L-色氨酸的化学式为C11H12N2O2,分子质量为204.23 g/mol。它是一种含有手性碳原子的氨基酸,天然存在的形式主要是L-色氨酸(L-tryptophan)。其分子结构包括一个α-氨基(—NH2)、一个α-羧基(—COOH)以及一个独特的侧链-吲哚基团。吲哚环由一个苯环与一个含氮的吡咯环稠合而成,这种结构赋予了L-色氨酸特殊的化学和光学性质。L-色氨酸在水中溶解度较低,仅为11.4 g/L(20 ℃),在25 ℃时略升至12.9 g/L。它易溶于热乙醇、乙酸、稀碱溶液(如氢氧化钠溶液),但在酸性溶液(如盐酸)或中性溶剂(如乙醚、丙酮)中溶解度较差[1]。L-色氨酸的等电点(pI)为5.89,表明其在接近中性pH时呈中性状态。其熔点约为289 ℃,但在加热至此温度时易分解,生成吲哚类化合物,伴有特殊气味。
L-色氨酸被广泛应用于医药、食品、饲料和农业等领域。在医药方面,其作为血清素(5-羟色胺,5-hydroxytryptamine,5-HT)与褪黑激素的前体,参与情绪、睡眠与焦虑的调节;补充L-色氨酸可提高体内血清素水平,从而改善轻-中度抑郁、焦虑与失眠,部分研究显示L-色氨酸可缩短入睡时间并提升睡眠质量[2]。在食品工业中,L-色氨酸常作为营养强化剂添加到功能性食品或膳食补充剂中,提高食品的营养价值以促进健康[3]。在饲料工业中,添加L-色氨酸以调节氨基酸的平衡,能够促进畜禽的生长[4]。当禽类体内L-色氨酸供应不足时,动物体内会出现一系列不适应症状,如脂肪积累速度减缓、机体生长缓慢,公畜甚至会出现睾丸发育不良等现象。而在饲料中添加微量的L-色氨酸就可以促进动物体重增加,作用效果显著[5]。L-色氨酸可参与动物体内脂肪代谢、降低动物肝脏脂肪含量,从而达到提高禽畜肉类瘦肉比例的目的,还可以降低禽畜发生攻击性行为的可能性[6-7]。此外,因其为5-HT与褪黑激素前体,L-色氨酸在化妆品中亦被用作皮肤调理或营养成分,相关研究提示其有助于皮肤健康与抗氧化[8]。在农业领域,外源L-色氨酸可通过调节植物生长分化与养分获取,增强对非生物胁迫的适应性[9-10];同时提升作物对镉的耐受并抑制其由根向芽的上行运输[11]。随着技术的进步和研究的深入,L-色氨酸的潜力将进一步释放,为人类健康和科学进步带来更多可能性。
目前用于生产L-色氨酸的底盘菌株主要是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌及芽孢杆菌。亦有以酵母为宿主的发酵研究[12]。大肠杆菌是一种广泛使用的生产宿主,遗传背景清晰,基因操作方便,可在廉价的培养基中迅速生长,这些特性使其作为一种可产生L-色氨酸和其他芳香族化合物的微生物而备受关注[13-15]。早期,L-色氨酸生产菌株的改良主要依赖于经典的诱变和筛选,以期获得失去竞争途径或获得负反馈抑制的菌株[16-17]。AZUMA等[18]通过重复随机诱变获得的菌株,L-色氨酸的最大产量为54.6 g/L,但仍需要添加L-色氨酸合成的前体物邻氨基苯甲酸;叶慧敏等[19]通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变和高通量筛选选育出一株L-色氨酸高产菌株,产量在摇瓶中达到1.99 g/L,较出发菌株提高了41.77%;DODGE等[16]对大肠杆菌K-12菌株进行了甲烷磺酸乙酯诱变,获得菌株的L-色氨酸产量达到了42 g/L,葡萄糖转化率为18%。然而,随机诱变往往伴随未知多位点突变,影响后续可控优化。相比之下,靶向基因组工程显著缩短育种周期、提升遗传稳定性,尤其是以CRISPR-Cas9为代表的技术发展,进一步巩固了直接发酵在L-色氨酸生产中的主导地位。在理性工程方面,GUO等[20]等通过启动子工程平衡了前体4-磷酸赤藓糖(erythrose-4-phosphate, E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)以及L-丝氨酸的供应,然后通过表达L-色氨酸转运蛋白减弱了反馈抑制和生长毒性,最终菌株(TRP12)在5 L发酵罐中进行分批补料发酵,L-色氨酸产量达52.1 g/L,糖酸转化率17.1%,生产强度达到了1.45 g/(L·h)。XIONG等[21]等通过重新分配中心碳代谢,引入来自青春双歧杆菌的磷酸酮醇酶以及使用非PEP依赖性的葡萄糖转运系统加强PEP和E4P的供应,构建的菌株SX11在5 L生物反应器中补料分批发酵40 h后合成L-色氨酸41.7 g/L,糖酸转化率为22.7%,同时乙酸盐和乳酸积累分别减少了58%和40%。
如图1所示,本研究以大肠杆菌W3110(ΔlacI)为出发菌株,首先对大肠杆菌的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)进行改造,删除了磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸转移酶编码基因ptsI,随后通过适应性进化使缺失磷酸转移酶系统的菌株恢复对葡萄糖的摄取和利用能力。随后对L-色氨酸途径各个基因表达强度进行优化,引入抗反馈调节的AroGfbr、TrpEfbr,打通L-色氨酸合成路径;重构中心代谢,引入外源甘油醛-3-磷酸脱氢酶以强化糖酵解与NADPH供给,并过表达基因tktA、ppsA和talB增强PEP和E4P供应量;同时强化L-色氨酸外排转运能力。最终获得无需诱导剂、无质粒且遗传稳定的高产工程菌株。
图1 大肠杆菌L-色氨酸生物合成途径和代谢工程策略
Fig.1 L-tryptophan biosynthetic pathway and metabolic engineering strategies in Escherichia coli
注:G6P:glucose-6-phosphate,葡萄糖-6-磷酸;F6P:fructose-6-phosphate,果糖-6-磷酸;G3P:glyceraldehyde-3-phosphate,3-磷酸甘油醛;Ser:丝氨酸;PEP:phosphoenolpyruvate,磷酸烯醇式丙酮酸;E4P:erythrose-4-phosphate,4-磷酸赤藓糖;PYR:pyruvate,丙酮酸;Ac-CoA:acetyl-CoA,乙酰辅酶A;OAA:oxaloacetate,草酰乙酸;DAHP:3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸;DHQ:3-dehydroquinate,3-脱氢奎宁酸;DHS:3-dehydroshikimate,3-脱氢莽草酸;SA:shikimic acid,莽草酸;CHA:chorismic acid,分支酸;PPN:prephenate,苯丙酮酸;RU5P:ribulose-5-phosphate,5-磷酸核酮糖;X5P:xylulose-5-phosphate,5-磷酸木酮糖;R5P:ribose-5-phosphate,5-磷酸核糖;S7P:sedoheptulose-7-phosphate,7-磷酸景天庚酮糖;PRA:N-(5′-phosphoribosyl)anthranilate,N-(5′-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸;IGP:indole-3-glycerol phosphate,吲哚-3-甘油磷酸;IND:indole,吲哚;L-Trp:L-色氨酸;L-Phe:L-苯丙氨酸;L-Tyr:L-酪氨酸。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
本研究所用的菌株与质粒见表1。
表1 本研究中用到的菌株与质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株描述来源E.coli Jm109endA1 recA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rk-,mk+) relA1 supE44 D (lac-proAB)[F'traD36 proAB laqIqZΔM15]实验室保存E.coli W3110F-λ- rph-1 INV (rrnD, rrnE) (DE3),ΔlacI实验室保存SW-01E.coli W3110,ΔptsI本研究SW-01MuE.coli W3110,ΔptsI mutant strain本研究SW-02SW-01Mu,trpR::Ptrc-serA本研究SW-03SW-02,ygaY::Ptrc-aroGfbr本研究SW-04SW-03;trpE::Pj23107-trpEfbr本研究SW-05SW-03;trpE::Pj23102-trpEfbr本研究SW-06SW-03;trpE::Pj23111-trpEfbr本研究SW-07SW-03;trpE::Ptrc-trpEfbr本研究SW-08SW-05,yghX::Ptrc-trpBA本研究SW-09SW-05,yncI::Ptrc-trpC本研究SW-10SW-05,yedN::Ptrc-trpEfbrD本研究SW-11SW-10,ΔtnaCAB本研究SW-12SW-11,ΔpoxB;ΔldhA;ΔtdcD本研究SW-13SW-12,ydfE::PgapA-gapCLOAB本研究SW-14SW-13,ykgA::PgapA-gapCLOAB本研究SW-15SW-13,yjbI::Pj23114-ppsA本研究SW-16SW-15,yehH::Ptrc-tktA本研究SW-17SW-16,ilvG::Pj23115-talB本研究SW-18SW-16,ilvG::Pj23110-talB本研究SW-19SW-16,ilvG::Pj23108-talB本研究SW-20SW-17,pflB::Pj23110-yddGPa本研究SW-21SW-20,ycjV::Ptrc-pntAB本研究质粒pEcCas9KanR,Cas9 and λ Red expression vector[22]pEcgRNATetR,gRNA expression vector[22]
1.1.2 培养基
LB培养基(g/L):10氯化钠,10蛋白胨,5酵母粉。121 ℃灭菌20 min。
LB固体培养基(g/L):10氯化钠,10蛋白胨,5酵母粉,20琼脂粉。121 ℃灭菌20 min。
M9培养基(g/L):12.8七水合磷酸氢二钠,3磷酸二氢钾,0.5氯化钠,1氯化铵,2葡萄糖,2 mL 1 mol/L硫酸镁溶液,0.1 mL 1 mol/L氯化钙溶液。
摇瓶发酵培养基(g/L):5酵母粉,3.5硫酸镁,2柠檬酸,3硫酸铵,5磷酸二氢钾,0.03异亮氨酸,0.08硫酸亚铁,0.3蛋氨酸,1 mL微量元素混合液,消泡剂适量,苯酚红适量。121 ℃灭菌20 min。
发酵罐种子培养基(g/L):7酵母粉,3磷酸氢二铵,2氯化钾,3硫酸铵,5柠檬酸,2硫酸镁,0.3异亮氨酸,1 mL微量元素混合液,消泡剂适量。121 ℃灭菌20 min。
发酵罐发酵培养基(g/L):5酵母粉,3.5硫酸镁,2柠檬酸,3硫酸铵,5磷酸二氢钾,0.03异亮氨酸,0.08硫酸亚铁,0.3蛋氨酸,1 mL微量元素混合液,消泡剂适量。121 ℃灭菌20 min。
微量元素液配方(g/L):4.0六水合氯化钴,0.6硫酸铜,6.4七水合硫酸锌,20硫酸钠,4.5硫酸锰,溶于5 mmol/L硫酸中。
1.1.3 主要试剂
2×Phanta Flash Master Mix、2×Rapid Taq Master Mix、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA Marker,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;硫酸卡那霉素、盐酸四环素、L-色氨酸标准品、乙酸标准品,美国Sigma公司。来源丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的gap(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)及酸土副伯克霍尔德氏菌(Paraburkholderia acidisoli)的yddG(芳香族氨基酸 DMT 转运蛋白)基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并做密码子优化以适应在大肠杆菌中表达。
1.2 仪器与设备
C1000基因扩增仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;Agilent 1260 高效液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司;50 L自动控制发酵罐,上海保兴生物设备工程有限公司;V-1200可见分光光度计,翱艺仪器(上海)有限公司;SBA-40C生物传感器,山东省科学院研究所。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株构建
对于菌株工程,按照LI等[22]的描述通过CRISPR-Cas9系统对工程菌进行染色体缺失或整合。本研究以敲除基因poxB为例。使用CRISPR RGEN工具(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计了一对具有20 bp互补序列[见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044858,下同)中列出的sg-poxB-F和sg-poxB-R]的引物,通过反向PCR构建表达sgRNA的质粒(pEcgRNA-poxB)。
为了制备用于目的基因缺失的供体DNA片段,使用2对引物(poxB-1/poxB-2,poxB-3/poxB-4)通过PCR扩增poxB的上游和下游同源臂(每组～500 bp)。通过重叠的PCR连接2个同源臂,产生供体DNA片段(DNA-poxB)。pEcgRNA-poxB 和 DNA-poxB 共同转化成携带质粒pEcCas9的大肠杆菌电转感受态细胞。L-阿拉伯糖诱导λ-Red重组酶的表达。电转化后,将菌体涂布在含有硫酸卡那霉素和盐酸四环素抗性的LB平板上,37 ℃培养过夜。通过菌落PCR验证阳性菌落,然后通过DNA测序确认目的基因是否敲除。通过2个同源臂和目的基因的重叠PCR构建供体DNA片段,将目的基因整合到靶位点中,其他步骤与基因敲除的步骤相同。本研究中使用的所有引物序列见附表1。
1.3.2 摇瓶发酵
首先将菌种接种到LB斜面培养基中进行菌种活化。将活化后的菌种接种到含有3 mL LB液体培养基的无菌摇管中扩培,随后将扩培后的3 mL种子液接种到含有30 mL摇瓶发酵培养基的500 mL挡板瓶中,200 r/min,37 ℃,培养15 h,培养过程中通过补加氨水和葡糖糖控制pH值为6.7～7.2,培养结束后取样检测发酵液中L-色氨酸含量和细胞密度。
1.3.3 发酵罐发酵
取-80 ℃保藏的菌种,在斜面划线,37 ℃培养12 h,传代2次,恢复菌种活力。用无菌接种环取菌种接种到种子培养基中,37 ℃培养7～10 h。
取30 mL培养好的种子接种到经过灭菌的种子罐中,种子罐定容9 L,培养过程中控制温度为37 ℃,pH 7.0。初始条件:通风量0.2 m3/h,搅拌转速200 r/min,罐压0.05 MPa。发酵过程中通过控制罐压、通气量和搅拌转速控制溶氧含量高于30%,当OD600>20时移种,移种量为3 L。
发酵罐定容18 L,发酵过程中控制温度为35 ℃,pH 7.0,初始条件:通风量0.5 m3/h,搅拌转速300 r/min,罐压0.05 MPa,通过调整罐压、通气量和搅拌转速控制溶氧20%～40%,通过流加60%葡萄糖和20%氨水控制残糖(<5 g/L)和pH的稳定。发酵周期为45 h,每隔3 h取样检测OD600与残糖,12 h开始检测L-色氨酸产量。
1.3.4 代谢物检测
生物量(细胞密度)以发酵样品在600 nm波长处的吸光值(OD600)来表征,取适量样品稀释至合适倍数后,使用分光光度计检测OD600。
发酵液中的L-色氨酸含量采用Agilent 1260 HPLC系统的紫外检测器进行测定。具体检测方案参考文献[23]中所描述的方法并进行改进:色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(15 mm×4.6 mm);流动相为V(0.5 g/L磷酸二氢钾溶液)∶V(甲醇)=90∶10;流速为0.8 mL/min;温度为30 ℃,检测波长210 nm。
发酵液中乙酸含量的测定:采用Agilent 1260 HPLC系统RP-HPLC的视差检测器检进行测定。具体的检测方案为:使用Aminex HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm,Bio-Rid, Hercules,CA),以50 mmol/L H2SO4为流动相,在50 ℃,流速为0.5 mL/min条件下进行检测。
发酵液中葡萄糖浓度的测定:使用生物传感器SBA-40C进行葡萄糖浓度检测。
1.4 数据处理
摇瓶发酵数据为3组平行实验的结果“平均值±标准差”。采用Excel 2016、Origin、Graph Pad prism进行实验数据处理与统计分析,利用t检验双尾分布对发酵数据进行组间单向方差分析。P<0.05时表示差异性显著;P<0.01表示差异性非常显著。
2 结果与分析
2.1 PTS系统改造及适应性进化
磷酸烯醇丙酮酸-PTS广泛存在于细菌、真菌和一些古细菌中,PTS由酶Ⅰ(EI)、组氨酸磷酸载体蛋白(HPr或NPr)和酶Ⅱ复合物等磷酸转移酶组成,既具有催化转运功能,又具有非常广泛的调节功能[24]。在大肠杆菌中,PEP在葡萄糖向胞内转运过程中会被大量消耗。
PEP为L-色氨酸合成的重要底物之一,其在胞内的供应量将直接影响L-色氨酸的产量及糖酸转化率。本研究在实验过程中尝试使用非磷酸转移酶系统(如半乳糖通透酶、葡萄糖激酶、葡萄糖促进蛋白)代替磷酸转移酶系统来进行葡萄糖的摄取,但改造后工程菌的葡萄糖摄取能力及细胞密度均显著下降。适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution,ALE)是一种通过长期实验室培养诱导微生物(如大肠杆菌)适应特定环境条件的代谢工程技术,以优化其生长、代谢或产物合成的特性[25]。为了减少PEP的消耗量,同时克服纯理性改造无法恢复工程菌生长的困难,在敲除ptsI后将工程菌接种葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中进行传代培养。在传代50次后,筛选出恢复葡萄糖摄取及利用能力的突变株。测试结果表明,突变株SW-01Mu在30 h发酵培养中的细胞密度与野生型E.coli W3110相当,后续改造以突变株SW-01Mu为基础(图2)。
图2 菌株E.coli W3110、SW-01及SW-01Mu生长曲线
Fig.2 Growth curves of the strains E.coli W3110,SW-01, and SW-01Mu
2.2 L-色氨酸合成底盘菌株的构建
为构建L-色氨酸合成的底盘大肠杆菌,在已经恢复葡萄糖摄取利用能力及生长的菌株SW-01Mu基础上,采用CRISPR-Cas9技术对其进行系统改造。首先,在敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白编码基因trpR的同时,于该位点整合了由Ptrc启动子驱动的磷酸甘油酸脱氢酶基因serA,获得工程菌SW-02。该操作旨在解除转录水平的阻遏,并强化L-丝氨酸的供应。为进一步提升莽草酸途径的通量,将解除了反馈抑制的突变体编码基因aroGfbr[26]整合至基因组的假基因位点ygaY,同样使用Ptrc启动子进行表达,构建得到菌株SW-03。随后,对L-色氨酸操纵子表达进行精细调控,在删除其前导肽弱化子trpL的同时,将编码邻氨基苯甲酸合酶的trpE基因替换为抗反馈抑制的突变体trpEfbr[20]。为精确平衡操纵子的表达强度,分别采用了4种不同强度的启动子,Pj23107(弱)、Pj23102(中等)、Pj23111(中强)及Ptrc(强)[27]驱动其表达,相应构建了菌株SW-04、SW-05、SW-06与SW-07。
摇瓶发酵结果(图3)显示,操纵子表达强度对细胞生长与产物合成具有显著影响。随着启动子强度的增强,工程菌的细胞密度显著降低,反映出代谢负担的加剧;然而,L-色氨酸的产量则呈现逐步上升的趋势。为在菌体生长与产物合成之间取得最优平衡,最终选择表达强度适中的SW-05菌株作为后续研究的底盘。在50 L发酵罐的分批补料发酵中,SW-05表现出良好的性能,其最大细胞密度达100.6,L-色氨酸产量为36.65 g/L,糖酸转化率为17.36%(图4)。
图3 L-色氨酸操纵子过表达对菌体生长和L-色氨酸产量的影响
Fig.3 Effects of L-tryptophan operon overexpression on cell density and L-tryptophan titer
图4 工程菌SW-05 50 L发酵罐分批补料发酵过程
Fig.4 Fed-batch fermentation process of SW-05 in a 50 L fermenter
2.3 色氨酸合成及降解途径优化
为系统评估并优化L-色氨酸合成途径的通量,本研究将色氨酸操纵子中的5个关键基因分为3个功能模块:trpBA、trpC及trpED,并分别将其整合至工程菌SW-05基因组的假基因位点yghX、yncI与yedN处,均采用Ptrc启动子进行表达,相应构建了菌株SW-08、SW-09与SW-10。摇瓶发酵结果表明(图5),与出发菌株SW-05相比,单独强化trpBA(SW-08)或trpC(SW-09)模块的表达均导致L-色氨酸产量与菌体生长密度下降,这可能是由于基因的过度表达引发了显著的代谢负担。与之相反,强化trpED模块的SW-10菌株,其L-色氨酸产量较SW-05显著提高了41.35%,显示出该模块是限制整体合成通量的关键环节。然而,本文尝试将SW-10在50 L发酵罐中放大验证,发酵结果未与摇瓶水平保持一致,其产量未有显著提升,且在发酵约40 h后出现细胞密度急剧下降、发酵液变黑并伴随刺鼻气味、产物质量恶化等现象。推测该异常源于高浓度L-色氨酸在发酵后期被色氨酸酶降解为吲哚,而吲哚对菌体具有毒性,最终导致细胞大量死亡。
图5 色氨酸途径基因过表达对菌体生长和L-色氨酸产量的影响
Fig.5 Effects of tryptophan pathway gene overexpression on cell density and L-tryptophan titer
为验证此推测并解决问题,本文在SW-10中敲除了色氨酸酶操纵子tnaCAB(包括编码前导肽的tnaC、编码转运蛋白的tnaB及编码色氨酸酶的tnaA),以彻底阻断L-色氨酸的降解途径[28-29],获得菌株SW-11。如图6所示,SW-11在50 L发酵罐中表现出发酵稳定性,最大细胞密度达到92.3,L-色氨酸产量提升至42.65 g/L,糖酸转化率为18.3%。与SW-05相比,SW-11的产量与转化率分别提高了16.29% 和5.41%,尽管其最高细胞密度降低了8.28%,但综合性能得到了优化,证明了阻断产物降解路径对实现高效、稳定的工业化发酵至关重要。
图6 工程菌SW-11 50 L发酵罐分批补料发酵过程
Fig.6 Fed-batch fermentation process of SW-11 in a 50 L fermenter
2.4 中心代谢途径重构
为降低副产物积累,进一步提升L-色氨酸的转化率与产量,本研究对菌株SW-11的中心代谢途径进行了系统重构,策略主要包括:敲除关键副产物合成基因;强化糖酵解通量以提升菌体生长与代谢能力;增加前体物PEP与E4P的供给。
首先,为减少乙酸和乳酸的生成,敲除了编码丙酮酸氧化酶的基因poxB、丙酸激酶基因tdcD以及乳酸脱氢酶基因ldhA[30],获得菌株SW-12。
其次,为强化糖酵解过程并改善辅因子供应,将来源于C.acetobutylicum的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gap整合至SW-12的假基因位点ydfE,并使用PgapA启动子驱动表达,以期增强NADPH再生及菌体的生长代谢能力[31],获得菌株SW-13。摇瓶发酵如图7所示,该优化使L-色氨酸产量与最大细胞密度分别提升了24.7%与24.75%。为探究进一步提高gap表达强度的效应,在SW-13的ykgA位点再次进行PgapA-gap整合,构建了菌株SW-14。然而,摇瓶实验显示SW-14的L-色氨酸产量并未获得进一步增长,表明单拷贝gap的表达已趋于最优,故后续改造均以SW-13为出发菌株。
图7 基因gap及ppsA过表达对菌体生长和L-色氨酸产量的影响
Fig.7 Effects of gap and ppsA overexpression on cell density and L-tryptophan titer
为增强前体物PEP与E4P的供应,将磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因ppsA整合于SW-13的yjbI位点,以Pj23114启动子表达,构建SW-15。该改造成功引导更多碳流进入L-色氨酸合成途径,使摇瓶水平的产量在SW-13基础上提高了6.67%(图8)。随后,将转酮醇酶基因tktA整合于SW-15的yehH位点(以Ptrc启动子表达),获得菌株SW-16。摇瓶数据显示,SW-16的L-色氨酸产量较SW-15进一步提高11.58%,且菌体生长未受明显影响。最后,为优化磷酸戊糖途径代谢通量,将转醛醇酶基因talB[32]整合至SW-16的ilvG位点,并尝试了3种不同强度(从弱到强依次为Pj23115、Pj23110、Pj23108)的启动子进行表达,相应获得菌株SW-17、SW-18与SW-19。如图8所示,talB的表达强度对产量与生长存在显著影响:其产量随表达增强呈先升后降趋势,其中以弱启动子Pj23115驱动的SW-17菌株,产量相较于SW-16提升最高,达20.03%,但伴随有18.74%的菌体生长抑制。由于SW-17在产量提升方面表现最佳,将其选定进行放大验证。在50 L发酵罐的分批补料发酵中,SW-17的L-色氨酸产量达到47.59 g/L,糖酸转化率为19.69%(图9)。
图8 提高PEP及E4P供应对菌体生长和L-色氨酸产量的影响
Fig.8 Effects of increasing PEP and E4P supply on cell density and L-tryptophan titer
图9 工程菌SW-17 50 L发酵罐分批补料发酵过程
Fig.9 Fed-batch fermentation process of SW-17 in a 50 L fermenter
综上所述,通过重构中心代谢途径,有效降低了副产物的竞争性积累,增加了关键前体的供应,从而显著提升了菌株的L-色氨酸合成能力。然而,结果也表明,需精细平衡菌体生长与产物合成之间的代谢资源分配,过强的基因表达可能对细胞生长造成负担,反而不利于最终产量的积累。
2.5 L-色氨酸转运强化及辅因子平衡
胞内L-色氨酸的过量积累会通过反馈抑制机制(如作用于TrpE与AroG)及增加代谢负担,进而抑制整体生物合成效率[20]。为减轻胞内产物积累,本研究将来自P.acidisoli的芳香族氨基酸转运蛋白基因yddG[33]整合至工程菌SW-17基因组pflB基因位点,并使用Pj23110启动子驱动其表达,获得菌株SW-20。该改造旨在促进L-色氨酸的外排,削弱反馈抑制,从而维持合成途径的高效运行。
此外,L-色氨酸的生物合成依赖充足辅因子NADPH的供应。为缓解该限制,本研究在SW-20基因组的假基因位点ycjV处整合了编码转氢酶的pntAB基因[34],并利用Ptrc启动子进行表达,以强化NADPH的再生能力,平衡胞内辅因子水平,最终获得工程菌SW-21。
最终构建的工程菌SW-21在50 L发酵罐中的发酵性能如图10所示。经45 h分批补料发酵,SW-21的L-色氨酸产量高达57.2 g/L,糖酸转化率为21.2%,高于SW-17的发酵指标。该结果表明,转运工程及辅因子平衡策略使碳流被更有效地导向了目标产物L-色氨酸的合成,充分证明了本研究采用的系统代谢工程策略的整体有效性。
图10 工程菌SW-21 50 L发酵罐分批补料发酵过程
Fig.10 Fed-batch fermentation process of SW-21 in a 50 L fermenter
3 结论与展望
本研究以大肠杆菌W3110(ΔlacI)为出发菌株,利用系统代谢工程构建了一株生产L-色氨酸的工程菌,具体包括:a)对大肠杆菌的PTS进行改造,通过适应性进化使缺失磷酸转移酶系统的菌株恢复对葡萄糖摄取和利用能力;b)解除L-色氨酸合成的反馈调控,优化L-色氨酸合成途径各基因表达强度,引入抗反馈调节的AroGfbr、TrpEfbr;c)敲除L-色氨酸转运及降解途径基因tnaCAB;d)敲除乙酸及乳酸合成相关的poxB、ldhA等基因,减少副产物合成;e)优化中心代谢,过表达tktA、ppsA和talB增强PEP和E4P供应;f)引入外源甘油醛-3-磷酸脱氢酶,强化糖酵解途径及辅因子NADPH供应,过表达来自P.acidisoli的yddG基因强化L-色氨酸向胞外转运能力。最终获得一株遗传性状稳定、无需诱导剂的无质粒L-色氨酸高产菌株。在50 L发酵罐中进行分批补料发酵验证,在培养45 h后,L-色氨酸产量达到了57.2 g/L,糖酸转化率为21.2%。本研究整合了途径工程、辅因子工程及转运工程等多重策略,成功构建了一株无质粒的L-色氨酸生产工程菌株,为L-色氨酸的工业化高效生物制造奠定了坚实基础。
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