冷冻干燥对益生菌关键酶活力的影响与保护策略研究进展

益生菌是一种有益于宿主健康的微生物统称,其益生功能发挥与自身代谢活性密切相关,如一些胞内关键酶[如乳酸脱氢酶(β-galactosidase,β-gal)、β-半乳糖苷酶(latic dehydrogenase,LDH)等]酶活力受损会导致菌株数量及功能活性下降,影响其益生功能的发挥[1-3]。因此,菌株酶活力稳定性常被作为益生菌产品品质评价的关键指标[4]。

在益生菌制剂工业化生产中,冷冻干燥技术凭借低温、真空的温和脱水特性可将菌体水分活度(Aw)降至0.2以下,减少微生物污染与活性成分降解,使菌株进入休眠状态,延长货架期且便于运输,这已成为乳杆菌、双歧杆菌等益生菌规模化制剂(冻干粉、胶囊等)制备的核心技术[5]。工业上制备益生菌菌粉的核心目标是获得高冻干存活率、高单位活菌数以及优良的贮存和应用稳定性。菌体内部关键酶系统的完整性及活性,是保障菌体复苏后代谢活力、环境抗性及功能性的物质基础,因此酶活力的变化常被用作揭示冻干损伤与保护机制的关键指标。但冻干过程中低温胁迫形成的冰晶、脱水胁迫导致的水分移除会对益生菌细胞造成多重损伤,直接降低β-gal、LDH等关键酶活力[6]。如何在冻干过程中维持益生菌酶活稳定性对益生菌制剂的高活性制备具有重要意义。近年来,酸休克、热休克等亚致死处理,复合冻干保护剂及预冻/冻干工艺优化等技术,被证实可通过诱导菌株产生抗逆相关酶(或功能蛋白)、保护关键酶结构,间接提升核心指标。已有很多有关围绕冻干影响酶活力保留的关键因素及靶向保护策略展开了大量研究[7-8]。然而,酶活力保护与核心指标可能存在冲突(如水分含量调控),需遵循“核心指标优先,综合策略兼顾酶活”的原则。通过系统梳理这些研究有助于加深对关键酶活力损伤的靶点与调控路径的了解,从而为益生菌制剂工业化生产提供靶向保护方案,最大程度上发挥菌株的益生功能。因此,本文综述了冷冻干燥对益生菌关键酶活力的影响,系统探讨冻干工艺、保护剂等对酶活力稳定性的调控作用,并总结了提升酶活保留率的技术策略,以期为高活性益生菌冻干制剂的研发与产业化应用提供参考。

1 冷冻干燥对多种酶活性的影响

冷冻干燥被视为一种温和的干燥方法,分为冷冻与干燥2个核心阶段[9],如图1所示。冷冻干燥会影响益生菌酶活力,进而影响菌体活性甚至导致其死亡[10]。从酶的类型差异来看,冷冻干燥对胞内可溶性酶、膜结合酶及特定代谢酶的影响呈现不同特征。对于胞内可溶性酶,CHENG等[11]以植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum L1)和发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum L2)为研究对象发现,冷冻干燥过程中细胞膜的破坏会导致胞内的β-gal和LDH大量泄漏至胞外,使得这2种酶的胞内活力急剧下降,分别降至冻干前的10%～15%与8%～12%。而膜结合酶的活力损失则与膜结构及结合位点的破坏直接相关,冷冻干燥会破坏ATP酶功能所依赖的膜结构与结合位点,导致其活力大幅下降至冻干前的15%～20%。ZHANG等[12]针对两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)的研究同样印证了这一规律,未添加保护剂的两歧双歧杆菌在冻干后存活率仅为(1.45±0.06)%,Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力极低,导致酶无法正常催化ATP分解为ADP和磷酸。在代谢关键酶方面,不同酶对冷冻干燥的响应存在显著差异。BASHOLLI-SALIHU等[13]以长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis UV16PR)的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-glu)为研究核心,发现无任何保护剂时,冻干会直接造成该酶活力损失,冻干后酶活力保留率仅为冻干前的78.9%,间接说明保护剂可能在维持酶活力方面发挥重要作用。为了深入探究酶活力损失的本质。DIANAWATI等[14]系统探究了冷冻干燥(冻干)过程对6种关键酶;β-gal、β-glu、LDH、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、己糖激酶(hexokinase,HK)和ATP酶活力的影响,发现冷冻干燥会显著降低微囊化物双歧杆菌Bb12的多数酶活力(β-glu、β-gal、HK、LDH、ATP酶),仅PK活力不受影响。

益生菌在冻干过程中存活率和稳定性与细胞内酶活力密切相关。目前,关于益生菌冻干保护的研究多聚焦单一技术或指标,缺乏从冻干存活率、单位菌粉活菌数、稳定性与酶活力相关性角度的系统整合。因此,将酶活性力变化作为揭示保护策略作用机制、筛选高效方案的关键指标,为实现益生菌冻干菌粉活性与稳定性的协同提升提供了新的视角和有力工具。表1系统总结了通过调控酶或应激蛋白以改善益生菌冻干性能的代表性研究。酶活力与冻干存活率、贮存稳定性等核心指标存在相关性。

2 不同条件对冷冻干燥过程中益生菌酶活力的影响

2.1 菌株自身特性对酶活力的影响

近年来随着对冷冻干燥机制深入研究,发现菌株自身特性在应对冻干胁迫、维持酶活力中起关键作用[20],不同菌属或同属不同菌株因遗传物质差异造成冻干抵抗适应能力差异显著,系统剖析菌株自身特性对冻干过程中酶活力的影响不仅有助于揭示益生菌抗冻干胁迫的内在机制,还能为优化冻干工艺、开发高效保护策略提供理论依据。

已有多项研究证实了菌株自身特性与冷冻干燥的关联性。LI等[21]研究德氏乳杆菌保加利亚亚种生长后期经35 g/L NaCl预处理2 h对其冻干存活率及糖酵解关键酶活力的影响,NaCl胁迫的提高pyk基因表达量,冷冻干燥前较对照提升1.13倍,冻干后提升1.37倍,使冻干前pfk1、pfk2表达量分别较对照提升1.25倍、1.06倍,对应PK活力冻干前较对照增加。说明NaCl胁迫对不同pfk亚型的调控机制存在差异。在此基础上,CUI等[22]进一步聚焦菌株自身代谢产物积累特性的作用,当培养基中添加21 g/L脯氨酸后长双歧杆菌长亚种CCFM1029对照组冻干后胞外β-gal活力显著高于实验组,表明脯氨酸的加入降低了菌株在冻干过程中的细胞膜损伤,从而提高菌株的冻干存活率,使冻干存活率从(18.61±0.42)%提升至(38.74±1.58)%,揭示了菌株自身积累脯氨酸的特性会影响其冻干时的酶活力与存活率。除以上单一胁迫因子研究外,李宝坤等[23]则通过对比不同菌株的特性差异,测定德氏乳杆菌保加利亚亚种和植物乳植杆菌ST-Ⅲ冻干后的HK、PK及LDH活力,发现冻干对2种菌株的HK、PK活力影响不显著,对LDH活力影响显著,与对照组相比,植物乳植杆菌ST-Ⅲ LDH活力由(6.37±0.56) U/mg蛋白提升至(7.16±0.47) U/mg蛋白,而德氏乳杆菌保加利亚亚种由(5.1±0.63) U/mg蛋白提升至(8.26±0.72) U/mg蛋白,表明不同菌株因自身特性不同,在面对相同冻干胁迫时菌株自身特性会影响其冻干过程中的酶活力。揭示了不同乳酸菌的酶系统对同一冻干胁迫的差异化响应机制,其核心目的是为优化菌株冻干保护策略、提升冻干后菌株的存活率与贮藏稳定性提供理论支撑。KANDIL等[24]则进一步将“菌株自身特性”与“冻干工艺参数(预冻温度)”结合,以植物乳植杆菌AR113、AR307、WCFS1为实验对象,发现菌株自身特性对LDH活力的影响,可通过不同预冻温度下的酶活力差异、细胞膜相关指标及存活率的关联数据得以体现。所有菌株在-20 ℃预冻时的LDH活力均高于-196 ℃,且这种差异因菌株特性不同而呈现显著区别,其中AR307的差异最为突出,这表明AR307对极端低温(-196 ℃)的耐受性更弱,低温诱导的细胞膜损伤更严重,进而导致LDH活力降幅更大。

2.2 单一保护剂对酶活力的影响

冷冻干燥因低温、真空的温和脱水特性成为益生菌菌粉制备的主流工艺[25]。添加保护剂是维持菌株稳定性、提高存活率及保留胞内关键酶活力的重要策略[26-27]。而单一保护剂对这些酶活力的保护效果受保护剂类型、浓度及环境pH值等因素显著影响,相关研究已揭示了不同单一保护剂的作用差异与调控规律。

在单一保护剂对益生菌酶活力的影响研究中,不同类型保护剂的效果存在显著差异。SONG等[28]以植物源燕麦肽为单一保护剂,探究其对德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC22163在-20 ℃和-80 ℃冷冻过程中β-gal与LDH活力的影响。在-20 ℃条件下,40 mg/mL燕麦肽组β-gal活力达4.31 U/mg,较无保护剂组(3.55 U/mg)提升21.4%,与传统脱脂奶粉组(4.45 U/mg)接近,LDH活力为4.21 U/mg,较无保护剂组(1.61 U/mg)大幅提升161.5%,且略高于传统脱脂奶粉组(4.15 U/mg);在-80 ℃条件下,40 mg/mL燕麦肽组β-gal活力为 4.67 U/mg,较无保护剂组(3.76 U/mg)提升24.2%,虽略低于传统脱脂奶粉组(4.75 U/mg)但无显著差异,而LDH活力达4.78 U/mg,较无保护剂组(2.74 U/mg)提升74.4%,且显著高于传统脱脂奶粉组(4.59 U/mg)。燕麦肽组的2种酶活力均显著高于无保护剂组,对应菌株冷冻后存活率也大幅提升。除植物肽外,氨基酸衍生物也展现出显著保护效果。ZHOU等[29]研究表明,L-谷氨酸钠作为单一保护剂可显著减少植物乳植杆菌L5在冻干过程中的酶泄漏现象。β-gal、LDH等关键酶的泄漏量降低,ATP酶活力得以保留。该保护剂维持了产酸相关酶活力的稳定,使冷冻干燥后菌株产酸活力(28.33 °T)与冻干前(29.50 °T)基本一致。与无保护剂的PBS组相比,后者因关键酶大量泄漏,其冻干存活率及贮存稳定性均显著低于添加80 g/L L-谷氨酸钠的实验组。此外,金属离子作为辅助因子类保护成分,其作用呈现浓度依赖性特征。EXTERKATE等[30]以乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)的细胞包膜蛋白酶(cell envelope protease,CEP)为研究对象,探究了阳离子(Ca2+,以CaCl2形式提供)对不同Ca2+结合状态CEP(无钙CEP、载钙CEP)活性的影响。发现在最佳浓度10 mmol/L(25 ℃、pH 6.2)条件下可显著恢复无钙CEP活性,其活性远高于无保护剂组,同时能使载钙CEP活性达到峰值,并呈现出稳定的初始稳态动力学特征,且无滞后现象。当浓度升高至1～2 mol/L(高浓度)时,会削弱CEP的疏水作用,进而导致载钙CEP发生不可逆失活,但该失活程度较弱。在2 mol/L时酶失活率仅为10%,且失活程度低于离液盐。此外,10 mmol/L为最佳浓度,可显著恢复无钙CEP活性、维持载钙CEP活性峰值,进而提升冻干后CEP结构稳定性与菌株存活率。

2.3 冷冻干燥工艺参数对益生菌酶活力的影响

冷冻干燥过程对酶活力存在影响,其物料预处理、冻结降温、真空升华及解析干燥等环节均可能对酶的空间结构与催化活性产生作用[31]。冻结速率、升华温度、真空度等工艺参数的差异会损害微生物细胞膜和DNA,导致包括酶在内的蛋白质变性,还可能引发细胞死亡[32-33]。同时,冷冻干燥会裂解微生物膜,使β-gal、LDH、ATP酶等酶类泄漏至胞外环境中,对其活性产生不利影响[34]。

2.3.1 冻干工艺参数对β-gal活性的影响

β-gal作为糖苷水解酶,是乳制品领域重要功能性活性酶[35],广泛存在于多种益生菌中,其核心功能是催化乳糖水解为半乳糖与葡萄糖,该催化反应的底物、产物及反应路径如图2-A所示。SANG等[36]针对冻干过程中不同温度对长双歧杆菌长亚种BB68S菌株的研究表明,冻干对β-gal的影响主要由升华温度调控,细胞内β-gal活力在-10 ℃的升华温度下显著高于0 ℃和-20 ℃。除了冻干工艺温度影响β-gal活力外,不同冷冻方法和缓冲液类型也会影响其活性。JIANG等[37]以β-gal等为对象探究冻干工艺对其活性的影响,发现不同冷冻方法和缓冲液类型对β-gal活力恢复影响较大,其中磷酸钠缓冲液中样品瓶浸入液氮冷冻时酶活性恢复率最低,表明选择合适冷冻方法与缓冲液至关重要。此外,水分水平也是影响酶活稳定性的一个关键因素。通过对比该酶与LDH在冻干过程中干燥基质塌陷与微观结构保持下的活性损失进程,发现初级干燥阶段酶活性持续下降,且塌陷起始点未伴随活力急剧下降;而在残留水分水平低于约10%时,酶活力恢复率急剧下降,故精准控制残留水分水平对维持酶活力意义重大。但工业上为避免微生物污染、延长货架期,需将菌粉水分控制在4%以下。因此,酶活力是解释冻干效果的重要机制指标,其保护核心是服务于核心指标提升,而非独立存在。若酶活力维持与核心指标要求(如水分含量≤4%)冲突,需优先保障核心指标,再通过技术优化实现两者平衡。

2.3.2 冻干工艺参数对LDH活性的影响

LDH作为关键糖酵解酶,在益生菌代谢中具有重要作用,可催化乳酸与丙酮酸相互转化,对维持细胞能量代谢平衡、调节氧化还原状态具有重要作用[38-39]。益生菌糖酵解阶段,葡萄糖可降解为丙酮酸,经LDH催化,丙酮酸接受NADH的氢还原为乳酸,同时NADH氧化为NAD+,从而保障糖酵解持续进行并供能[40-41]。该催化过程的分子机制与反应路径详见图2-B。

冷冻干燥过程会对益生菌造成胁迫,造成LDH损伤。李宝坤等[23]以德氏乳杆菌保加利亚亚种保加利亚乳杆菌和植物乳植杆菌ST-Ⅲ为对象,通过测定冻干后酶活发现,冷冻干燥会导致LDH失活,降低菌株细胞代谢活力。而在添加海藻糖保护剂后,其LDH活力由(6.37±0.56) U/mg升高至(7.16±0.47) U/mg,显著提高菌株冻干存活率并增强细胞稳定性,且LDH活力与冻干后存活率、结构稳定性呈正相关。明确了保护剂在维持冻干过程中酶活力与细胞代谢能力方面的积极作用,为后续工艺优化提供了 “保护剂调控” 的重要思路。WANG等[42]在此基础上进一步拓展了影响因素范围,将预冻温度与保护剂结合,探究其对植物乳植杆菌(AR113、AR307、WCFS1)冻干存活率的影响,发现预冻温度可通过改变细胞膜完整性、通透性及LDH活力影响菌株活力,所有菌株的LDH活力水平在-20 ℃时都高于-196 ℃时的活力。李艳等[43]则从损伤机制与工艺参数优化的角度,对前2项研究进行了补充与深化,以发酵粘液乳杆菌grx08、干酪乳酪杆菌grx12及鼠李糖乳酪杆菌LV108为研究对象,测定冻干后的代谢关键酶及细胞膜通透性,发现冻干后菌株存活率下降,冻干后胞内LDH的总活力明显降低,发酵粘液乳杆菌grx08由冻干前的4.148 U降至3.185 U,干酪乳酪杆菌grx12由3.852 U降至2.815 U,鼠李糖乳酪杆菌LV108由7.037 U降至4.667 U,表明冻干会损伤细胞代谢功能、破坏细胞膜完整性并导致酶失活,为分析损伤机制及优化冻干工艺参数(如冷冻速率、真空度)以减少代谢酶活力流失提供参考。

2.3.3 冻干工艺参数对ATP酶活力的影响

ATP酶是益生菌生理体系中的关键酶,可高效催化ATP水解断裂高能磷酸键并释放能量,为细胞主动运输、生物合成、及信号传导等耗能活动供能[44]。其作用机制如图2-C所示,通过水解ATP产生ADP和Pi,同时伴随能量释放,驱动H+等离子跨膜运输,维持细胞内外离子平衡与能量代谢稳态。

乳酸菌中质子转运ATP酶(H+-ATP酶)具有重要作用,环境pH降低时质膜上的H+-ATP酶会利用ATP水解能量,逆浓度梯度泵出胞内H+,使菌株能在低pH值环境生长并持续产酸[45]。此外,细胞膜相关的转运系统和应激保护蛋白也发挥重要作用,如双歧杆菌的ATP酶参与维持细胞膜两侧离子平衡通过消耗ATP调控细胞内外K+、Na+、Ca2+等阳离子浓度梯度,对稳定细胞膜结构功能、促进营养运输及维持渗透压平衡至关重要[46]。但冻干冷冻阶段的低温会降低细胞膜流动性、改变膜蛋白构象[47],且冰晶机械损伤还可能破坏膜上ATP酶结构,导致其活力受损、丧失催化ATP水解能力。

冻干过程中的环境pH作为基础工艺辅助参数,直接影响菌株存活与ATP酶活性的保留。CUI等[16]研究了酸对ATP酶、β-gal等及和乳酸菌冻干存活率的影响,发现低pH值会降低菌株预冻和冻干存活率,当pH值高于6.0时,Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力保留率接近100%。而在pH值为5.0和4.0时,Na+/K+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力显著下降。这一结果与菌株在不同pH条件下的存活率变化趋势一致,表明冷冻干燥过程中,酸性环境会对酶造成损伤,进而导致菌株存活率降低。在明确环境pH对酶活力影响的基础上,冷冻保护剂的参数优化成为提升冻干过程中ATP酶活力的关键工艺环节。LIU等[10]以羧甲基纤维素钠(Na-carboxymethyl cellulose,Na-CMC)为保护剂,系统分析其浓度、取代度(degree of substitution,DS)、黏度(viscosity,Vis)及添加比对德氏乳杆菌保加利亚亚种ATP酶活力的调控作用,选择添加比3、10 g/L、DS 0.7、Vis 1 500～3 100 MPa.s的Na-CM条件下,Na+/K+-ATP酶活力达(2.75±0.15) U/mg远高于对照组(0.09±0.05) U/mg,而Ca2+/Mg2+-ATP 酶活力达(2.73±0.41) U/mg远高于对照组(0.04±0.03) U/mg。ATP酶活力的稳定与提升保障了冻干过程中细胞功能的完整性,使菌株冻干存活率达到(23.19±0.88)%,是对照组(0.20±0.08)%的116倍,还显著增强了存贮稳定性,在-20 ℃存贮28 d后,活菌数仍能维持在1010 CFU/mL。除环境和保护剂参数外,冻干过程的核心操作参数(温度、真空度、预冻速率)通过影响菌体细胞膜通透性,间接调控ATP酶活力。GE等[48]系统分析了冻干过程中温度、真空度、预冻速率等参数对细胞膜通透性和ATP酶活力的影响机制。研究发现冻干工艺参数通过影响细胞膜通透性,进而调控ATP酶活力。冷冻保护剂通过维持膜结构,将乳酸乳杆菌ZFM559的ATP酶活力稳定在3.33 U/mg prot,而未添加保护剂组则因膜损伤导致活性显著降至2.52 U/mg prot。为进一步揭示冻干工艺参数调控ATP酶活力的分子本质,SKALIDIS等[49]利用冷冻电镜(cryo-electron microscopy,Cryo-EM)技术,观察了冻干过程中H+-ATP酶的构象动态变化。研究发现低温导致酶分子跨膜螺旋,阻碍ATP结合;脱水则引发二聚体解聚,暴露催化结构域。添加的海藻糖可通过与Asp730等残基形成氢键网络,有效抑制上述不利构象变化,使ATP酶活性保留率提高50%以上。

3 增强冷冻干燥益生菌酶活性的策略

3.1 通过改变菌株特性增强冻干菌株酶活稳定性

通过基因改造、培养基成分调控、培养条件优化等方式改变菌株特性,可有效增强冻干菌株的酶活稳定性,相关研究已取得显著成果。QIAO等[50]从基因层面针对副干酪乳酪杆菌,通过敲除其腺嘌呤甲基转移酶基因(如pglX),成功阻断菌株的DNA腺嘌呤甲基化能力。与野生型相比,甲基化缺陷株在冻干后存活率从30%升至80%以上,且复水后酶活β-gal保留率更高。通过代谢组学检测发现,敲除株中与膜稳定性相关的代谢物含量增加,同时过氧化氢酶活力提升约50%。除基因层面的改造外,调控培养基成分也是定向改变菌株特性、提升冻干后酶活力稳定性的关键策略。TANG等[51]以德氏乳杆菌保加利亚亚种B61-3为研究对象,通过调控培养基氮源定向改变菌株的菌体形态、细胞膜完整性等内在特性,研究发现添加30 g/L牛骨蛋白胨时效果最优,不仅使菌株冻干存活率从对照组的9.68%提升至18.90%,还显著提升了胞内关键代谢酶的活力。冻干后LDH和β-gal对照组仅11.43 U和1.03 U,牛骨蛋白胨组达14.87 U和2.82 U,分别较对照组提高了1.30倍和2.75倍。冻干后Na+/K+-ATP酶对照组活力骤降,而牛骨蛋白胨组仍保持较高水平,较对照组提高了1.52倍。除氮源外,在培养基中补充特定功能性成分,同样能通过优化菌株生理特性发挥保护作用。ZHENG等[52]在植物乳植杆菌LIP-1的培养基中补充0.06 g/L蛋氨酸,使菌株冻干存活率从对照组的28.6%显著提升至62.3%。而蛋氨酸的这一保护作用,主要通过激活菌株体内超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性实现,这2种酶的激活可有效降低菌株胞内活性氧水平与丙二醛含量。在5 mmol/L蛋氨酸处理组条件下超氧化合物歧化酶总活力达23.6 U/mg,较对照组的14.3 U/mg提升了65%。此外,精准调控培养条件也能通过改变菌株细胞膜特性,减少冻干过程中的酶活力损失。VELLY等[53]针对乳酸乳球菌,通过优化发酵温度和收获时期,调控其细胞膜的生化与生物物理特性。发现30 ℃条件下更利于酶活保持,该温度下菌株细胞膜的环丙烷脂肪酸(cyclopropane fatty acid,CFA)积累速率快,CFA与不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)的比值(CFA/UFA)显著升高,同时细胞膜刚性得到了提升,这种高刚性、高CFA比例的膜结构,避免胞内产酸酶泄漏或变性,最终使酶活力损失最小。

3.2 通过保护剂复配增强冻干菌株酶活稳定性

冷冻干燥时低温、脱水及复水环节易破坏益生菌菌体结构,导致胞内LDH等关键酶泄漏或构象改变进而造成酶活力下降。复合保护剂通过不同组分协同作用突破单一保护剂功能局限,既减少细胞膜损伤降低酶的胞外泄漏,又直接保护酶分子结构避免其因脱水、氧化变性,最终实现酶活性稳定保留[54]。

多项研究均证实了复合保护剂在提升益生菌冻干存活率和酶活力方面的显著效果。左梦楠等[55]以30 g/L L-谷氨酸钠、50 g/L麦芽糖和50 g/L脱脂牛奶作为复合保护剂,使发酵粘液乳杆菌BLHN3冻干存活率达1.48×1011 CFU/g。进一步检测发现,该保护剂显著提高了菌体LDH与ATP酶活力,但对PK活性无显著影响。扫描电镜结果揭示,其为酶提供了良好“储存环境”,使菌体维持光滑饱满的完整杆状形态,同时增强细胞膜稳定性,为酶活保留提供结构基础。CHEN等[56]则围绕复合保护剂的配方筛选展开研究,确定了最佳复合保护剂组合,在此配方下鼠李糖乳酪杆菌冻干粉在-20 ℃可稳定贮存60 d,菌株存活率提升至97.8%(远高于对照组的22%)。研究显示复合保护剂主要通过提升细胞膜的防护能力、减少冰晶形成对细胞的损伤发挥作用,最终使菌株Na+/K+-ATP酶活力仅降低4.7%。YUAN等[57]研究则转向复合保护剂配方创新,将脱脂牛奶、海藻糖与菊粉复配成复合保护剂SMTI,以1∶8质量比与植物乳植杆菌W1混合冻干后,菌株成活率达(86.87±0.9)%,冻干1个月后细胞活力仍保持在(2.87±0.44)×109 CFU/g。其作用机制在于提高菌株Na+/K+-ATP酶等活力进而维持细胞膜完整性、减少酶渗漏,最终增强菌株抗逆性,为益生菌冻干保存提供新型保护剂配方及有效方法。

3.3 通过冻干工艺优化增强冻干菌株酶活力稳定性

在益生菌产品开发与应用中冷冻干燥是重要菌体保藏手段,可将益生菌制成便于贮存与运输的冻干制剂[58],传统冻干工艺的参数设定多以经验为依据,既未结合不同菌株的代谢特点与关键酶活性需求进行针对性调整,也未从系统层面分析“工艺参数-保护剂作用-酶活保留”三者的协同关联,因此围绕冻干工艺开展具有针对性的优化并借助多维度策略缓解胁迫损伤、实现酶活力的最大化保留,已成为推动益生菌冻干制剂突破产业化瓶颈的重要路径。

CHEN等[59]则从外部工艺参数探讨了不同菌株对冻结温度的耐受性及其作用机理,结果显示3种乳酸菌在-196 ℃冷冻温度下存活率最高,当冷冻温度低于-80 ℃时这3种乳酸菌细胞膜完整性无显著差异但酶活力变化存在显著差异,且其贮藏稳定性与发酵性能均呈现一致趋势,为优化乳酸菌冷冻干燥工艺提供理论数据。在外部工艺参数优化的基础上,GE等[48]则对保护剂配方进行精准优化,通过响应面法优化乳酸乳球菌Zfm559的冷冻保护剂比例,发现保护剂可维持益生菌细胞膜完整性,并保持细胞膜上Na+/K+-ATP酶的活力,为乳酸乳球菌Zfm559的工业生产和功能性食品开发提供理论基础。NGUYEN[60]则在工艺参数与保护剂优化的基础上,实现了工艺效率与活性保留的协同提升,通过对崩解温度(Tc)的精准控制,提出的分阶段温度-压力调控策略和保护剂配方设计,将冻干周期从传统工艺的42 h缩短至36 h,同时酶活力保留率提高15%～20%。优化工艺后的Erwinia L-天冬酰胺酶在复溶后活性回收率达90%以上,显著高于传统工艺的60%～70%。在2～8 ℃下贮存24个月后,酶活力损失<5%;复溶后在4 ℃下可稳定保存5 d,仍保留95%的初始活性。解决了传统工艺中“效率提升与活性保留难以兼顾”的难题。

4 结语

冷冻干燥作为益生菌制剂工业化生产的核心技术,其低温、脱水等胁迫易导致菌株胞内关键酶(β-gal、LDH、ATP酶等)活力受损进而影响益生菌益生功能,维持冻干过程中酶活稳定性是产业关键需求。现有研究明确冻干工艺、保护剂种类与配方、菌株自身特性及贮藏条件均是酶活力稳定性的核心影响因素,且围绕复合保护剂开发、工艺参数优化等形成有效酶活力保护策略,为减少冻干损伤、提升酶活力保留率提供技术支撑。

未来研究应继续以提升冻干存活率与稳定性为核心目标,酶活力变化作为机制解析与策略优化的重要依据,聚焦于酶分子层面的损伤机制,结合菌株遗传特性深化保护剂作用靶点的解析。同时推动新型保护剂研发与智能化工艺优化的融合,构建高效酶活力保护体系,为高活性益生菌冻干制剂的产业化发展提供坚实的理论与技术支撑。

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