.44甘露醇0.10～6.0Y=2.078 5X+0.179 10.999 08.25海藻糖0.10～6.0Y=1.502 3X+0.111 50.999 28.86岩藻糖0.10～6.0Y=1.788 7X+0.049 50.999 8137麦芽糖醇0.10～10Y=2.427 6X+0.026 10.999 8268鼠李糖0.10～10Y=1.898 3X+0.050 70.999 7159氨基半乳糖0.10～10Y=4.558 1X+0.020 10.999 79.610阿拉伯糖0.10～10Y=2.400 7X+0.035 10.999 81411氨基葡萄糖0.10～10Y=4.250 7X-0.070 30.999 81212半乳糖0.10～10Y=2.757 3X-0.026 70.999 81713葡萄糖0.10～10Y=3.186 5X+0.015 90.999 81614甘露糖0.10～10Y=2.501 9X+0.009 70.999 82115木糖0.10～10Y=2.983 1X+0.070 90.999 41816果糖0.10～10Y=1.086 7X-0.019 70.999 47617核糖0.10～10Y=2.173 9X+0.010 90.999 31518蔗糖0.10～10Y=1.306 6X-0.162 40.998 51519乳糖0.10～10Y=1.802 9X+0.040 40.999 05.020麦芽糖0.10～10Y=1.016 8X-0.016 90.999 99821半乳糖醛酸0.10～10Y=0.628 1X-0.015 00.999 79822葡萄糖醛酸0.10～10Y=0.919 6X+0.006 10.999 639
2.2.2 方法的准确度与精密度
由于不同发酵液的成分种类和含量各异,且同一发酵液中各组分的含量差别显著。因此,选择若干发酵液合并,并进一步稀释100倍,随后向其中添加3个不同质量浓度水平(0.5、2.0、4.0 mg/L)的混合标准溶液。每个浓度水平下进行6次平行加标实验,以验证发酵液基质测定时的方法的准确性和精密度。根据混合基质稀释后各组分的浓度、添加浓度解测定浓度计算回收率。表3展示了3种浓度水平下、6次平行加标检测的平均回收率和及相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)数据。
表3 二十二种组分在实际样品中3个加标水平下的平均回收率及精密度(n=6)
Table 3 Average recoveries and precisions of the 22 components spiked in samples at three levels (n=6)
序号组分 加标浓度/(mg/L)0.502.04.0平均回收率/%RSD/%回收率平均/%RSD/%平均回收率/%RSD/%1赤藓糖醇831.65972.82922.882木糖醇1002.14922.53921.843山梨糖醇1002.591082.331002.174甘露醇892.761072.671041.725海藻糖1102.601033.241002.606岩藻糖1031.361042.791032.447麦芽糖醇942.911002.91992.168鼠李糖942.541012.90992.469氨基半乳糖1002.501032.601022.9010阿拉伯糖952.80983.02912.9511氨基葡萄糖1032.431032.591012.3712半乳糖992.261012.33991.8113葡萄糖1012.901032.641002.1314甘露糖1001.751022.791002.0215木糖931.981092.671002.1316果糖1012.91973.56972.5817核糖982.02912.621002.4818蔗糖8411.7993.23952.6719乳糖1072.491023.021022.8120麦芽糖962.511002.83992.1321半乳糖醛酸772.96942.93972.1122葡萄糖醛酸913.01972.89991.98
注:a)回收率/%=(测量值-背景值)/理论添加量×100,b)为混合发酵液稀释100倍后的测量值与背景值。
根据表3数据显示,在3种浓度下的22种组分的平均回收率基本为83%～110%(唯一例外是半乳糖醛酸在0.5 mg/L时的回收率为77%)。6次平行加标的回收率RSD基本为1.36%～3.56%(蔗糖在0.5 mg/L的6次平行加标回收率RSD为11.7%为例外)。由于蔗糖的出峰时间恰好为于淋洗液浓度变化的拐点,基线的影响导致其在在0.5 mg/L的加标水平下精密度较低。此外,半乳糖醛酸0.5 mg/L的加标水平回收率略显不足,主要是由于色谱柱的背景污染。总体来看,该测定方法展现出较高的准确性和良好的精密度。
3 实际样品分析
在嗜热链球菌培养基中,最初加入约1%的葡萄糖、蔗糖和乳糖,以及大约0.4%的果糖,并在不同时间点对发酵液中糖分含量进行检测。
在不同时间点(0、4、10、24 h)采集发酵液样本,使用超纯水将其稀释至约500倍,然后通过0.22 μm水相滤膜进行过滤。接着,按照预设的色谱条件进行分析,采用外标法进行定量,发酵液中的糖类含量见表4。
表4 嗜热链球菌代谢前后糖类含量
Table 4 Carbohydrate content before and after metabolism of Streptococcus thermophilus
序号组分含量/%0 h4 h10 h24 h1半乳糖0.0220.580.350.182葡萄糖1.020.560.110.0293果糖 0.400.480.480.434蔗糖 1.330.0580.0570.0575乳糖 1.100.170.170.18
在4 h的时间点,蔗糖的含量显著减少,乳糖的含量降至约0.17%,而半乳糖的含量急剧上升至0.58%,葡萄糖的含量保持在0.56%(图7,表4)。这表明,蔗糖几乎完全被嗜热链球菌代谢以提供能量,乳糖被嗜热链球菌吸收并分解为葡萄糖和半乳糖,葡萄糖作为碳源被利用,而半乳糖则未被利用而排出细胞外。通过比较4 h发酵液中葡萄糖、蔗糖和半乳糖的变化,可以看出葡萄糖的代谢速度相对较慢,且在10 h和24 h其含量持续下降。对比4 h和10 h的糖含量变化(图7,表4),发现半乳糖的含量也开始逐渐减少,但其代谢速度略低于葡萄糖。这表明,在大部分蔗糖和乳糖被代谢后,嗜热链球菌仍然缓慢地代谢葡萄糖,并开始利用排出的半乳糖,但半乳糖的代谢优先级低于葡萄糖。比较10 h和24 h的情况,半乳糖的代谢速度开始略高于葡萄糖。此外,因其他糖类检测结果无变化,故未在文中展示。
图7 嗜热链球菌代谢前后碳源变化情况
Fig.7 Changes in carbon source before and after metabolism of Streptococcus thermophilus
嗜热链球菌是一种常用于乳制品发酵的微生物,然而大多数菌株对半乳糖呈阴性,仅能代谢由乳糖水解所产生的葡萄糖,这与本检测结果相符[24]。根据PENG等[25]的研究,嗜热链球菌IMAU20246在以蔗糖作为唯一碳源的情况下,能够产生最高量的胞外多糖。此外,嗜热链球菌IMAU20246通过ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统以及氨基糖和核苷酸糖的代谢,优先调节对蔗糖的利用。
通过对0～24 h内糖类含量的监测,可以观察到葡萄糖、蔗糖和乳糖的代谢情况存在差异,且其代谢优先级别各不相同,而果糖几乎不参与代谢。这项实验有效地展示了嗜热链球菌对不同类型碳源的偏好。
4 结论
本研究建立了一种离子色谱分析方法,同时检测22种糖醇、单糖、二糖及糖醛酸。这22种化合物在此方法中表现出良好的分离效果,样品经过稀释和过滤后可直接进行分析,无需任何衍生步骤,操作简便。此外此方法在准确性和精密度方面表现良好,能够有效分析和定量微生物发酵液中的糖类组分,为发酵液中成分及其浓度的分析提供了一种新的检测手段,能够快速直观评估微生物对碳源的利用情况。此方法的建立为研究微生物对碳源利用偏好性提供了新的选择,进而推动了微生物碳代谢的研究。
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