酱香型白酒是中国四大基本香型白酒之一,具有“酱香突出、优雅细腻、酒体醇厚、回味悠长”的独特风味特征[1],其风味品质的形成与酱香大曲密切相关[2]。酱香大曲是酱香型白酒酿造过程中的核心糖化发酵剂,以优质小麦为原料,经自然接种、高温堆积发酵而成,制曲原料的分解产物和微生物代谢产物,直接或间接地构成了白酒的风味物质[3-4]。吡嗪类化合物作为一类含氮杂环化合物,是酱香大曲及酱香型白酒中关键的风味活性物质之一,具有阈值低、香气贡献大的特点[5],不仅能赋予酒体焦香、坚果香、烘烤香等典型酱香风格的香气,还对酱香型白酒整体风味的协调性与层次感起着至关重要的调控作用[6]。已有研究表明,酱香大曲中吡嗪类化合物的种类、含量及比例,会直接影响后续白酒酿造过程中风味物质的积累效率与最终酒体的风味品质[7]。此外,近年来众多研究发现吡嗪类化合物还具备多种生物活性,赋予酱香型白酒一定的健康属性,如2,3,5,6-四甲基吡嗪具有体外抗氧化和抗炎特性以及体内神经保护特性[8],2,3-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪具有抗氧化功能,2-甲基吡嗪对高血糖具有一定的改善作用[9]。因此,精准检测酱香大曲中吡嗪类化合物的组成与含量,对于优化酱香大曲生产工艺、揭示酱香型白酒风味形成机制、提升酱香型白酒风味品质具有重要的指导意义。

当前液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)、固相萃取(solid phase extraction, SPE)、顶空-固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)等前处理方法广泛应用于食品基质中吡嗪类化合物的检测。其中,LLE方法操作简便,但存在有机溶剂用量大、萃取效率低、易造成环境二次污染等问题[10];SPE与SPME虽能减少有机溶剂消耗,但前者需繁琐的柱活化、淋洗步骤,后者存在纤维涂层易磨损、使用寿命短、成本较高等局限[11-12]。酱香大曲富含蛋白质、多糖、脂肪及多种代谢副产物[13],检测过程中基质干扰严重,影响目标化合物的高效富集与纯化,导致吡嗪类化合物检测灵敏度与准确度不足等问题。液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)作为一种新型绿色样品前处理技术,具有操作简便快速、富集效率高、有机溶剂用量少、环境友好等优势[14-15],可有效解决传统液液萃取的溶剂消耗问题,同时通过优化萃取溶剂种类与用量、萃取时间等参数,实现对酱香大曲中吡嗪类化合物的有效提取。在仪器分析方面,GC-MS、气相色谱-氮磷检测器(gas chromatography-nitrogen phosphorus detector,GC-NPD)、气相色谱-串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)凭借高分离效能与精准检测能力,已被广泛应用于吡嗪类化合物的检测[16-19]。然而,传统GC-MS对于基质复杂样品中低含量吡嗪类化合物的检测,易受基质背景信号干扰,导致定量准确性与检出限难以满足分析需求[17];GC-NPD对含氮化合物具有高选择性,但是检测限较高[18],无法实现大曲中低含量吡嗪的准确定量;GC-MS/MS通过二级质谱的多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM),可有效排除基质干扰,显著提高检测灵敏度与特异性,适用于复杂样品中痕量物质的准确定量[19]。

针对现有检测技术在酱香大曲吡嗪类化合物分析中存在的不足,本研究以酱香大曲为研究对象,通过优化LLME关键工艺参数,结合GC-MS/MS的动态MRM,创建了一种准确测定大曲中吡嗪类化合物的方法,为酱香大曲质量评价、分析发酵过程中吡嗪类化合物的动态变化规律、揭示微生物代谢与吡嗪类化合物形成的关联机制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱香大曲样品由5家不同生产企业提供,每家各3个样品,分别编号为M001～M003、G001～G003、S001～S003、J001～J003、D001～D003;上述15个样品经粉碎混匀后,按质量等比例混合得到综合样(编号为ZH001),所有样品置于-20 ℃冰箱中保存。吡嗪、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、2-异丁基-3-甲基吡嗪、2-仲丁基-3-甲氧基吡嗪、2-异丁基-3-甲氧基吡嗪、2-甲氧基-3-甲基吡嗪(内标)标准品(纯度均大于95%)、N-丙基乙二胺(N-propylethylenediamine,PSA)、石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)(分析纯),上海安谱实验科技股份有限公司;无水乙醇、乙醚、乙酸乙酯、正己烷(均为色谱纯),德国CNW公司;NaCl、MgSO4(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;所用水为本实验室自制超纯水。

1.2 仪器与设备

AB135-S十万分之一电子分析天平,瑞士Mettler-Toledo公司;FA2004万分之一天平,上海精密科学仪器有限公司;Multi Reax涡旋振荡仪,德国海道夫仪器公司;3K15高速离心机,美国Sigma公司;SK8200HP超声波清洗器,上海科导超声仪器有限公司;8890 GC-NPD、8890B-7000D GC-MS/MS、7890B-5977C GC-MS、DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm),美国Agilent科技有限公司;MPS 2多功能样品前处理平台,德国Gerstel公司;固相微萃取纤维头(50/30 μm CAR/DVB/PDMS),美国Supelco公司。Flex 2纯水系统,上海威立雅水处理技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液:分别称取吡嗪标准品0.1 g(精确至0.000 1 g)于100 mL容量瓶中,用无水乙醇溶解并定容至刻度,配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。以正己烷为溶剂配制吡嗪类化合物混合标准溶液,并用正己烷逐级稀释成系列标准溶液(SS-1～SS-10),质量浓度依次为10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L。

内标溶液:准确称取2-甲氧基-3-甲基吡嗪标准品0.01 g(精确至0.000 1 g)于100 mL容量瓶中,用无水乙醇溶解并定容至刻度,配制成质量浓度为100 mg/L的内标溶液。

1.3.2 LLME方法步骤

将大曲样品经超微粉碎后过20目筛,混合均匀,准确称取5.0 g样品于50 mL离心管中,加入20 μL内标溶液,15 mL乙醇水溶液(5%,体积分数),充分混合均匀;加入NaCl使溶液至饱和,5 mL乙醚/正己烷混合液(1∶1,体积比),涡旋振荡5 min,以8 000 r/min离心10 min;吸取上清液至另一离心管中,内含MgSO4、PSA和GCB为120、40、40 mg,混匀后以8 000 r/min离心5 min,取上层清液供GC-MS/MS分析。

1.3.3 GC-MS/MS仪器条件

气相色谱条件:载气为高纯He(纯度≥99.999%),恒流模式,流速为1 mL/min;升温程序为初温40 ℃,保持1 min,以10 ℃/min升至90 ℃,保持2 min,以3.5 ℃/min升至140 ℃,保持1 min,再以15 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;进样口温度为250 ℃,进样量为1 μL,不分流进样。

质谱条件:电子电离(electron ionization,EI)源:能量为70 eV,离子源温度230 ℃;传输线温度280 ℃;溶剂延迟8 min,碰撞气为氮气(纯度≥99.999%);动态多反应监测(dynamic multiple reaction monitoring,dMRM)模式。

1.3.4 LLME前处理条件优化

采用单因素法依次优化以下前处理条件参数:a)一级提取溶剂(超纯水、5%vol、10%vol、15%vol、20%vol、25%vol的乙醇水溶液);b)一级提取溶剂用量(5、10、15、20、25、30 mL);c)二级提取溶剂种类[A:乙酸乙酯、B:乙酸乙酯-乙醚混合液(1∶1,体积比)、C:乙醚、D:乙醚-正己烷混合液(1∶1,体积比)、E:乙酸乙酯-正己烷混合液(1∶1,体积比)、F:正已烷];d)净化剂(PSA、GCB)添加量。

一级提取溶剂乙醇体积分数的选择:准确称取5.0 g混合均匀的酒曲样品,加入混合标准溶液,20 μL内标溶液,15 mL不同体积分数的乙醇水溶液,充分混合均匀后加入NaCl使溶液至饱和,涡旋混合后,超声提取10 min,加入5 mL溶剂D,涡旋振荡5 min,以8 000 r/min离心10 min;吸取上清液至另一离心管中,内含MgSO4、PSA和GCB为120、40、40 mg,涡旋振荡10 min(1 500 r/min),然后以8 000 r/min离心5 min,取上层清液供GC-MS/MS分析。其他3个因素依次进行优化,所有实验均进行3次平行试验。

1.3.5 仪器条件的优化

将前处理后的样液按前述仪器条件经GC-MS/MS分析,在35～350 m/z进行全扫描,对样品中的吡嗪类化合物进行鉴定,得到目标化合物的全扫描质荷比数据,再进一步优化质谱参数、定性离子、定量离子、碰撞能量等。

1.3.6 方法学验证

线性范围、最低检出限(limit of detection, LOD)、最低定量限(limit of quantitation, LOQ)考察:以目标化合物与内标的质量浓度比为横坐标,对应的峰面积比为纵坐标,绘制标准曲线,根据R2值评估标准曲线是否满足定量要求;以目标物定量离子的3倍、10倍信噪比(S/N)测定各组分的LOD、LOQ。

精密度与回收率测试:以综合大曲样品为基质,添加低、中、高3个浓度水平的标准溶液,按上述实验步骤进行处理和测定,连续3 d,每天进行6次重复实验,计算目标物的平均回收率和相对标准偏差(relative standard deviation, RSD),考察方法的准确度与重复性。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 29.0.1.0软件进行单因素方差分析,以确定样本间的最小显著差异。使用SciDAVis软件进行图形绘制。所有实验均重复3次,测量结果以重复试验的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

将综合大曲样品(ZH001)经LLME提取,在全扫描模式下进行单级质谱全扫描,共定性出19种吡嗪类化合物,获得相应保留时间和具有代表性的母离子碎片。然后选择丰度较高,质荷比合适的碎片离子作为母离子,在子离子扫描模式下进行二级质谱扫描,从二级质谱图中选择响应较高的碎片离子作为子离子。通过改变碰撞电压来优化能量,优化的质谱参数见表1。

采用优化后的质谱参数,对19种吡嗪混合标准溶液与5个厂区大曲样品在dMRM模式下进行扫描,由总离子流色谱图(图1,化合物序号同表1)可知,在20 min内19种目标化合物和内标物均实现良好分离且峰形良好,表明色谱条件适宜。

2.2 样品前处理条件优化

为降低基质干扰、提高萃取效率,本实验首先以乙醇水溶液进行一级提取,随后采用有机溶剂进行二次提取,经净化处理后上机检测。依据回收率、RSD、检出限等参数对一级提取溶剂乙醇体积分数及其用量、二级提取溶剂种类、净化剂用量等前处理实验条件进行了优化考察。

2.2.1 一级提取溶剂的优化

本实验首先考察了不同体积分数的乙醇水溶液对19种吡嗪类化合物提取效果的影响(图2-A)。结果显示,采用超纯水提取时19种吡嗪的回收率为89.04%～105.52%,其中2-甲基吡嗪、2-异丙基-3-甲氧基吡嗪的回收率均低于90.0%,RSD为3.52%～8.43%,2-乙基-3,5-二甲基吡嗪等5种吡嗪的RSD均大于5.0%;乙醇体积分数为5%时,19种吡嗪的回收率为90.21%～103.78%,RSD为2.32%～4.58%;随着乙醇体积分数进一步提高,19种吡嗪的回收率逐步降低,乙醇体积分数达10%时,回收率为86.81～98.32%。因此,选定5%vol乙醇水溶液作为大曲样品前处理的一级提取溶剂。

提取溶剂体积是影响目标化合物有效提取的重要因素[20],进一步考察不同体积5%vol乙醇水溶液(5、10、15、20、25、30 mL)对目标化合物提取效果的影响。由图2-B可知,当乙醇水溶液(5%vol)体积为5 mL时,回收率为73.21%～98.62%,仅4种化合物的回收率大于90.0%,表明一级提取溶剂使用量过低,大多数吡嗪无法有效提取;随着提取溶剂用量增加,19种吡嗪的回收率逐步上升,当提取体积达15 mL后趋于稳定,19种吡嗪的回收率均大于90.0%,RSD均小于5.0%。综合考虑实验成本与绿色原则,一级提取溶液的使用量确定为15 mL。

2.2.2 二级提取溶剂的优化

提取溶剂的极性与选择性是影响吡嗪类化合物萃取效率的关键因素[21],不同溶剂对目标化合物的萃取效果如图3所示。结果表明,C、F提取溶剂下19种吡嗪的回收率分别为84.23%～102.31%、83.84%～102.14%,均有7种吡嗪的回收率小于90.0%;D溶剂下回收率为90.21%～103.78%,RSD为1.48%～4.31%,均小于5%,表明乙醚和正己烷混合溶剂的提取效果优于另外3种提取方案,可以有效提高19种吡嗪的提取效果,因此将乙醚/正己烷混合溶剂(1∶1,体积比)确定为二级提取溶剂。

2.2.3 净化剂添加量的优化

PSA是一种以氨基和丙基官能团为特征的固相萃取吸附剂,能有效去除样品中的脂类、有机酸、色素等干扰物质,与活性炭混合使用广泛用于农药残留分析的样品预处理[22]。本实验室前期研究发现大曲样品经有机溶剂萃取后,样液的颜色较深,基线波动较大,对目标化合物的检测存在一定的污染,虽然三重四极杆具有良好的抗基质效应,但是样液中的共萃取物对进样口、色谱柱、离子源等存在较大程度的污染。本实验选择使用MgSO4吸收提取液中残留的水分,PSA和GCB 2种吸附剂作为净化填料,并对其添加量进行优化。

首先考察不同添加量PSA(0、10、20、30、40、50 mg)对目标化合物的影响。图4-A结果显示,添加不同量PSA时,19种吡嗪的回收率为75.34%～121.43%,仅4种吡嗪的回收率为90.0%～110.0%;加入10 mg PSA后回收率优化为82.23%～116.36%;添加量达到40 mg时,回收率为90.21%～103.81%;进一步加到50 mg时,回收率降低为86.33%～101.30%,表明PSA的添加量过大可能会引进目标化合物的损耗,因此选择加入40 mg PSA进行后续实验。其次考察不同添加量GCB(0、10、20、30、40、50 mg)对目标化合物的影响。图4-B结果显示,相较于其他方案,加入40 mg GCB时回收率和RSD均优于另外5种方案,19种吡嗪的回收率为90.0%～105.0%,RSD均小于5.0%,因此选择GCB添加量为40 mg。综合确定净化填料实验方案为40 mg PSA、40 mg GCB和120 mg MgSO4。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系、检出限与定量限

在系列标准工作溶液中加入内标溶液,依次进样分析,以目标化合物与内标物的浓度比为横坐标,对应的峰面积比为纵坐标,绘制标准曲线,对线性关系、LOD和LOQ进行考察(表2)。19种吡嗪在相应的浓度范围内线性关系良好,R2均大于0.998,LOD和LOQ分别为0.18×10-3～2.21×10-3 mg/L、0.60×10-3～7.33×10-3 mg/L,表明该方法具有良好的线性和灵敏度,满足大曲中低含量吡嗪的检测需求。

2.3.2 精密度与准确度分析

通过日内、日间重复性实验和加标实验,考察该方法的精密度和准确度。以综合大曲样品为基质,按照高、中、低3个浓度水平进行加标测定,每个浓度水平共6个平行样。表3结果表明,3个加标水平下19种吡嗪的平均回收率为90.21%～103.78%,日内、日间的RSD分别为1.39%～4.50%、2.46%～4.96%,方法的准确度与精密度均符合GB 5009.295—2023《食品安全国家标准 化学分析方法验证通则》要求,适用于实际样品的分析测定。

2.4 方法对比

2.4.1 LLME与HS-SPME对比

通过加标实验对LLME和HS-SPME方法的准确度与重复性进行对比。其中HS-SPME条件参照文献方法[23]并稍作改进,准确称取2.0 g混合均匀的酒曲样品于20 mL顶空瓶中,加入10 μL内标溶液,6 mL 5%vol乙醇水溶液,然后加入NaCl使溶液至饱和,涡旋混匀并在50 ℃下平衡5 min以达到平衡,将已在250 ℃下预老化30 min的SPME纤维头插入顶空瓶中,萃取45 min,每振动10 s后停止2 s,萃取结束后将纤维头插入进样口,在250 ℃下解吸5 min,进行GC-MS/MS分析。

从表4可知,目标化合物在HS-SPME方法下的回收率为78.56%～91.39%,RSD为4.16%～15.76%,在LLME方法下的回收率为90.21%～103.78%,RSD为1.48%～4.31%,数据表明采用LLME方法对大曲样品进行前处理,19种吡嗪的检测准确度与重复性优于LLME方法。

2.4.2 GC-NPD、GC-MS与GC-MS/MS对比

采用LLME方法对大曲样品进行前处理后,分别运用GC-NPD、GC-MS与GC-MS/MS技术开展样品测定,对比分析3种检测技术在检出限、重复性及准确性方面的差异,其中GC-NPD与GC-MS的检测方法参照相关文献执行[24]。从表5可知,GC-MS/MS的LOD为0.18×10-3～2.21×10-3 mg/L,显著低于GC-NPD(2.77×10-3～19.86×10-3 mg/L)和GC-MS(1.09×10-3～11.45×10-3 mg/L)。表明GC-MS/MS技术具有更高的检测灵敏度,尤其适用于低含量指标的准确定量分析;GC-MS的回收率为81.65%～93.52%,RSD为2.57%～6.57%;GC-NPD的回收率为89.09%～99.73%,RSD为1.38%～4.68%;而GC-MS/MS的回收率达到90.21%～103.78%,RSD为1.48%～4.31%。数据显示,GC-NPD与GC-MS/MS在定量准确度及重复性方面的表现相差较小,且两者均优于GC-MS,但是GC-MS/MS的检测灵敏度远高于GC-NPD。综合结果可知,GC-MS/MS结合动态MRM模式具有强大的抗基质干扰能力,同时具备更高的检测灵敏度与定量准确性,在复杂基质中痕量组分的精准测定方面具有显著优势。

2.5 实际样品检测

采用本实验建立的LLME结合GC-MS/MS方法,对15个大曲样品中的19种吡嗪进行定性与定量分析(表6)。结合表6与图1进行分析可知,不同厂区大曲中吡嗪类化合物的种类存在显著差异,19种吡嗪类化合物在M样品中均有检出,D、J样品中吡嗪类化合物种类分别为18、17种,而G、S厂区大曲检出的吡嗪为12种。2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等12种吡嗪为5个厂区大曲的共有检出成分,同时存在厂区特有成分,即2-异丁基-3-甲基吡嗪仅在M厂区检出,2,3-二乙基-5-甲基吡嗪仅在M、D厂区有微量检出。

产生上述差异的原因可能与高温大曲的品温存在差异,导致制曲过程中微生物种类不同,使得大曲中吡嗪类化合物的种类也存在较大差异。进一步分析表6中19 种吡嗪的定量结果,可知5个厂区大曲的吡嗪类化合物含量分布既存在一定共性,也表现出显著差异,其中12种共有吡嗪的含量对比如图5所示。

5个不同厂区的酱香大曲中含量较高的吡嗪均为2,3,5,6-四甲基吡嗪与2,3,5-三甲基吡嗪,其中2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量差异最为显著,最大差值超过3倍,其中G厂区含量最高,达26 000 μg/kg以上,S厂区含量最低,仅约700 μg/kg,而M与D厂区的含量则较为接近;2,3,5-三甲基吡嗪的分布呈现“分组差异”特征,S、J、D 3个厂区大曲中该物质含量无明显区别,但与M、G厂区相比则存在显著差异。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪对酱酒的风味具有重要影响,经动物模型试验研究表明具有保肝、护肝等功效[25];2,3,5-三甲基吡嗪与酱香型白酒的酱香味具有明显的相关性[26]。此外,2-乙基-6-甲基吡嗪与2-乙基-5-甲基吡嗪均表现出明显的含量差异,2-乙基-6-甲基吡嗪在酱香型白酒大曲中的质量浓度较低,因具有较低的气味阈值,对酱酒的坚果香、烘焙香同样具有重要贡献[27]。

基于5个不同厂家共15个酱香大曲样品中19种吡嗪类化合物的定量结果建立PLS-DA模型。由图6可知,该模型可成功区分不同厂家的大曲样品,且良好的拟合参数(R2Y=0.988, Q2=0.969)表明模型具有较好的准确性,可结合感官评价实现不同厂家、不同质量等级大曲样品的区分与质量评价。

尽管5个厂区遵循相同的大曲生产工艺流程,但受厂区环境条件与具体工艺细节差异的影响,酿造体系内的微生物群落结构及代谢活性产生显著分化,进一步导致大曲中吡嗪类化合物的生成路径与积累量出现明显不同。吡嗪类化合物因具有杏仁味、坚果香与烘焙香,对酱香型白酒焦香风味的形成至关重要[28-29]。值得注意的是,这类化合物不仅在风味贡献上具有重要作用,还表现出多种药理活性。有研究表明吡嗪类化合物具备抑制幽门螺杆菌诱导胃黏膜上皮细胞炎性损伤的能力[30],同时还具有疏风止痛、活血化瘀、改善酒精对肝脏损伤等药理作用[31]。因此,大曲中吡嗪类化合物的含量差异直接导致酱香型白酒的风味与功能特征产生明显不同,这为理解不同厂区酱香型白酒品质差异提供了重要科学依据。

3 结论与讨论

本研究以酱香大曲为研究对象,以2-甲氧基-3-甲基吡嗪为内标,采用LLME结合GC-MS/MS的动态MRM,通过优化前处理实验参数并采用PSA和GCB对大曲样品提取液进行净化处理,建立了酱香大曲中吡嗪类化合物的定性定量方法,包括2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪等共19种吡嗪类化合物。所建方法具有良好的灵敏度、重复性与准确性,加标回收率为90.21%～103.78%,RSD为1.48%～4.31%,适用于复杂固体基质中吡嗪类化合物的测定。

采用该方法对不同厂区的酱香大曲样品进行测定,结果表明不同厂区的酱香大曲中吡嗪类化合物的种类与含量存在显著差异,采用化学计量学方法可以实现不同厂区酱香大曲的有效区分,表明不同厂区虽然遵循相同的的大曲生产工艺流程,但受厂区环境条件与具体工艺细节差异的影响,导致大曲中吡嗪类化合物的种类与含量存在显著差异,进而使得各厂区所产酱香型白酒的风味与功能特征明显不同。本研究对实现不同厂家、不同质量等级大曲样品的区分与质量评价具有重要的指导作用,也为优化酱香大曲生产工艺、揭示酱香型白酒风味形成机制、提升酱香型白酒风味品质提供了数据参考。

参考文献

[1] 何英霞, 谢凯筠, 王高伟, 等. 白酒口感特征的描述性分析及其口感轮的构建[J]. 食品科学, 2025, 46(9): 63-68. HE Y X, XIE K J, WANG G W, et al. Descriptive analysis of taste characteristics of Baijiu and construction of its taste wheel[J]. Food Science, 2025, 46(9): 63-68.

[2] 田浩杰, 李豆南, 邱树毅, 等. 酱香大曲中高温放线菌的筛选及基因组解析[J]. 食品科学, 2023, 44(18): 68-76. TIAN H J, LI D N, QIU S Y, et al. Identification and genome analysis of Laceyella sacchari FBKL4.014 isolated from Moutai-flavor Daqu[J]. Food Science, 2023, 44(18): 68-76.

[3] 柳习月, 朱琪, 杨帆, 等. 多组学解析酱香型大曲风味物质的形成[J]. 食品与发酵工业, 2021, 47(22): 35-41. LIU X Y, ZHU Q, YANG F, et al. Multi-omics reveal the formation of flavor compounds in sauce-flavor Daqu[J]. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(22): 35-41.

[4] 王小平, 黄永光, 周文美. 酱香型白酒大曲细菌菌群结构及功能研究进展[J]. 中国酿造, 2020, 39(2): 19-25. WANG X P, HUANG Y G, ZHOU W M. Research progress on structure and function of bacterial community in Moutai-flavor Baijiu Daqu[J]. China Brewing, 2020, 39(2): 19-25.

[5] 卓俊纳, 吴卫宇, 刘茗铭, 等. 基于GC-QTOF MS结合化学计量学的三种香型白酒鉴别方法研究[J]. 中国酿造, 2022, 41(10): 219-225. ZHUO J N, WU W Y, LIU M M, et al. Identification methods of three kinds of flavor-type Baijiu based on GC-QTOF MS and chemometrics[J]. China Brewing, 2022, 41(10): 219-225.

[6] 孙细珍, 熊亚青, 倪兴婷, 等. 吡嗪类化合物对酱香型白酒香气特征的影响分析[J]. 食品与发酵工业, 2025, 51(1): 305-311. SUN X Z, XIONG Y Q, NI X T, et al. Analysis of the effect of pyrazine compounds on the aroma characteristics of Jiangxiangxing Baijiu[J]. Food and Fermentation Industries, 2025, 51(1): 305-311.

[7] 侯智勇, 刘阳. 酱香型大曲中产酱香芽孢杆菌的代谢产物分析研究[J]. 中国调味品, 2021, 46(6): 65-68. HOU Z Y, LIU Y. Study on metabolites producing Bacillus in Maotai-flavor Daqu[J]. China Condiment, 2021, 46(6): 65-68.

[8] 吴建峰. 白酒中四甲基吡嗪全程代谢机理研究[D]. 无锡: 江南大学, 2013. WU J F. Study on the biosynthesis mechanism of tetramethylpyrazine during the Chinese liquor brewing[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2013.

[9] 龙亚飞, 唐佳代, 王相勇, 等. 中国白酒中健康因子及其富集途径的研究进展[J]. 中国酿造, 2022, 41(2): 23-28. LONG Y F, TANG J D, WANG X Y, et al. Research progress on health factors and their enrichment pathways in Baijiu[J]. China Brewing, 2022, 41(2): 23-28.

[10] 王松, 史冬梅, 刘国英, 等. 液液微萃取分析不同层酒醅原酒的挥发性成分[J]. 精细化工, 2020, 37(5): 1010-1017.WANG S, SHI D M, LIU G Y, et al. Analysis of volatile components of base distillates from different layers of jiupei via liquid-liquid microextraction[J]. Fine Chemicals, 2020, 37(5): 1010-1017.

[11] SUN X Z, QIAN Q Q, XIONG Y Q, et al. Characterization of the key aroma compounds in aged Chinese Xiaoqu Baijiu by means of the sensomics approach[J]. Food Chemistry, 2022, 384: 132452.

[12] 李贺贺, 何菲, 段佳文, 等. 液相微萃取技术在食品分析中的应用[J]. 中国食品学报, 2021, 21(8): 400-408. LI H H, HE F, DUAN J W, et al. Application of liquid phase microextraction technology in food analysis[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2021, 21(8): 400-408.

[13] 王鑫, 王俊麟, 彭东, 等. 不同颜色高温大曲真菌多样性及其与理化品质关联性研究[J]. 食品与发酵工业, 2026,52(2):266-274.WANG X, WANG J L, PENG D, et al. Study on fungal diversity in different colored high-temperature Daqu and its correlation with physicochemical properties[J]. Food and Fermentation Industries, 2026,52(2):266-274.

[14] 荆旭, 蒋海娟, 白冰, 等. 基于密度调节的液液微萃取结合高效液相色谱测定药茶、陈醋、汾酒中的双酚A[J]. 山西农业大学学报(自然科学版), 2021, 41(6): 85-90. JING X, JIANG H J, BAI B, et al. Determination of bisphenol A content in medicinal tea, vinegar, and Fenchiew using density-adjusted liquid-liquid microextraction combined with HPLC[J]. Journal of Shanxi Agricultural University(Natural Science Edition), 2021, 41(6): 85-90.

[15] XIE Q L, XIA M, LU H Q, et al. Deep eutectic solvent-based liquid-liquid microextraction for the HPLC-DAD analysis of bisphenol A in edible oils[J]. Journal of Molecular Liquids, 2020, 306: 112881.

[16] TAVARES A, MAFRA G, CARASEK E, et al. Determination of five 3-alkyl-2-methoxypyrazines employing HS-SPME-GC-NPD: Application in evaluation of off-flavor of South American wines[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2022, 105: 104237.

[17] 潘应拿. 气相色谱-串联质谱技术在农产品质量安全检测中的应用[J]. 现代农业科技, 2025 (17): 133-136;140. PAN Y N. Application of gas chromatography-tandem mass spectrometry in quality and safety testing of agricultural products[J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2025 (17): 133-136;140.

[18] 刘家欢, 孙细珍, 熊亚青, 等. 不同轮次酱香型白酒中吡嗪类化合物含量分析[J]. 食品与发酵科技, 2023, 59(3): 103-110. LIU J H, SUN X Z, XIONG Y Q, et al. Analysis of pyrazines in different rounds Maotai-flavor Baijiu[J]. Food and Fermentation Science &Technology, 2023, 59(3): 103-110.

[19] YANG Y Q, ZHANG M M, HUA J J, et al. Quantitation of pyrazines in roasted green tea by infrared-assisted extraction coupled to headspace solid-phase microextraction in combination with GC-QqQ-MS/MS[J]. Food Research International, 2020, 134: 109167.

[20] 王德瑾, 吴兴强, 陈保, 等. 改进QuEChERS方法结合气相色谱-串联质谱同时快速测定烘焙咖啡中多类农药残留和多环芳烃[J]. 分析测试学报, 2025, 44(10): 2122-2133. WANG D J, WU X Q, CHEN B, et al. A modified QuEChERS method for the simultaneous and rapid determination of pesticides and polycyclic aromatic hydrocarbons in roasted coffee by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis, 2025, 44(10): 2122-2133.

[21] HUANG Y S, SHI T , LUO X, et al. Determination of multi-pesticide residues in green tea with a modified QuEChERS protocol coupled to HPLC-MS/MS[J]. Food Chemistry, 2019, 275: 255-264.

[22] 吴岩, 姜冰, 徐义刚, 等. QuEChERS-液相色谱-串联质谱法同时测定果蔬中16种农药残留[J]. 色谱, 2015, 33(3): 228-234.WU Y, JIANG B, XU Y G, et al. Determination of 16 pesticide residues in fruits and vegetables by QuEChERS-liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(3): 228-234.

[23] WANG Z, WANG S, LIAO P F, et al. HS-SPME combined with GC-MS/O to analyze the flavor of strong aroma Baijiu Daqu[J]. Foods, 2022, 11(1): 116.

[24] 王柏文, 李贺贺, 张锋国, 等. 应用液-液萃取结合GC-MS与GC-NPD技术对国井芝麻香型白酒中含氮化合物的分析[J].食品科学, 2014, 35(10): 126-131. WANG B W, LI H H, ZHANG F G, et al. Analysis of nitrogen-containing compounds of Guojing sesame-flavour liquor by liquid-liquid extraction coupled with GC-MS and GC-NPD[J]. Food Science, 2014, 35(10): 126-131.

[25] ZHANG W Q, SI G R, RAO Z M, et al. Hepatoprotective ability of tetramethylpyrazine produced by Bacillus amyloliquefaciens[J]. Systems Microbiology and Biomanufacturing, 2021, 1(2): 223-233.

[26] 陈晓梅. 三种不同年份茅台酒香气成分研究[D]. 上海: 上海应用技术大学, 2017. CHEN X M. Study of aroma compounds in three Chinese Moutai liquors of different ages[D]. Shanghai: Shanghai Institute of Technology, 2017.

[27] SUN X Z, XIONG Y Q, NI X T, et al. Characterization of the key aroma compounds in Herbal Baijiu via a sensitivity approach[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2025, 139:107085.

[28] 孙魁, 张娟, 滕瑞男, 等. 白酒中焦香成分研究进展[J]. 中国酿造, 2021, 40(5): 32-36. SUN K, ZHANG J, TENG R N, et al. Research progress on burnt aroma composition in Baijiu[J]. China Brewing, 2021, 40(5): 32-36.

[29] LI H H, QIN D ,WU Z Y, et al. Characterization of key aroma compounds in Chinese Guojing sesame-flavor Baijiu by means of molecular sensory science[J]. Food Chemistry, 2019, 284: 100-107.

[30] 常韶娜, 罗强, 刘杰, 等. 吡嗪类化合物抗幽门螺杆菌活性及机制研究[J]. 中国酿造, 2021, 40(2): 188-192. CHANG S N, LUO Q, LIU J, et al. Activity and mechanism of pyrazines against Helicobacter pylori[J]. China Brewing, 2021, 40(2): 188-192.

[31] 向玲, 吴奇霄, 贾俊杰, 等. 不同产地酱香型白酒中吡嗪类化合物差异分析[J]. 食品工业科技, 2025, 46(11): 263-272.XIANG L, WU Q X, JIA J J, et al. Analysis of pyrazine compounds of sauce-flavor Baijiu from different regions[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(11): 263-272.

Determination of 19 pyrazines in Jiangxiang Daqu by liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry

SUN Xizhen1,2, XIONG Yaqing1,2, NI Xingting1,2, LI Qiang1,2*,HU Yongcai3, WANG Li3, YANG Qiang1,2

1(Jing Brand Co.Ltd., Huangshi 435100, China)2(Hubei Key Laboratory of Quality and Safety of Traditional Chinese Medicine &Health Food, Huangshi 435100, China)3(Jing Brand Moutai Liquor Co.Ltd., Zunyi 564500, China)

ABSTRACT The flavour and functional characteristics of Jiangxiang baijiu are directly affected by the pyrazine compounds in Daqu.This study established a method for determining 19 pyrazines in Daqu by liquid-liquid microextraction (LLME) combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) in multiple reaction monitoring (MRM).The developed method exhibited good linearity within a concentration range of 0.05-5.00 mg/L, with determination coefficients (R2) ranging from 0.998 5 to 0.999 9.The limits of detection (LOD) were within the range of 0.18×10-3 to 2.21×10-3 mg/L.The recovery rates at various spiked concentrations varied from 90.21% to 103.78%, and the intra-day and inter-day relative standard deviations (RSD) ranged from 1.39% to 4.96%.This method is more sensitive, repeatable, and accurate than GC-MS and GC-NPD (gas chromatography-nitrogen phosphorus detector), and is suitable for analysing pyrazines in Daqu.A total of 19 pyrazine compounds were identified in the Daqu samples.Based on the quantitative results and principal component analysis (PCA), Daqu samples from different factories could be effectively distinguished.This study provided a foundation for evaluating the quality of Jiangxiang Daqu and optimising its production process when combined with sensory evaluation.

Key words Jiangxiang Daqu; liquid-liquid microextraction; gas chromatography-tandem mass spectrometry; multiple reaction monitoring; pyrazines

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044873

引用格式：孙细珍,熊亚青,倪兴婷,等.液液微萃取结合气相色谱-串联质谱检测大曲中19种吡嗪类化合物[J].食品与发酵工业,2026,52(14):377-387.

SUN Xizhen,XIONG Yaqing,NI Xingting, et al.Determination of 19 pyrazines in Jiangxiang Daqu by liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(14):377-387.

第一作者：本科,正高级工程师(李强高级工程师为通信作者,E-mail:06716@jingpai.com)

基金项目：湖北省自然科学基金项目(2024AFD022)

收稿日期：2025-10-28,改回日期:2025-12-17