茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf 的干燥菌核,是临床应用广泛的药食同源药材,具有利水渗湿、健脾宁心之功效[1]。研究表明,茯苓多糖作为具有抗氧化、消炎、抗肿瘤、降血糖等功效的天然生物大分子,是茯苓中的主要活性成分之一[2-7]。而多糖的生物活性与其一级结构,特别是单糖组成密切相关[8]。产区地理环境对茯苓产品品质有显著影响。市面上均以产自云南、安徽大别山、湖北九资河的茯苓品质为佳,不同产地茯苓所含的功效成分也不尽相同[9]。不同产地的气候、土壤等生态因子可能通过调控多糖的生物合成途径,致初级及次级代谢产物的积累产生差异,导致多糖中的单糖组成与比例具有一定差异。这为基于单糖组成特征进行产地鉴别提供了可能[10]。现有研究主要聚焦于茯苓多糖的初步结构表征、生物活性研究等方面[11],缺乏对不同产地茯苓多糖中的单糖组成解析及差异化研究,未能充分挖掘其在茯苓产品产地鉴别中的应用价值。
单糖组成的测定方法主要有硫酸-苯酚法、液相色谱法、气相色谱法、液相质谱法等[12-13]。传统方法如硫酸-苯酚法虽操作简便但特异性差;由于单糖具有不易挥发、不产生紫外和荧光吸收等特点,气相色谱与高效液相色谱常需衍生化处理,不仅流程繁琐,还可能引起结构信息丢失。离子色谱法凭借其无需衍生、灵敏度高、分离能力强,被广泛应用于中性单糖与酸性糖醛酸的同时测定[14-16]。
因此,本研究采集了云南、安徽、河南、湖北4个主产区的12批茯苓样品,首先对茯苓多糖中单糖(含其醛酸)组成的微波消解-离子色谱法进行了优化,精准分析了茯苓多糖中单糖组成及其含量差异,进一步结合主成分分析、偏最小二乘分析、线性判别分析等化学计量学分析方法对其进行产地鉴别,并筛选出可用于产地鉴别的潜在标志性单糖成分,为茯苓多糖的质量控制及产地溯源深入研究提供可靠的方法学依据与数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验所用茯苓来自云南、河南、湖北和安徽,经鉴定为真实茯苓干燥菌核原料(表1)。
表1 茯苓样品信息表
Table 1 Information of Poria cocos samples
样品名称样品类型产地/来源FL1、FL2、FL3茯苓干燥菌核云南楚雄彝族自治州(YN)FL4、FL5、FL6茯苓干燥菌核安徽安庆(AH)FL7、FL8、FL9茯苓干燥菌核河南南阳(HN)FL10、FL11、FL12茯苓干燥菌核湖北襄阳(HB)
超纯水,实验室超纯水机;无水乙醇、三氟乙酸均为分析纯,上海瑾博有限公司;甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、氨基葡萄糖对照品(纯度均≥97.7%,均为HPLC级),北京汇科同创有限公司;核糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、半乳糖醛酸对照品(纯度均>95%,HPLC级)、三氯甲烷、正丁醇为分析纯、NaOH、NaOAc为优级纯,北京伊诺凯科技有限公司;透析袋(3 500 kDa),北京索莱宝有限公司。
1.2 仪器与设备
ICS-6000离子色谱仪(配备安培检测器、Au工作电极、Ph-Ag/Ag复合参比电极),美国Thermo Fisher公司;超纯水机,优普超纯科技有限公司;Multiwave 5000微波消解仪,安东帕(上海)商贸有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,常州中捷实验仪器制造有限公司;xiande-2000A智能水浴旋蒸仪,上海贤德实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的制备
称取葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、氨基葡萄糖、果糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸标准品适量,分别置于容量瓶中,加水溶解后定容制得质量浓度为1 mg/L的标准品储备液,并逐级稀释至浓度适宜的混合标准品溶液。
1.3.2 样品溶液的制备
1.3.2.1 茯苓多糖的提取
将茯苓干燥菌核原料置于45 ℃烘箱中烘干,粉碎过筛。参考张婷婷等[17]的方法并稍作修改。根据本实验前期得到的最佳提取条件,称取4 g茯苓粉末置于烧杯中,加入80 mL蒸馏水后,置于水浴锅中60 ℃浸提3 h,过滤取上清液,旋蒸至5 mL,加入4倍体积的无水乙醇,4 ℃醇沉12 h,8 000 r/min离心15 min,收集沉淀,用10 mL蒸馏水复溶,采用Sevage试剂[V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1]脱去蛋白,收集上清液转移至透析袋中透析3 d去除小分子杂质,冻干,即得茯苓多糖。
1.3.2.2 茯苓多糖的水解
取上述茯苓多糖粉末1.0 mg于消解罐中,加入10 mL 1 mol/L三氟乙酸溶液,于微波消解仪中110 ℃水解30 min,水解完毕后取出,旋蒸至干,并于10 mL容量瓶中定容,摇匀,量取2 mL稀释至6 mL,过0.22 μm滤膜,即得样品溶液。
1.3.3 离子色谱条件
参考SUKSOM等[18]的方法并略作改动,流动相:A为超纯水,B为100 mmol/L NaOH和170 mmol/L NaOAc的混合水溶液;C为200 mmol/L NaOH,梯度洗脱程序如下:0 min时A 98%、B 2%、C 0%;0.5～30.0 min时A 99%、B 1%、C 0%;30.1～40 min时A 0%、B 100%、C 0%;40.1～46 min时A 0%、B 0%、C 100%;柱温30 ℃;进样量25 μL;流速0.2 mL/min;色谱柱:Thermo Carbo PACTM PA20(3 mm×150 mm,粒径6 μm);脉冲安培检测器采用糖标准四电位波形。
1.3.4 茯苓多糖水解条件优化设计
称取1.3.2.1节中制备的茯苓多糖样品1 mg,分别考察微波消解温度(90、100、110、120、130 ℃)、微波消解时间(10、20、30、40、50 min)、三氟乙酸浓度(0.5、1、2、3、4 mol/L)对茯苓多糖消解效率的影响。微波消解后,稀释至适当倍数后进离子色谱仪检测。
在单因素试验结果的基础上,以总单糖含量为检测指标,对影响因素:水解温度(A)、水解时间(B)、三氟乙酸浓度(C)通过正交试验表进行试验设计,空列(D)用于误差分析,因素水平见表2。
表2 多糖水解正交试验设计
Table 2 Orthogonal experiment for polysaccharide hydrolysis
水平因素A/℃B/minC/(mol/L)190200.521003013110402
1.4 数据处理
所有数据平行测定3次,采用SPSS 25.0软件进行显著性分析和线性判别分析,P<0.05认为差异具有统计学意义。采用Origin 9.1软件进行主成分分析(principal component analysis, PCA),采用SIMCA14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 茯苓多糖水解条件优化结果
传统的多糖水解方式为酸法高温消解,存在操作繁琐和耗时较长等缺点,本实验采用微波消解技术对茯苓多糖进行水解,能够缩短样品前处理的时间、加快水解速度及降低检测成本[19]。如图1-a～图1-c所示,茯苓多糖水解得到的总单糖含量随着水解温度、水解时间和三氟乙酸浓度的升高,整体都呈现先升后降的趋势;如图1-a所示,在90～100 ℃范围内,升温促进了糖苷键断裂,总单糖得率增加;但当温度超过110 ℃时,过高的温度可能导致部分单糖降解,致使总糖含量下降。
如图1-b所示,延长水解时间有助于多糖的充分水解,但超过30 min后则可能引发单糖的二次降解。如图1-c所示,三氟乙酸浓度的提高提供了更多的H+以催化水解,但浓度过高也可能促使副反应发生,破坏单糖结构[20]。
a-温度对多糖水解的影响;b-时间对多糖水解的影响;c-浓度对多糖水解的影响
图1 浓度、时间和温度对茯苓多糖水解的影响
Fig.1 Effects of concentration, time, and temperature on the hydrolysis of Poria cocos polysaccharides
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
正交试验结果(表3)表明,各因素对多糖水解的影响顺序为B>A>C>D,即时间>温度>浓度>空白,最优提取条件为A3B2C2,即微波温度110 ℃、微波时间30 min、三氟乙酸浓度1 mol/L。由表3可知,在该最优实验条件下,多糖水解后的总单糖含量为(38.74±0.38)mg/L,高于正交试验中其他试验组, 可见, 该正交试验结果可靠。
表3 多糖水解正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal for polysaccharides hydrolysis
编号A(温度)/℃B(时间)/minC(浓度)/(mol/L)D(空白)总糖含量/(mg/L)1111133.0232.8232.922221235.8836.5436.213331336.2835.9536.114322138.3739.1238.745212336.6334.8636.756132235.2033.9634.087123336.1537.2436.708233136.8136.9337.379313234.6334.7834.70K1312.09311.11315.72326.11K2327.99334.96327.71315.99K3328.68322.69325.33326.67k134.6834.5735.0836.23k236.4437.2236.4135.11k336.5235.8536.1536.30最优水平A3B2C2D3R1.842.651.331.12主次顺序BACD
从表4可知, P值的显著性概率小于0.05,均达到显著性水平,说明茯苓多糖水解效果和微波时间、微波温度及三氟乙酸浓度之间存在极显著的关系。
表4 多糖水解正交试验方差分析
Table 4 Orthogonal experiment variance analysis of polysaccharides hydrolysis
方差来源平方和自由度均方F值P值A19.56329.78215.5690.000B31.583215.79225.1350.005C8.92824.4647.1050.000误差12.566200.628
2.2 离子色谱法方法学验证
为确保分析结果的可靠性,对离子色谱法进行了方法学验证,结果表示,12种单糖及糖醛酸在各自质量浓度范围内线性关系良好(表5,R2>0.993 3),仪器精密度[相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<3%]、方法重复性(RSD<2%)、样品稳定性(RSD<2%)及加标回收率(84.57%～110.88%)均符合定量分析要求,表明该方法准确、可靠,适用于茯苓样品中单糖组成的准确定量。
表5 十二种单糖的线性关系、线性范围、定量限和检出限
Table 5 Linearity, linear ranges, limits of quantitation, and limits of detection of twelve monosaccharides
目标物保留时间/min线性关系 R2线性范围/(mg/L)定量限/(mg/L)检出限/(mg/L)岩藻糖6.551y=4.397 3x-0.297 60.993 331.0～6.00.2000.060鼠李糖13.042y=2.249 1x+1.239 50.995 761.0～6.00.5500.165阿拉伯糖13.726y=4.355 8x+2.373 30.998 961.0～6.00.3300.100氨基葡萄糖15.276y=5.392 6x-0.213 50.994 850.5～8.00.1400.105半乳糖17.151y=4.369 2x+2.214 10.999 311.0～6.00.0950.030葡萄糖19.767y=6.230 5x+1.887 90.990 941.0～6.00.0950.030木糖23.334y=5.013 5x+2.415 80.999 031.0～6.00.1300.040甘露糖24.634y=5.549 8x-0.867 50.998 821.0～6.00.0400.010果糖27.884y=2.235 0x-0.350 40.996 402.0～7.01.7200.515核糖30.559y=5.132 9x-0.155 10.999 801.0～6.50.8450.250半乳糖醛酸42.909y=3.146 3x+0.028 30.999 831.5～6.00.1500.050葡萄糖醛酸44.876y=5.350 2x+2.439 10.999 850.5～8.00.1500.050
2.3 不同产地茯苓多糖的单糖组成及含量
应用本研究建立的微波消解-离子色谱法,对来自4个主要产区(云南、安徽、河南、湖北)的12批茯苓中的单糖组成进行了系统分析。如表6所示,所有茯苓多糖样品均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、氨基葡萄糖和木糖6种单糖组成。这与前人研究[21-22]中茯苓水溶性多糖以葡萄糖和半乳糖为主的结论基本一致。同时,由表7可知,6种单糖组分的平均物质的量比为:1∶5.34∶17.97∶21.29∶42.80∶46.64。
表6 茯苓多糖的单糖组成及含量(x±s, n=3) 单位:mg/g
Table 6 Monosaccharide composition and content of actual Poria cocos polysaccharide
样品木糖氨基葡萄糖岩藻糖甘露糖半乳糖葡萄糖FL11.08±0.056.58±0.3815.83±0.2224.55±0.2244.29±0.2557.50±1.25FL21.09±0.045.56±0.3515.45±0.2324.45±0.0936.94±0.6055.32±1.05FL30.33±0.023.25±0.209.74±0.3817.82±0.4933.63±0.1742.36±0.97FL40.56±0.061.86±0.047.38±0.288.55±0.0920.44±0.6926.56±0.67FL50.63±0.021.87±0.057.55±0.118.48±0.0320.42±0.1326.06±0.30FL60.72±0.023.07±0.148.91±0.108.52±0.2625.36±0.8824.26±1.07FL70.32±0.034.75±0.2012.23±0.2717.03±0.1234.29±0.1029.00±0.49FL80.34±0.024.51±0.1512.46±0.2416.41±0.5034.37±0.2425.22±1.15FL90.84±0.085.23±0.1212.94±0.2916.60±0.5939.78±0.9531.12±1.08FL100.29±0.031.89±0.0810.57±0.109.11±0.1021.98±1.0625.90±0.56FL110.44±0.023.26±0.2612.93±0.2213.84±0.7729.04±0.4525.98±0.66FL120.45±0.033.39±0.1413.33±0.5715.80±0.7023.71±0.7527.65±0.79
表7 茯苓多糖中单糖物质的量比
Table 7 Molar ratio of monosaccharides in Poria cocos polysaccharide
产地木糖氨基葡萄糖岩藻糖甘露糖半乳糖葡萄糖云南15.1514.6922.2538.2551.67安徽12.9911.8511.1828.9833.64河南18.0922.9327.7860.2147.38湖北16.0428.4427.2752.5955.97
进一步分析发现,不同产地茯苓多糖的单糖含量存在显著差异(P<0.05)。如表6与图2所示,云南所产茯苓多糖中葡萄糖(42.36～57.50 mg/g)显著高于安徽(24.26～26.56 mg/g)、河南(10.39～14.49 mg/g)和湖北(14.06～14.47 mg/g)三地;同时,云南(33.63～44.29 mg/g)和河南(34.29～39.78 mg/g)所产茯苓多糖中的半乳糖含量显著高于安徽(20.42～25.36 mg/g)和湖北(21.98～29.04 mg/g),这些组成差异很可能与产地的地理环境和栽培条件密切相关[23]。例如,云南产区以其独特的高原红壤、适宜的温度和湿度而闻名,这些因素可能更利于特定结构多糖的合成与积累[24]。安徽大别山区的黄棕壤和垂直气候特征,也可能塑造了其独特的单糖比例。表7中单糖物质的量比进一步揭示了不同产地茯苓多糖的结构有所不同,例如河南样品显示出较高的半乳糖比例,而湖北样品则显示出较高的岩藻糖比例。以上具有显著差异性的单糖组成数据,提示其可能作为茯苓多糖产地溯源的潜在标志物。
图2 四产地茯苓多糖中6种单糖的含量
Fig.2 Contents of 6 monosaccharides in Poria cocos polysaccharide from four producing areas
2.4 化学计量学分析
为进一步验证不同产地茯苓多糖中的单糖组成的差异性,本研究采用化学计量学方法进行系统分析。
2.4.1 PCA
PCA可以采用降维的思想替代多维具有相关性的数据,不损失原有的主要信息[25]。前2个主成分(特征值>1)累计贡献率达89.25%,说明所提取的主成分因子能够较为全面地体现茯苓产地间多糖中的单糖的综合信息。其中,第一主成分甘露糖、氨基葡萄糖、半乳糖和岩藻糖均具有较高的载荷值,说明第一主成分主要反映了这4种单糖的信息;同理,第二主成分中木糖和葡萄糖具有较高的载荷值。用方差贡献率较大的第一和第二成分绘制散点图,图3显示,样品被分为两类,安徽与其他产地可以区分开,但云南、河南和湖北产地样本点存在部分重叠。这表明安徽产地的茯苓多糖具有最为独特的单糖组成特征,这可能与其特定的土壤类型(黄棕壤)和山区垂直气候密切相关。PCA无法有效地区分其余3个组别,这表明仅依靠无监督模型难以实现所有产地的精准判别。
图3 不同产地茯苓多糖的PCA图
Fig.3 PCA plot of polysaccharides from Poria cocos of different origins
2.4.2 OPLS-DA
为进一步解析茯苓多糖中的单糖组成与产地之间的关联,并筛选出区分产地的关键特征标志物,本研究进一步采用了有监督的正交偏最小二乘判别模型进行数据分析,其通过正交信号校正滤除与分类无关的变异,可放大组间特征差异并量化模型的解释率与预测能力,其样本分离效果显著优于PCA[26]。建立的OPLS-DA模型中,R2X为0.997,R2Y为0.909,预测参数Q2为0.879>0.5,表明该模型预测能力较好[27]。为预防模型过拟合现象,对模型进行200次置换检验,结果(图4-b)显示R2和Q2的回归线斜率均大于0,且R2截距值为0.036 3和Q2截距值为-0.37,表明所构建的模型,未出现过拟合现象,结果稳定可靠。由图4-a可知,OPLS-DA可以将不同产地的茯苓多糖样本分为四类,每个产地各聚为一类,判别效果显著,表明这6个单糖含量在评价样品产地之间的差异具有重要参考价值。
a-OPLS-DA图;b-置换检验图;c-VIP图
图4 不同产地茯苓多糖的OPLS-DA图、置换检验图和VIP图
Fig.4 OPLS-DA plot, permutation test plot, and VIP plot of Poria cocos polysaccharide from different producing areas
基于OPLS-DA模型计算了变量重要性投影(variable importance projection, VIP)值,以VIP>1.0为标准筛选对产地区分贡献最大的单糖组分[28]。如图4-c所示,葡萄糖、岩藻糖和半乳糖的VIP值最高,被确定为区分茯苓产地的关键标志性单糖。这一发现与2.3节中含量分析的结果相互印证,进一步证实了这3种单糖在茯苓产地溯源中的应用潜力。
2.4.3 线性判别分析
采用线性判别分析验证OPLS-DA中VIP值大于3的3个单糖指标并建立产地识别模型,采用交叉验证法进行验证和评价,结果见表8,可以看出4个产地茯苓样品的初始分组正确率和交叉验证正确率均为100%,说明该判别函数可以用于茯苓的产地分类,具备较高的预测能力。
表8 不同产地茯苓的线性判别分析
Table 8 Linear discriminant analysis of Poria cocos from different producing areas
分类线性判别分析结果产地云南安徽河南湖北正确率/%初始分组云南9*000安徽09*00100河南009*0湖北0009*交叉验证云南9*000安徽09*00100河南009*0湖北0009*
注:*,样品分类正确。
3 结论与讨论
本研究构建了一套集成了微波消解-离子色谱分析与多元化学计量学模型的完整分析策略,用于茯苓的产地鉴别。研究结果表明,该方法能精准测定茯苓多糖的单糖组成,通过化学计量学分析发现,仅依靠PCA难以实现所有产地的精准判别,而OPLS-DA则可清晰区分四大产区茯苓多糖,进一步分析筛选出葡萄糖、岩藻糖和半乳糖可作为区分不同产地茯苓多糖的关键标志性单糖。同时,建立的线性判别分析模型对茯苓产地判别的正确率高达100%,充分证明了该模型的有效性。本研究将多糖中的单糖组成分析与化学计量学模型结合,不仅有助于完善茯苓的质量控制与开发利用,也为茯苓及其他药食同源多糖类物质的质量控制和产地鉴别提供了可靠的科学依据。后续研究可通过扩大取样并整合环境因子,深度解析驱动茯苓多糖合成的生态机制,从而更全面地揭示产地与多糖组成之间的内在规律。
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