木质纤维素是自然界中最丰富的可再生碳源之一,其主要成分纤维素和半纤维素通过降解可转化为单糖,进而作为原料广泛应用于生物能源、食品和饲料等领域[1]。然而,纤维素结构复杂且稳定,其有效降解主要依赖于多种糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)的协同作用[2-3]。其中,β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, BGL)是纤维素降解过程的限速酶,可将纤维二糖和纤维寡糖彻底水解为葡萄糖[4-5]。β-葡萄糖苷酶已被广泛应用于多种生物工程领域,如在生物能源与生物质转化领域,β-葡萄糖苷酶能显著提高木质纤维素的糖化效率与葡萄糖转化率,从而提升生物乙醇产量[6];在食品工程领域,β-葡萄糖苷酶能高效水解果蔬和植物汁液中的糖苷键,释放芳香化合物,从而改善葡萄酒、果汁与茶的感官风味[7-8];在饲料加工领域,β-葡萄糖苷酶在畜禽和动物饲料中可通过分解纤维素及相关多糖,提高粗饲料的可消化性,改善营养吸收率,从而提升饲料利用效率[9]。
真菌是β-葡萄糖苷酶在自然界中的主要来源。真菌源β-葡萄糖苷酶主要分布于糖苷水解酶GH1和GH3家族,且在底物范围、结构特征及催化机制上具有显著差异。此外,在GH2、GH5、GH9、GH17、GH30、GH39、GH116[10-11]和GH132[12]等家族中也发现少量β-葡萄糖苷酶成员,多属于特化型或偶发性存在,其功能可能与特定生态适应或代谢需求相关。值得注意的是,GH3家族β-葡萄糖苷酶以保守双结构域和广谱底物识别为典型特征,是纤维素降解过程中的关键酶。目前,β-葡萄糖苷酶研究多集中在其功能特性的阐明,而针对其序列和结构特征的系统分析相对较少。
木霉属(Trichoderma)是真菌中β-葡萄糖苷酶的主要产酶类群[13],具有高效的分泌能力和环境适应性,且其β-葡萄糖苷酶在结构特征、底物特异性及功能表现上均呈现出显著多样性[12,14]。目前,围绕木霉属β-葡萄糖苷酶序列特征、结构和功能关系的研究仍然有限,在一定程度上制约了对其结构多样性和潜在应用价值的深入认识。为弥补此不足,本研究对来源于木霉属的137条β-葡萄糖苷酶序列进行了系统性分析,包括家族分布、理化性质、亚细胞定位、信号肽与跨膜结构域、保守基序、结构特征及蛋白质相互作用网络等多个方面,旨在揭示其分子结构与功能特性,解析其在纤维素降解网络中的潜在功能与协同机制,为后续定向改造与工业应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究数据来源于NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov),以“(β-glucosidase) AND“Trichoderma””为搜索词检索来源于木霉属的β-葡萄糖苷酶,以FASTA格式下载名称、来源和序列数据。
1.2 实验方法
1.2.1 β-葡萄糖苷酶理化性质分析
将下载的β-葡萄糖苷酶蛋白序列按FASTA格式输入ExPASy ProtParam Tool工具(https://web.expasy.org/protparam/),计算氨基酸组成比例、分子质量(molecular weight, Mw)、理论等电点(isoelectric point, PI)、不稳定指数(instability index, II)及亲水性指数(grand average of hydropathicity, GRAVY)等理化性质参数;利用ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)对β-葡萄糖苷酶的亲水性与疏水性进行分析和预测;使用Composition Profiler(http://www.cprofiler.org)分析GH1、GH3、GH17和GH132家族β-葡萄糖苷酶,以及Swissport51结构数据库蛋白质之间的氨基酸组成差异。
1.2.2 信号肽、跨膜区及亚细胞定位分析
利用SignalP-6.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/)预测蛋白质的信号肽;利用TMHMM 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白跨膜区;利用CELLO(https://cello.life.nctu.edu.tw/)对蛋白质进行亚细胞定位分析与预测。
1.2.3 进化分析
利用MEGA软件进行序列比对,并采用Neighbor-Joining(NJ)方法构建系统发育树(phylogenetic tree)。利用iTOL(https://itol.embl.de/)对系统发育树进行可视化与美化。
1.2.4 蛋白质结构及功能分析
利用NetPhos-3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)预测β-葡萄糖苷酶的磷酸化位点;利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_sopma.html)预测蛋白质二级结构;通过Web CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)及MEME(https://meme-suite.org/meme/)分别预测β-葡萄糖苷酶的结构域和保守基序,并采用TBtools-Ⅱ(https://github.com/CJ-Chen/TBtools-Ⅱ)进行可视化;利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)进行β-葡萄糖苷酶三维结构预测,将所得三维结构的PDB(protein data bank)格式文件导入Proteins Plus Server(https://proteins.plus/)中预测小分子结合口袋(small-molecule binding pockets),并在PyMOL3.2.0a软件中进行可视化展示。从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中分别下载纤维二糖、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷和水杨苷的SDF文件,使用OpenBabel软件将其转化为PDB格式文件作为分子对接的配体,以构建的GFP60323.1蛋白三维结构为受体。采用Autodock1.5.7软件进行分子对接,结果利用PyMOL3.2.0a软件进行可视化展示。
1.2.5 蛋白质相互作用网络分析
利用STRING(http://string-db.org/)数据库预测蛋白质相互作用网络。
2 结果与分析
2.1 β-葡萄糖苷酶序列来源
在NCBI数据库中共检索到212条β-葡萄糖苷酶序列数据,其中未经过验证的序列有75条,已验证的序列有137条。根据物种来源对137条已验证序列进行分类统计,共包括25个木霉属物种[见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044560),下同]。其中,棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的序列数量最多(20条),其次为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、透镜状木霉(Trichoderma lentiforme)和加纳木霉(Trichoderma ghanense),这表明β-葡萄糖苷酶在木霉属不同物种间具有广泛分布,且部分物种可能在纤维素降解能力上具有基因数量优势。
2.2 理化性质分析
对137个β-葡萄糖苷酶进行分类发现,其分别属于糖苷水解酶家族GH1、GH3、GH17和GH132(表1)。总体来看,此部分β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列长度分布在405～1 200氨基酸(amino acids, aa),分子质量分布在44.73～132.82 kDa。不同GH家族在数量、氨基酸序列长度、分子质量及结构域组成上均存在差异(图1)。其中GH3家族β-葡萄糖苷酶占比为62.77%(86/137),其单体序列长度平均为831.56 aa,主要分布在601～1 000 aa(图1-a);其分子质量平均值为90.15 kDa,主要分布在80～100 kDa(图1-b),高于其他家族成员。
表1 β-葡萄糖苷酶在不同糖苷水解酶家族中的分布及结构域分析
Table 1 Distribution of β-glucosidase in glycoside hydrolase family
糖苷水解酶家族β-葡萄糖苷酶数量单体序列长度/aa单体分子质量/kDa等电点(pI)不稳定指数(II)平均亲水性指数(GRAVY)β-葡萄糖苷酶结构域及出现频次GH134450～87450.02～93.915.06～6.2625.55～43.12-0.56～-0.13BglB (29);BglX (4);Glyco_hydro_3_C (3);Fn3-like (1)GH386405～120046.05～128.304.87～6.8824.43～43.12-0.52～-0.02BglX (82);Glyco_hydro_3_C (78);Fn3-like (34);PA14 (17);BglB (4);GAL4(4);Zn_clus (2);CBM_1 (1)GH1714564～67758.16～69.654.92～5.1934.45～46.86-0.03～0.01—GH1323432～50244.76～50.964.99～5.8340.22～49.22-0.28～-0.19SUN (14)
注:“—”为未发现β-葡萄糖苷酶结构域。
a-氨基酸数目分布图;b-分子质量分布图
图1 137个β-葡萄糖苷酶理化性质
Fig.1 Physicochemical properties of the 137 β-glucosidase
结构域分析表明,不同糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶在结构域差异明显(表1)。GH1家族中,BglB是最典型的结构域,在该家族的催化活性中发挥重要作用。GH3家族所含结构域复杂,以BglX和Glyco_hydro_3_C为主,这种多结构域组合表明GH3家族既具备典型的催化和底物识别单元,也可能涉及转录调控(GAL4、Zn_clus)和碳水化合物结合(CBM_1)等功能。GH17家族未检测到特异结构域,可能与其功能特化或序列保守性较低有关。GH132家族均含有SUN结构域,表明其功能具有较高的家族特异性。
在pI分布方面,所有家族的β-葡萄糖苷酶的pI值均小于7.00,为酸性蛋白(表1、附图1)。但不同家族之间存在差异,其中GH3与GH1的平均pI值分别为5.53和5.65,高于GH132(5.23)和GH17(5.06),表明GH3与GH1蛋白整体带有更多正电荷,而GH132与GH17蛋白则更偏酸性。进一步的氨基酸组成分析结果表明,GH3家族中精氨酸(Arg)含量较高,而GH132与GH17中酸性残基天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)比例偏高,这可能是造成家族间pI差异的主要原因(图2)。
图2 GH3家族与GH1、GH17、GH132和SWISS-PROT数据库氨基酸含量分布差异比较
Fig.2 Amino acid distribution of GH3 relative to GH1, GH17, GH132, and SWISS-PROT database
注:***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05,差异具有统计学意义。
II分析结果显示,137个β-葡萄糖苷酶中共有111种蛋白的II值小于40.00,被预测为稳定蛋白,其余26种蛋白被预测为不稳定蛋白(表1、附图1)。在家族水平上,GH132和GH17家族蛋白的II平均值均大于40,属于不稳定蛋白;而GH1与GH3家族蛋白的II均值分别为33.48和32.23,具有较高的稳定性。氨基酸组成分析表明,GH132与GH17家族蛋白中酸性氨基酸(Asp、Glu)及小极性氨基酸(Ser、Thr、Asn)比例较高,但有助于增强蛋白结构刚性的脯氨酸(Pro)含量相对较低,这可能是造成其整体稳定性不足的重要原因(图2)。
亲水性分析结果显示,除GFP56296.1之外,其余β-葡萄糖苷酶均表现为亲水性(表1、附图1)。其中,GH1家族的GRAVY平均值为-0.41,亲水性最强;GH132与GH17家族的GRAVY平均值分别为-0.23 和-0.01,接近中性,呈现亲水/疏水平衡状态;GH3家族的GRAVY平均值为-0.24,介于GH1与GH132/GH17之间,整体仍偏向亲水。氨基酸组成分析结果表明,GH1家族β-葡萄糖苷酶富含极性氨基酸(Ser、Thr和Lys),显著增强其亲水性和溶解性(图2)。相比之下,GH132与GH17的亲水性较弱,可能与其在酸性或复杂胞外环境中的适应性相关。
2.3 亚细胞定位分析
137个β-葡萄糖苷酶的亚细胞定位结果显示,所有酶分布于细胞的4个不同区域(图3-a)。其中,胞外定位最多(77个,56.20%),其次分别为胞质(50个,36.50%)、溶酶体/液泡(8个,5.84%)和细胞核(2个,1.46%)。不同糖苷酶家族间的分布呈现明显差异(图3-b)。GH1家族的β-葡萄糖苷酶主要定位于胞质,而GH132与GH17家族则分布于胞外,表明其可能在胞外纤维素降解中发挥重要作用。GH3家族则呈现出胞外与胞质双重分布,并伴随少量液泡与细胞核定位,表明其可能既参与胞外纤维素降解,也可能在胞内代谢或寡糖再利用中发挥作用。在不同木霉属物种中,β-葡萄糖苷酶的定位亦存在较大差异(图3-c)。多数物种以胞外分布为主,符合其高效纤维素降解的生态功能;而部分物种中胞质定位比例较高,可能在胞内代谢调控或底物加工中具有特殊功能。此外,个别物种在液泡或细胞核中也检测到了β-葡萄糖苷酶,这可能与其酶的转运、翻译后修饰或降解途径相关。
埃塞俄比亚木霉(Trichoderma aethiopicum);苇状木霉(Trichoderma arundinaceum);类棘孢木霉(Trichoderma asperelloides);棘孢木霉(Trichoderma asperellum);深绿木霉(Trichoderma atroviride);南康宁木霉(Trichoderma austrokoningii);短梗木霉(Trichoderma breve);疑似木霉(Trichoderma cf.);火焰茸(Trichoderma cornu-damae);埃文斯木霉(Trichoderma evansii);盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii);加纳木霉(Trichoderma ghanense);纤细木霉(Trichoderma gracile);贵州木霉(Trichoderma guizhouense);哈茨木霉(Trichoderma harzianum);拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis);凸镜形木霉(Trichoderma lentiforme);长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum);东方木霉(Trichoderma orientale);近里氏木霉(Trichoderma parareesei);里氏木霉(Trichoderma reesei);半环木霉(Trichoderma semiorbis);西蒙斯木霉(Trichoderma simmonsii);木霉属未定种(Trichoderma sp.);绿色木霉(Trichoderma viride)。a-β-葡萄糖苷酶亚细胞定位分布图;b-β-葡萄糖苷酶不同糖苷酶家族的亚细胞定位分布图;c-β-葡萄糖苷酶不同种菌株的亚细胞定位分布图
图3 137个β-葡萄糖苷酶亚细胞定位分布图
Fig.3 Subcellular localization distribution of the 137 β-glucosidase
2.4 信号肽预测
信号肽预测结果表明,在137个β-葡萄糖苷酶序列中,共有70个检测到有信号肽(附表2)。预测结果可靠性普遍在95%以上,说明信号肽在木霉属β-葡萄糖苷酶中分布较为稳定。在物种分布上,信号肽广泛分布于除T.koningiopsis和T.viride之外的其他23个物种中,表明大多数木霉属β-葡萄糖苷酶具备潜在的分泌能力。木霉属β-葡萄糖苷酶的信号肽切割位点主要位于第14～36个氨基酸,其中第19～22位点呈现明显的偏好性。这一规律性分布特征表明,木霉属β-葡萄糖苷酶的分泌机制可能在家族内高度保守,从而保证其在胞外纤维素降解中高效发挥作用。
2.5 跨膜结构域预测
跨膜结构域预测结果表明(表2),共有9个β-葡萄糖苷酶序列检测出跨膜结构域,包括GFP59059.1、KAF3073082.1、KAH8128212.1、KAK1237157.1、OPB-41313.1、QYT00323.1、RFU80211.1、XP_073554356.1 和XP_073557155.1。值得注意的是,以上9个β-葡萄糖苷酶均属于GH3家族,在理化性质上表现出较高相似性,如分子质量主要集中在96.65～104.76 kDa,pI分布在5.6～5.88,均为偏酸性、亲水性蛋白。由此推测,GH3家族中部分β-葡萄糖苷酶可能与膜结构结合,在底物转运、膜表面固定或胞内外信号通路中发挥特定作用。同时,这种跨膜特性也为β-葡萄糖苷酶功能多样化提供了结构基础,以区别于传统的胞外可溶性分泌酶。
表2 具有跨膜结构域的β-葡萄糖苷酶的理化性质
Table 2 Physicochemical properties of the β-glucosidase possessing a transmembrane structure
ID糖苷水解酶家族氨基酸数目/aa分子质量/kDa理论pI稳定性脂肪族指数总平均亲水性GFP59059.1GH3957104.245.6639.3981.2-0.361KAF3073082.1GH3955103.945.8734.2179.73-0.327KAH8128212.1GH3957104.275.638.780.28-0.377KAK1237157.1GH3955103.825.7833.8279.02-0.34OPB41313.1GH3955104.095.834.8980.37-0.333QYT00323.1GH3955104.075.8837.7379.43-0.349RFU80211.1GH3961104.765.6338.1182.81-0.326XP_073554356.1GH389896.655.7529.374.11-0.308XP_073557155.1GH3958104.355.736.1578.88-0.356
2.6 磷酸化位点预测
木霉属不同菌株β-葡萄糖苷酶的磷酸化位点分析结果表明,不同β-葡萄糖苷酶的磷酸化位点数量差异较大(图4)。其中RFU74857.1蛋白的磷酸化位点最少,仅为31个,而KAK1253967.1蛋白的磷酸化位点最多,达到133个,差异超过4倍(图4-b)。从磷酸化修饰残基的分布来看,GH1、GH3和GH132家族的磷酸化主要发生在丝氨酸(Ser)残基上,其次为苏氨酸(Thr),而酪氨酸(Tyr)比例最少(图4-a)。但是,GH17家族表现出苏氨酸占比最高的特点,表明该家族可能具有不同的调控模式。
a-不同GH家族β-葡萄糖苷酶磷酸化位点分析;b-不同菌株β-葡萄糖苷酶磷酸化位点分析
图4 137个β-葡萄糖苷酶磷酸化位点分布图
Fig.4 Phosphorylation site distribution of the 137 β-glucosidase
总体来看,β-葡萄糖苷酶的磷酸化修饰以丝氨酸/苏氨酸型可逆磷酸化为主,其中丝氨酸修饰在所有菌株中占主导地位(普遍高于50%),苏氨酸次之,而酪氨酸最少。尽管总体分布规律一致,但在不同GH家族中仍存在差异,如GH17家族中苏氨酸比例相对较高,而GH1、GH3、GH132家族中则明显偏低。以上结果表明,丝氨酸磷酸化是木霉属β-葡萄糖苷酶的主要调控形式,而苏氨酸与酪氨酸的修饰差异可能与物种特异性或酶功能分化相关。
2.7 二级结构组成差异
对GH1、GH3、GH17和GH132共137个β-葡萄糖苷酶的二级结构进行分析(表3、图5)。其中,GH132与GH17以无规卷曲为主,说明其整体构象更具柔性,可能赋予蛋白更强的结构可塑性和环境适应性。而GH1与GH3则含有较高比例的α-螺旋和β-折叠,结构更趋于有序和稳定,可能有助于维持其底物识别的特异性和催化效率。GH132与GH17的无规卷曲比例显著高于GH1与GH3(P<0.05),而GH1与GH3在α-螺旋与β-折叠比例上显著高于GH132(P<0.000 1)和GH17(P<0.05)。聚类分析结果表明(图5),GH132与GH17聚为一类,GH1与GH3聚为一类,提示不同GH家族的β-葡萄糖苷酶在二级结构水平存在明显分化。
表3 GH家族间二级结构组成差异比较
Table 3 Comparisons of secondary-structure composition between GH families
二级结构家族GH1GH3GH17GH132二级结构家族GH1GH3GH17GH132α-螺旋GH1—GH3***—GH17***—GH132*******—延伸链GH1—GH3**—GH17**—GH132*ns*—β-折叠GH1—GH3**—GH17***—GH132*******—无规卷曲GH1—GH3***—GH17***—GH132******ns—
注:***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05,ns表示不显著,—表示对角线(同一组比较)。
图5 137个β-葡萄糖苷酶二级结构分布图
Fig.5 Secondary structure distribution of 137 β-glucosidase
2.8 系统发育树构建与进化关系分析
利用MEGA 11软件[15]对137个β-葡萄糖苷酶的序列构建进化树,结果见附图1。根据系统发育关系,所有序列可分为5个分支(Group Ⅰ～Ⅴ)。其中,GH1和GH3家族主要分布于Group Ⅰ和Group Ⅴ,遗传距离较近,表明其演化过程相对保守。GH132家族集中于Group Ⅱ和Group Ⅲ,分支内部遗传距离最小,表明该部分蛋白可能具有较近的共同祖先。GH7家族则位于Group Ⅳ,遗传距离最远,表明其高度分化并可能伴随功能重塑。
结合信号肽预测结果分析,Group Ⅱ和Group Ⅲ中的所有β-葡萄糖苷酶序列均含有信号肽,而其他含有信号肽的序列主要集中在Group Ⅰ。同时,所有具有跨膜结构域的β-葡萄糖苷酶均属于Group Ⅰ中的GH3家族成员。以上结果表明,分泌潜力和膜结合能力可能是β-葡萄糖苷酶不同进化分支形成的关键特征,并在不同家族间产生了功能分化。
在物种层面上,来源于T.asperellum的β-葡萄糖苷酶数量最多,几乎分布于所有分支中。位于同一节点的β-葡萄糖苷酶蛋白遗传距离相近,表明这些蛋白可能来源于基因复制事件,并在结构和功能上保持较高的保守性。
2.9 棘孢木霉GH3家族β-葡萄糖苷酶保守基序与结构域分析
来源于T.asperellum的20条β-葡萄糖苷酶序列可分属为4个糖苷水解酶家族,包括GH1(3条)、GH3(14条)、GH17(1条)和GH132(2条)。针对GH3家族成员进行保守基序和结构域分析,共识别出10个高度保守的基序(Motif)(图6)。其中,8条蛋白序列(GFP51997.1、GFP52681.1、GFP54387.1、GFP59059.1、GFP60254.1、GFP60334.1、KAK6448986.1和KAK6450858.1)同时包含全部10个Motif,且其在序列中的相对位置高度一致,表明该部分蛋白具有较高保守性,并可能具有相似的结构特征[16-17]。
图6 14条GH3家族β-葡萄糖苷酶基序与结构域
Fig.6 Motifs and domains of the 14 β-glucosidase belong to GH3 family
在所有基序中,Motif 1、Motif 2、Motif 6和Motif 7出现在所有GH3家族中,是该家族β-葡萄糖苷酶的核心保守元件,推测其与催化反应和底物结合相关。进一步分析表明,Motif 1富含柔性残基Gly和Pro及芳香族残基[18],可能在底物进入活性口袋时促进诱导契合并稳定过渡态;Motif 2则兼具极性与疏水残基,可能在底物定位和结合时发挥作用;在Motif 6中,His与Trp的空间邻近构象提示其可能参与酸碱催化;Motif 7中Tyr与Lys/Arg的阳离子-π作用可增强底物锚定与辅因子结合[17,19]。
结构域分析结果表明,14个GH3家族β-葡萄糖苷酶蛋白共包含8个结构域,其中BglX结构域的出现频率最高。该结构域N末端区域为催化核心,而C末端区域则在底物识别和催化效率方面发挥辅助作用[20]。
2.10 棘孢木霉GH3家族β-葡萄糖苷酶三级结构预测及分子对接
通过同源建模法对来源于T.asperellum的14个GH3家族β-葡萄糖苷酶蛋白进行了三级结构预测(图7)。在建模过程中,GFP60323.1与模板蛋白A0A2T4BR41.1.A的序列覆盖率为0.96、一致性达到85%,表明该模板具有良好的适用性,可用于构建可靠结构模型。预测结果显示,GFP60323.1呈现GH3家族典型的双结构域折叠特征,其N端(β/α)8桶样结构域(1～593 aa)构成催化核心,负责糖苷键的水解反应。C端(α/β)6的β-夹层结构域(594～839 aa)通过芳香族残基与糖环相互作用实现底物的识别与捕获,并引导底物进入N端催化口袋完成水解反应[21-22]。可见,N端与C端的协同作用确保了酶在反应过程中的高效性与底物选择性,支持“催化-识别”双功能协作模式,为GH3家族β-葡萄糖苷酶的高效催化活性及底物特异性研究提供了结构依据。
图7 β-葡萄糖苷酶GFP60323.1三级结构及小分子结合口袋
Fig.7 Tertiary structure and small-molecule binding pocket of β-glucosidase (GFP60323.1)
口袋预测结果表明(图7),位于N端桶心的蓝色口袋体积约为1 197 Å3,深度为34.5 Å、表/体比为0.87,呈现相对紧致的构象。其疏水性指数为0.16,表现为偏亲水性,可药性评分为0.81,表明该口袋具备典型的小分子结合潜力。相比之下,橙色口袋体积约为765.8 Å3,深度为29.3 Å、表/体比为1.16,整体形态较为规则。其疏水性指数为0.34,表现为中等疏水,可药性评分为0.87,同样显示出良好的潜在配体结合能力。
为分析GFP60323.1与不同底物的结合模式,对纤维二糖、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷和水杨苷进行了分子对接预测(图8)。结果显示,纤维二糖与GFP60323.1蓝色口袋的结合能为-6.26 kcal/mol,主要通过赖氨酸(Lys)695、丝氨酸(Ser)756、丙氨酸(Ala)757、丝氨酸(Ser)760、精氨酸(Arg)764和苏氨酸(Thr)766与配体形成氢键作用(图8-a、图8-b)。对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷与GFP60323.1橙色口袋的结合能为-5.99 kcal/mol,氢键作用涉及脯氨酸(Pro)349、异亮氨酸(Ile)351、丝氨酸(Ser)352、甘氨酸(Gly)575、丝氨酸(Ser)574和丙氨酸(Ala)388残基(图8-c、图8-d)。水杨苷与GFP60323.1橙色口袋的结合能为-5.26 kcal/mol,其氢键相互作用主要由丝氨酸(Ser)352、缬氨酸(Val)394、甘氨酸(Gly)575和谷氨酸(Glu)576介导(图8-e、图8-f)。
a、b-纤维二糖与GFP60323.1的分子对接结果展示;c、d-对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷与GFP60323.1的分子对接结果展示;e、f-水杨苷与GFP60323.1的分子对接结果展示
图8 GFP60323.1与纤维二糖、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷和水杨苷的分子对接预测
Fig.8 The molecular docking prediction of GFP60323.1 with cellobiose, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, and salicin
经三级结构建模、口袋预测与分子对接的综合分析结果相互印证,确认GFP60323.1具有GH3家族典型的“催化-识别”双功能结构,为深入解析β-葡萄糖苷酶的高效催化机制及底物特异性提供了参考。
2.11 棘孢木霉β-葡萄糖苷酶蛋白质相互作用网络预测
对来源于T.asperellum的14个GH3家族β-葡萄糖苷酶进行蛋白质相互作用网络预测(图9)。结果显示,GFP59059.1蛋白(同源蛋白A0A2T3YT78)的相互作用得分最高,表明该蛋白的相互作用可信度最高。在预测的相互作用网络中,与GFP59059.1蛋白存在相互作用的蛋白包括A0A2T3ZAS8、A0A2T3YT16、A0A2T3ZLZ4、A0A2T3YR50、A0A2T3ZG69、A0A2T3ZAI5、A0A2T3ZMY0、A0A2T3YQZ3、A0A2T3ZGX8和A0A2T3ZQG4等。其中,葡聚糖酶(A0A2T3ZAS8)与GFP59059.1蛋白的相互作用强度最为显著,提示其在多糖水解和细胞壁改造过程中可能存在协同效应。
图9 β-葡萄糖苷酶GFP59059.1蛋白质相互作用网络
Fig.9 Protein interaction network of β-glucosidase (GFP59059.1)
综上,GFP59059.1蛋白不仅与细胞壁降解相关酶形成协作网络,还可能与糖类代谢相关酶及病原相关蛋白共同作用,从而参与植物细胞壁改造、碳源获取及真菌-植物互作过程。这一结果揭示了GFP59059.1在代谢调控和防御反应中的潜在协同作用机制,为进一步解析其生物学功能提供了参考。
3 结论与讨论
β-葡萄糖苷酶作为糖苷水解酶家族的重要成员,在纤维素降解及碳水化合物代谢中发挥关键作用。本研究结果表明,木霉属来源的β-葡萄糖苷酶主要以GH3家族(62.77%)为主,其成员普遍具有较大的分子质量(60～100 kDa)、较长的氨基酸序列(600～1 000 aa)以及复杂结构域组合,其中BglX和Glyco_hydro_3_C结构域高频出现[23-24]。相比之下,GH132和GH17家族在氨基酸序列长度、分子质量及稳定性上与GH1和GH3家族存在明显差异,这2个家族主要定位于胞外,提示其可能在特定生态位中发挥不同的功能。
理化性质分析表明,不同家族β-葡萄糖苷酶在pI、GRAVY及不稳定指数(II)方面存在较大差异。GH1和GH3家族蛋白整体趋于稳定、亲水性较强[25-26],而GH132和GH17稳定性较差且呈现出亲水/疏水平衡状态[27-28],推测后者在复杂环境中需要依赖协同蛋白或多酶体系维持功能。二级结构分析进一步揭示,GH1与GH3家族蛋白含有较高比例的α-螺旋和β-折叠,结构更为刚性其稳定;而GH132和GH17家族蛋白富含无规则卷曲,柔性更强,有助于适应多样化的底物。
在功能特性方面,信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位预测显示,不同GH家族在分泌潜能和膜结合能力上存在明显差异。其中,多数溶酶体/液泡定位的β-葡萄糖苷酶信号肽保守性较低,可能主要承担底物特化代谢或储存功能;而胞外分泌型β-葡萄糖苷酶(如XP_073554356.1)则具有保守信号肽、典型切割位点及适宜的理化特征,表明木霉属β-葡萄糖苷酶在结构特征、分泌能力与细胞定位上呈现出高度协调的多样性[29-30]。此外,磷酸化位点预测显示,β-葡萄糖苷酶通过丝氨酸/苏氨酸型可逆磷酸化进行精细调控[22],这有助于木霉属真菌在外源碳源波动条件下快速调节分泌与催化能力,从而实现资源利用效率最优。
系统进化分析揭示了木霉属β-葡萄糖苷酶的多样化进化轨迹。GH1与GH3家族的进化相对保守,在适应不同生态环境的过程中起到核心作用[24,31],而GH7家族则表现出高度分化,表明其可能伴随功能重塑[32]。信号肽和跨膜结构域分布特征进一步表明,分泌潜力与膜结合能力是β-葡萄糖苷酶家族功能多样化的重要驱动因素[4]。在物种水平上,T.asperellum的β-葡萄糖苷酶序列不仅数量丰富,且分布于所有进化分支,推测其家族多样性可能源于基因复制及随后的功能分化,并在结构与功能上保持内在联系。
进一步对T.asperellum来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶进行保守基序和结构域分析,结果显示Motif 1、2、6、7高度保守,提示其可能构成酶催化与底物识别核心[16-17]。三级结构建模显示,GH3家族典型的双结构域折叠(N端α/β桶与C端β-夹层)不仅形成催化口袋,还提供碳水化合物结合模块(CBM)的底物识别位点,从而增强对复杂底物的适应性和识别能力[27,33]。
分子对接结果表明,纤维二糖在GFP60323.1蓝色口袋中的结合最为稳定,提示该口袋可能是该酶的主要活性位点,并赋予其对天然底物更高的结合亲和力。β-葡萄糖苷酶作为纤维素降解过程中的限速酶,能够将纤维二糖彻底水解为葡萄糖[4-5]。因此,GFP60323.1在蓝色口袋中对纤维二糖的稳定结合为其在纤维素水解中的关键作用提供了结构依据。由此可见,β-葡萄糖苷酶GFP60323.1在生物能源和生物质转化中可提高木质纤维素糖化效率和葡萄糖转化率、进而促进生物乙醇产量提升,以及在饲料加工中可通过分解植物细胞壁中的纤维素及相关多糖提高粗饲料中营养物质的消化吸收率[6,9]。相比之下,对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷和水杨苷在GFP60323.1橙色口袋中的结合能虽略高于纤维二糖,但仍表现出较强的稳定性,提示该口袋能够识别结构差异较大的芳香族底物。推测β-葡萄糖苷酶GFP60323.1在食品与饮料加工中,可通过解芳香苷(如水杨苷、芥子苷等),释放结合态的芳香化合物,改善葡萄酒、果汁和茶饮的风味品质,同时也可降低某些植物代谢物的苦味与毒性[7-8]。GFP60323.1不仅在维持纤维素降解效率方面可能发挥重要作用,同时具备一定的底物适应性和多样性,为其在生物能源开发、食品加工及饲料产业中的潜在应用提供了理论参考。
通过蛋白质相互作用网络预测显示,GH3家族β-葡萄糖苷酶可能与细胞壁降解酶、糖代谢相关酶及病原相关蛋白协同作用,共同参与植物细胞壁改造、碳源利用及防御响应[34]。其中,与纤维素酶和半纤维素酶等细胞壁降解酶的互作,可能增强植物细胞壁多糖的降解效率,加速葡萄糖等可利用碳源的释放。与糖代谢相关酶的协同,则有助于底物水解产物在糖酵解、戊糖磷酸途径等代谢通路中的高效转化,维持细胞的能量与代谢平衡。而与病原相关蛋白的相互作用,可能在植物抗逆过程中发挥作用,通过调控细胞壁结构与信号分子生成,提升对病原菌侵染的防御能力。由此可见,GH3家族β-葡萄糖苷酶不仅在细胞壁多糖降解与碳源获取中具有关键作用,还可能通过与防御相关蛋白的互作在植物免疫调控中发挥重要作用,为深入理解其多功能性提供了新的方向。
本研究基于生物信息学方法对木霉属来源的β-葡萄糖苷酶进行了系统性的序列、结构与功能解析,并通过多种权威预测平台交叉验证,结果具有较高参考价值,但仍存在一定局限性,亟需实验验证。未来研究中,可结合分子克隆、定点突变和质谱检测等实验手段,对关键预测结果进行验证与优化;同时,在合成生物学领域,通过异源表达与代谢通路重构实现高效β-葡萄糖苷酶的定向优化;在精准酶工程方面,利用分子动力学模拟、机器学习预测及定点突变策略,针对β-葡萄糖苷酶的底物特异性、热稳定性和耐酸碱性开展靶向改造;在可持续生物质利用中,β-葡萄糖苷酶还可与多酶体系或生物反应器耦合应用,为木质纤维素资源的清洁高效转化提供新的解决方案。
综上所述,与以往研究主要集中于个别β-葡萄糖苷酶酶学特性或单一家族成员的研究相比,本研究的独特性在于对木霉属来源的137条β-葡萄糖苷酶序列进行了系统性整合与对比分析,揭示了不同GH家族在理化性质、亚细胞定位、稳定性、保守基序及三级结构上的差异。其中,GH3家族因数量多、结构复杂、功能多样而占据核心地位。而GH132与GH17家族的柔性与不稳定性特征,以及与胞外分泌功能的潜在关联,尚未在已有文献中得到系统阐述。此外,本研究发现木霉属β-葡萄糖苷酶GH3家族不仅数量占优势,还表现出典型的“双结构域+多基序”模式,突显其在纤维素降解中的核心地位。进一步的分子对接分析表明,GH3家族代表性成员GFP60323.1具有“催化-识别”双功能口袋,其蓝色口袋对纤维二糖结合最为稳定,表明其在纤维素水解中的关键作用,而橙色口袋则能识别对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷和水杨苷等芳香族底物,反映出其底物适应性与多样性。以上结果不仅丰富了对木霉属来源的GH3家族β-葡萄糖苷酶结构与功能特征的理解,也为其在生物能源开发、食品加工及饲料产业中的潜在应用提供了新的依据。
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