三七叶为云南著名道地药材人参属植物三七(Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen)之叶,收载于广西中药材标准(1990年版),依据云南省食品安全地方标准DBS 53/024—2017《干制三七茎叶》及广西壮族自治区卫生健康委员会公告(2024年第7号)和文献[1]可作为普通食品原料。功能主治“折伤、跌扑出血,敷之即止,青肿经夜即散,余功同根”[2],是我国药典(2025版一部)收载的传统中成药七叶安神片的主要原料,规定HPLC测定其水提总皂苷中Rb3不得低于10%,七叶安神片中Rb3不得低于5 mg/片。现代药理研究表明,三七叶总皂苷具有改善睡眠、神经保护、抗氧化、抗炎、抗抑郁、降脂[3-6]等作用。张华林等[7]对多批次三七叶抗抑郁活性提取物(总皂苷>95%)的HPLC同步检测结果显示Rb3、Rb2、Rb1、Rc含量分别为(16.68±0.51)%、(3.40±0.32)%、(3.62±0.18)%、(9.17±0.28)%,李瑞明等[8]研究结果表明三七叶中Rb3含量[(2.18±0.53)%]远高于茎中的含量[(0.07±0.03)%],表明在云南、广西已作为食品资源的三七茎叶中,三七叶的实用价值远高于三七茎。三七叶中含有多种不同类型的皂苷,其中的原型皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3等因含有较多糖基,分子极性大,分子质量大,不易通过肠壁黏膜吸收,口服利用率低,限制了药效的充分发挥。部分稀有皂苷如Rg3、C-K、F2、Rk1等则比原皂苷有较少的糖基及更好的药理活性和更高的生物利用度[9]。
三七叶经理化或生物因素作用能使皂苷成分发生转化[10-11],可形成生物利用度、生物活性高于原型皂苷和具有潜在特殊生物活性的稀有皂苷[12]。与物理法、化学法相比,生物转化法利用生物酶或微生物转化人参皂苷,是一种绿色、温和、有效的转化方法[13]。与酶转化相比,微生物更便于培养和观察,并且会分泌丰富的酶系[14]。益生菌(probiotics)是能到肠道定植,对宿主有一定健康益处的活菌,主要包括乳杆菌、双歧杆菌及部分链球菌和芽孢菌。其中,枯草芽孢杆菌可产生丰富的酶系,分解多种大分子物质[15];德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种在三七发酵食品中应用广泛,除增强三七的功效外,还能改善其口感和风味[16];动物双歧杆菌乳亚种和植物乳植杆菌,是人体肠道中的有益菌,对维持机体内部环境稳定和增强免疫力有重要作用[17-18]。益生菌发酵时,混合菌种发酵效果更加显著[16,19]。本研究采用HPLC同步测定法系统研究5种益生菌单菌、复合菌及两段式发酵三七叶前后12种人参单体皂苷的变化及稀有人参皂苷的生成量,为三七叶的高值化开发利用、三七叶益生菌发酵皂苷的转化分析和12种人参皂苷的同步定量分析提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三七叶购于云南省文山州,经云南中医药大学邱斌正高级工程师鉴定为五加科人参属植物三七Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen的干燥叶。
对照品人参皂苷Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2(纯度≥98%),上海源叶生物科技有限公司;对照品三七皂苷Fe、Fd、绞股蓝皂苷XⅦ(纯度≥98%),湖北萃园生物科技有限公司;乙醇(分析纯),广东光华科技股份有限公司;甲醇、乙腈(色谱级),上海泰坦科技股份有限公司。MRS肉汤,北京索莱宝科技有限公司;牛肉膏、蛋白胨,北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠,天津市风船化学试剂科技有限公司。枯草芽孢杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、植物乳植杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚种,广东省微生物菌种保藏中心。
1.2 仪器与设备
Aglient 1260高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司;EX125DZH电子天平,奥帝斯仪器(常州)有限公司制造;Bs124 s分析天平,德国Startorius公司;SK7210HP超声波清洗器,上海科导超声仪器有限公司;FD50A立式高压灭菌锅,致微(厦门)仪器有限公司;SW-CJ-1FD洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;TS-180C恒温摇床,上海天呈实验仪器制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 单菌、复合菌及发酵方式对三七叶皂苷的转化
动物双歧杆菌乳亚种(DW)、植物乳植杆菌(ZW)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(DS)、唾液链球菌嗜热亚种(SR)活化与培养:配制好的MRS培养基121 ℃高压灭菌15 min,冷却,取1 mL培养基与菌粉充分混匀制备菌悬液,菌悬液接种到MRS液体培养基,37 ℃厌氧培养48 h,以1.5%(体积分数)接种量将菌种接种于新的MRS培养基中再次培养24 h,重复2次,测定OD600nm值达1～1.5得种子液,备用。
枯草芽孢杆菌(KC)活化与培养:LB培养基(牛肉膏0.15 g,蛋白胨0.25 g,氯化钠0.25 g,加入蒸馏水50 mL),121 ℃高压灭菌15 min,冷却,KC接入培养基中,摇床150 r/min,37 ℃,培养48 h,其余操作同上。
三七叶发酵:称取适量干燥粉碎三七叶,按1∶10料液比(g∶mL)加入蒸馏水,121 ℃灭菌15 min,冷却至室温得三七叶发酵培养基,接种发酵,发酵完成后用HPLC检测各发酵物中皂苷的种类和含量。
单菌发酵:DS、SR、ZW、DW、KC以4%的接种量接入三七叶发酵培养基中发酵2 d,其中除接入KC为好氧发酵外,其余菌种均为厌氧发酵。
复合菌发酵:a)DS+SR(厌氧):DS、SR菌种分别以2%,两菌总接种量4%接入三七叶发酵培养基中厌氧发酵2 d;b)ZW+DW(好氧):ZW、DW菌种分别以2%,两菌总接种量4%接入三七叶发酵培养基中好氧发酵2 d;c)ZW+DW(厌氧):ZW、DW菌种分别以2%,两菌总接种量4%接入三七叶发酵培养基中厌氧发酵2 d。
复合菌+两段式发酵:a)ZW+DW先厌(先厌氧后好氧):ZW、DW菌种分别以2%,两菌总接种量4%接入三七叶发酵培养基中,厌氧发酵1 d后,好氧发酵1 d。b)ZW+DW先氧(先好氧后厌氧):ZW、DW菌种分别以2%,两菌总接种量4%接入三七叶发酵培养基中,接入菌种好氧发酵1 d后,厌氧发酵1 d。c)KC+(DS+SR)(先好氧后厌氧):以4%接种量接入KC好氧发酵1 d,再以DS+SR两菌总接种量4%同时接入DS、SR厌氧发酵1 d。d)(ZW+DW)+KC(先厌氧后好氧):活化的ZW、DW分别以2%,两菌总接种量4%,接入发酵培养基中厌氧发酵1 d后,再接入KC好氧发酵1 d;e)KC+(ZW+DW)(先好氧后厌氧):以4%接种量接入KC好氧发酵1 d后,再以两菌总接种量4%同时接入ZW、DW厌氧发酵1 d。
1.3.2 三七叶及其发酵样品中皂苷种类和含量的测定
对照品溶液的制备:分别精密称取对照品Rg1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Fe、Fd、绞股蓝皂苷XⅦ、F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2对照品10.2、11.2、9.7、10.5、10.5、11.5、10.1、10.8、10.1、10.4、10.4、10.0、10.6、11.6 mg于烧杯中用色谱级甲醇溶解,随后定容至10 mL容量瓶中,摇匀,得混合对照品储备液,备用。
供试品溶液的制备:取适量三七叶粉末及发酵三七叶样品,用50%(体积分数)乙醇按料液比1∶10(g∶mL),80 ℃回流提取3次每次2 h,每次提取结束后3 000 r/min,离心5 min,滤渣继续加50%乙醇提取,合并3次滤液,减压浓缩,60 ℃烘干得各样品提取物。精密称取0.3 g提取物于烧杯中用甲醇溶解后,定容至25 mL容量瓶中,摇匀,过0.22 μm滤膜,滤液为供试品溶液。
色谱条件:Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为乙腈,流动相B为水;梯度洗脱(0～30 min,19% A;30～35 min,19%～24% A;35～40 min,24%A;40～55 min,24%～28% A;55～110 min,28%～29% A;110～130 min,29%～33% A;130～150 min,33%～37% A;150～170 min,37%～41% A;170～190 min,41%～45% A;190～210 min,45%～50% A;210～220 min,50%～55% A),柱温40 ℃;检测波长203 nm;进样量10 μL;流速1.0 mL/min。
1.4 数据处理
所有实验均重复3次,结果采用“平均值±标准差”表示,使用Origin 2025、SPSS进行数据统计、分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
在1.3.2节色谱条件下,采用14种混合对照品溶液与发酵供试品溶液进行HPLC色谱分析,结果见图1,各峰分离度较好,但无论是三七叶原料还是其发酵物都几乎不含三七地下部分含量较为丰富的三醇型皂苷Rg1及人参皂苷Rd。故以下省略了Rg1和Rd的线性关系、精密度、重复性及回收率等分析。
1-人参皂苷Rg1;2-人参皂苷Rb1;3-人参皂苷Rc;4-人参皂苷Rb2;5-人参皂苷Rb3;6-人参皂苷Rd;7-绞股蓝皂苷XⅦ;8-三七皂苷Fe;9-三七皂苷Fd;10-人参皂苷F2;11-人参皂苷Rg3;12-人参皂苷Rk1;13-人参皂苷C-K;14-人参皂苷Rh2。
图1 皂苷标准对照品及三七叶发酵前后HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of ginsenosides from standard reference substances and fermented and non-fermented notoginseng leaves
2.1.1 线性关系考察
取混合对照品溶液稀释得系列不同浓度的对照品标准溶液。按1.3.2节色谱条件进样测定,记录峰面积,以各对照品溶液的质量浓度(mg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果见表1,在一定线性范围内,12种皂苷线性关系良好,相关系数均大于0.999 1。
表1 12种人参类皂苷方法学考察
Table 1 Methodological evaluation of 12 ginsenosides
皂苷标准曲线线性范围/(mg/mL)R2精密度RSD/%回收率/%稳定性RSD/%重复性RSD/%Rb1Y=2 341.0X+0.948 70.035 8～1.120 00.999 80.19100.311.924.98RcY=2 585.5X-12.4210.038 8～0.970 00.999 70.4499.571.771.35Rb2Y=2 688.7X-51.050.021 0～1.050 00.999 60.4498.711.962.23Rb3Y=2 636.8X-117.420.046 0～1.150 00.999 10.7899.330.750.80XⅦY=2 944.5X+16.6090.015 8～1.010 00.999 60.7297.921.251.66FeY=3 231.2X+14.2150.016 9～1.080 00.999 50.5597.660.631.09FdY=3 231.0X-2.083 10.015 8～1.010 00.999 71.4096.710.571.13F2Y=3 700.5X+6.244 90.005 2～1.040 00.999 90.4096.822.003.87Rg3Y=3 512.4X+15.5930.005 2～1.040 00.999 90.4195.491.992.14Rk1Y=7 608.9X-15.4290.005 0～1.000 00.999 90.39105.311.492.46C-KY=4 224.3X+26.2530.002 1～1.060 00.999 90.3798.461.581.96Rh2Y=4 093.5X+12.3940.005 8～1.160 00.999 90.58105.941.641.72
2.1.2 精密度实验
精密吸取混合对照品溶液10 μL,按1.3.2节色谱条件连续进样6次进行HPLC检测,记录峰面积,计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD),结果见表1,RSD(n=6)均小于2%,表明仪器精密度良好,能满足实验要求。
2.1.3 重复性实验
取同一三七叶发酵提取物,按1.3.2节平行制备6份供试品溶液,按上述色谱条件进样进行HPLC检测,记录峰面积,计算RSD值,结果见表1,12种人参皂苷峰面积的RSD(n=6)分别为0.80%～4.98%,表明该方法重复性良好。
2.1.4 稳定性实验
吸取同一供试品溶液10 μL,按1.3.2节色谱条件分别于0、5、10、15、20、25 h进样进行HPLC检测,记录峰面积,计算RSD值,见表1,12种人参皂苷峰面积的RSD(n=6)为0.57%～2.00%,表明该样品溶液在25 h内保持稳定。
2.1.5 加样回收率实验
取6份已知各皂苷含量的三七叶发酵提取物适量,分别加入等量对照品,按1.3.2节方法平行制备供试品溶液,进样测定,计算三七叶发酵样品中12种皂苷成分的平均加样回收率,结果见表1。各测定组分的平均加标回收率为95.49%～105.94%,加样回收率良好。
综上,12种皂苷在测定范围内线性关系良好,该测定方法具有良好的精密度、稳定性、重复性,加样回收率,可用于三七叶生物转化前后皂苷含量的检测分析。
2.2 五种益生菌单菌、复合菌及复合菌两段式发酵三七叶前后12种单体皂苷含量的检测
三七叶发酵前及5种益生菌单菌、复合菌及两段式发酵的三七叶发酵物中12种皂苷含量的测定结果见表2,与未发酵三七叶相比,三七叶经5种益生菌单菌、复合菌及两段式发酵后,Rb1、Rb2、Rb3、Rc含量降低约50%;XⅦ、Fe、Fd和F2含量成倍增加,并新生了稀有皂苷Rg3、Rk1、Rh2、C-K。
接种ZW和DW厌氧发酵1 d,再接入KC好氧发酵1 d时,即(ZW+DW)+KC的三菌两段式发酵,生物转化效率更高,发酵物中稀有皂苷Rg3、Rh2含量的升幅高,5种稀有皂苷F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2含量之和达(4.80±0.10)‰,分别比DW、ZW、KC单菌发酵增加38.81%、20.15%、26.45%,比ZW+DW两菌复合厌氧发酵增加了10.98%,12种皂苷总量为(59.66±2.06)‰,相较于原三七叶的(67.18±0.71)‰,总损率不到12%,去除糖残基的损失,苷元的摩尔损失甚微。
结合表2、表3可知,含量显著降低的均为带4个糖残基的皂苷,其C3位R3基团和C20位R1基团的糖苷糖残基发生不同数量的丢失可生成其他皂苷,其中XⅦ、Fd、Fe的增量可分别由Rb1、Rb2、Rb3的C20位R1基团糖苷链上葡二糖残基分别丢失一个葡萄糖残基而得,是其转化的优先项,且XⅦ、Fd、Fe的C3位R3基团的双糖残基减为一个单糖残基则成为F2,该基团上糖苷链糖残基的进一步丢失则新生稀有皂苷Rh2,该Rh2的C20位R1葡萄糖残基的水解则新生稀有皂苷C-K。新生皂苷Rg3是Rb1、Rb2、Rb3及Rc的C3位R3基团二糖链基完全丢失所得,新生皂苷Rk1则为新生的Rg3进一步脱去一个水分子而成。
表2 三七叶及其不同发酵物中12种单体皂苷的含量变化 单位:‰
Table 2 Monomer ginsenosides before and after fermentation of notoginseng leave with different fermentation methods
发酵菌种及发酵方式Rb1RcRb2Rb3XⅦFeFdF2Rg3Rk1C-KRh2未发酵三七叶5.72±0.07a12.99±0.07a 6.50±0.04a28.05±0.16a1.28±0.08d3.66±0.16b8.76±0.28b0.21±0.01d————单菌发酵DS2.80±0.14b6.86±0.21b2.30±0.13bcd12.54±0.14b2.80±0.03bc8.17±0.17a18.10±0.34a0.44±0.01bc0.71±0.08ab0.58±0.03a1.40±0.03a0.81±0.11cdSR2.53±0.19b6.34±0.28bc2.19±0.14cd11.66±0.47b2.59±0.18c7.92±0.39a17.46±0.80a0.41±0.05c0.63±0.04b0.54±0.02a1.23±0.05abcd0.65±0.03dZW2.79±0.13b6.26±0.05bcd2.10±0.04cd11.54±0.75b3.36±0.03ab9.54±0.23a20.87±0.53a0.56±0.02abc0.65±0.02ab0.54±0.01a1.31±0.02abc0.94±0.02bcdDW2.39±0.10b5.80±0.23bcde1.99±0.09d10.71±0.42b3.04±0.14bc9.04±0.31a19.79±0.66a0.52±0.03abc0.55±0.01b0.49±0.01a1.13±0.04abcd0.77±0.06cdKC3.05±0.27b5.09±0.62bcde3.30±0.31b13.22±1.21b3.79±0.17a9.40±0.75a19.01±0.68a0.62±0.02a0.69±0.02ab0.51±0.04a1.10±0.11abcd0.89±0.10bcd复合菌发酵DS+SR厌氧2.60±0.88b4.56±2.06cde2.70±1.09bcd11.69±4.42b3.77±0.46a9.22±1.93a19.44±3.97a0.65±0.14a0.66±0.27ab0.63±0.35a0.99±0.23cd0.98±0.60abcdZW+DW好氧2.24±0.83b3.91±1.34e2.39±0.74bcd10.51±3.27b3.73±0.31a9.66±1.40a20.40±2.84a0.65±0.14a0.69±0.27ab0.53±0.12a1.10±0.28abcd1.30±0.23abZW+DW厌氧3.05±0.28b4.97±0.67bcde3.02±0.3bc13.01±1.42b3.66±0.30a9.31±0.50a19.60±1.11a0.60±0.04ab0.79±0.10ab0.56±0.04a1.37±0.18ab1.01±0.15abcd复合菌+两段式发酵ZW+DW先厌氧后好氧2.41±0.55b3.95±1.38e2.50±0.72bcd10.56±2.98b3.67±0.33a9.43±1.46a19.73±3.19a0.61±0.12a0.80±0.40ab0.52±0.11a1.07±0.29abcd1.13±0.38abcdZW+DW先好氧后厌氧2.25±0.87b3.92±1.37e2.40±0.78bcd10.42±3.26b3.77±0.45a9.68±1.28a19.88±3.10a0.68±0.11a0.74±0.37ab0.49±0.11a1.01±0.27bcd1.15±0.30abcKC+(DS+SR)先好氧后厌氧2.82±0.37b4.88±0.72cde2.98±0.27bcd12.93±0.90b3.72±0.36a9.42±0.69a20.00±2.68a0.62±0.11a0.65±0.09ab0.50±0.05a1.03±0.08abcd0.86±0.10bcd(ZW+DW)+KC先厌氧后好氧2.70±0.22b4.30±0.06de2.85±0.29bcd11.74±0.60b3.87±0.24a9.83±0.37a19.65±0.90a0.65±0.03a1.01±0.16a0.57±0.02a1.16±0.10abcd1.42±0.15aKC+(ZW+DW)先好氧后厌氧3.08±0.43b4.83±1.89cde3.10±0.65bc12.78±3.49b3.85±0.74a9.69±2.03a19.97±3.81a0.64±0.12a0.62±0.15b0.48±0.10a0.92±0.32d0.89±0.14bcd
注:同一列数据右上标的不同字母表示组间差异显著(P<0.05);“—”表示无数据。
表3 对照品12种皂苷结构异同点
Table 3 Similarities and differences in the structures of 12 ginsenosides reference substances
分子骨架R1R2R3皂苷分子质量/Da—O—glc—glc—H—C(—O—glc—glc,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rb11 109.29—O—glc—glc—H—C(—O—glc—arap,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rb21 079.27—O—glc—glc—H—C(—O—glc—xyl,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rb31 079.27—O—glc—glc—H—C(—O—glc—araf,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rc1 079.24—O—glc—H—C(—O—glc—glc,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2XⅦ947.16—O—glc—H—C(—O—glc—xyl,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Fe917.14—O—glc—H—C(—O—glc—arap,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Fd917.14—O—glc—H—C(—O—glc,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2F2785.01—O—glc—glc—H—C(—CH3,—OH)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rg3784.30—O—glc—glc—H—C(—CH3)CH—CHC(—CH3)2Rk1767.00—OH—H—C(—O—glc,—CH3)—(CH2)2—CHC(—CH3)2CK622.87—O—glc—H—C(—CH3,—OH)—(CH2)2—CHC(—CH3)2Rh2460.70
注:葡萄糖的分子质量180.16、木糖和阿拉伯糖的分子质量150.13,在上述皂苷分子质量中的占比>15%。
2.3 单菌、复合菌及复合菌两段式发酵对三七叶发酵物中12种皂苷之和及5种稀有皂苷之和的影响
由图2可知,与未发酵三七叶相比,单菌、复合菌及复合菌两段式发酵后12种皂苷含量之和均显著减少,这主要是因为在发酵过程中皂苷发生转化生成其他皂苷时糖残基的丢失所致,而非苷元损失。由图3可知,与未发酵三七叶相比,单菌、复合菌、两段式发酵后5种稀有皂苷含量之和均显著升高。DS+SR的混合菌种发酵与DS、SR单菌种发酵相比,其皂苷含量变化不大;ZW+DW菌种混合在4种发酵条件下,5种稀有皂苷含量均有所增加,特别是与DW单菌种发酵相比,5种稀有皂苷含量之和增加较为明显,这可能与两菌之间存在共生关系,共培养更有利于发酵有关[17];KC菌在进行单菌种发酵或先用该菌发酵一段时间再加入其他菌种发酵的两段式发酵时,其5种稀有皂苷含量都偏低,但当先后顺序颠倒以菌种(ZW+DW)+KC组合进行两段式发酵时,则稀有皂苷含量最高,这可能是因为枯草芽孢杆菌先发酵不利于后加入乳酸菌的生长代谢,从而不利于常量皂苷转化为稀有皂苷。本研究确定的(ZW+DW)+KC三菌组合两段式组合发酵,能有效地通过生物转化生成稀有皂苷,可为原型皂苷生物转化为稀有皂苷的发酵方式及菌种选择提供参考。
图2 单菌、复合菌及复合菌两段式发酵前后三七叶发酵物中12种皂苷含量之和
Fig.2 Sum of 12 ginsenosides in notoginseng leaves and ferments with single bacteria, composite bacteria and composite bacterial two-stage of five biotics
注:不同字母表示组间差异显著(P<0.05)(下同)。
图3 单菌、复合菌及复合菌两段式发酵前后三七叶中5种稀有皂苷含量之和
Fig.3 Sum of 5 rare ginsenosides in notoginseng leaves and ferments of single bacterial, composite bacterial and two-stage fermentation of composite bacteria
2.4 相关性分析
相关性分析主要是对多个相关指标进行分析,从而衡量不同组分间的联系。本研究通过对不同发酵三七叶中12种皂苷含量之间变化关联性进行分析,结果表明这些皂苷含量的变化之间存在极显著或显著的相关(图4)。其中带4个糖残基的4种皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc的含量变化与其他皂苷的含量变化呈显著的负相关关系,表明这4种皂苷的成倍下降伴随着其他皂苷的成倍增加;而含1～3个糖残基的皂苷之间呈显著的正相关关系则表明其成倍增量方向的一致性,即糖残基依次减少使其相关皂苷依次增量。其中Rb1、Rb2、Rb3减1个糖残基分别使XⅦ、Fd、Fe增量,包括Rc在内减2个糖残基使F2增量并新生皂苷Rg3、Rk1,减3糖残基则新生皂苷C-K和Rh2。
图4 益生菌发酵致三七叶中12种皂苷含量变化的Pearson相关性分析
Fig.4 Pearson correlation analysis of the effect of probiotic fermentation on 12 ginsenosides in notoginseng leaves
注:*, P<0.05;**, P<0.01。
3 结论与讨论
皂苷是人参属药材质控的主要成分,其含量多采用HPLC测定,赵振霞等[20]用HPLC进行三七叶的质量标准研究。三七叶发酵物中成分复杂,分离难度大,现有研究中HPLC检测三七叶中皂苷的类型以原有皂苷为主,而三七叶经发酵、酶解等生物转化后,其皂苷种类会增多,各皂苷含量会发生变化,但目前对生物转化前后皂苷种类同步检测的方法开发甚少。本文建立了HPLC同时测定三七叶发酵物中12种皂苷,采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),乙腈-水为流动相梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温40 ℃,检测波长203 nm,进样量10 μL。精密度、重复性、稳定性和样品加样回收率的测定结果表明该方法稳定可靠,简单易行,快速准确。运用该方法分析表明未发酵三七叶Rb3、Rb2、Rb1含量分别为(28.05±0.16)‰、(6.50±0.04)‰、(5.72±0.07)‰,高于赵振霞等[20][Rb3(1.88±0.91)%、Rb2(0.41±0.17)%、Rb1(0.42±0.08)%]的测定结果;且Rb3是三七叶的主要成分,符合我国药典规定;Rd含量极少,未检出人参皂苷Rg1,与文献相符[21]。该方法不仅有效分离和检测出了三七叶原有皂苷,同时还检测出发酵后增多及新生成的稀有人参皂苷F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2。
三七叶经5种益生菌发酵后,带4个糖残基的原生皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3含量成倍降低,带3个糖原生皂苷XⅦ、Fe、Fd和2个糖残基的稀有皂苷F2含量成倍增加,并新生了稀有皂苷Rg3和Rk1(含2个糖残基)及Rh2和C-K(含1个糖残基),这是由于人参皂Rb3、Rb1和Rc经过微生物代谢产生的糖苷酶水解,转化为三七皂苷Fd、绞股蓝皂苷XⅦ和三七皂苷Fe,而F2、Rg3、Rk1、C-K、Rh2这5种稀有皂苷的生成途径可能为a)人参皂苷Rb1→绞股蓝皂苷XⅦ(或Rd)→F2→C-K;b)人参皂苷Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3→Rh2/Rk1[22-23]。(ZW+DW)+KC的三菌复合两段式发酵物中稀有皂苷Rg3、Rh2含量的升幅较高,5种稀有皂苷含量之和达(4.80±0.10)‰,分别比DW、ZW、KC单菌发酵增加38.81%、20.15%、26.45%;与ZW+DW两菌复合厌氧发酵相比,增加了10.98%,表明三菌两段式发酵时菌种之间产生了协同作用,且产生了比单菌发酵及两菌复合发酵更多的糖苷酶,使得转化效率提高。相较于未发酵三七叶,三七叶发酵后12种皂苷总量减少主要涉及带4个糖残基的原生皂苷中糖残基的减少,而非苷元损失。5种稀有皂苷总量增加以(ZW+DW)+KC三菌复合两段式发酵的最高。近年,三七叶的发酵方式主要集中在单菌种发酵[11-12,24]或简单的两段式发酵[25],对化学成分的关注点集中在总皂苷、总黄酮等方面,该文系统考察了单菌、复合菌、复合菌两段式发酵前后12种单体皂苷含量的动态变化情况及12种皂苷含量之和、5种稀有皂苷含量之和变化,为三七叶发酵前后单体皂苷种类及变化研究提供参考。
三七叶益生菌发酵后皂苷组成的重大变化为生物转化制备稀有皂苷提供科学依据和技术支撑,且F2、C-K等的转化优于近期报道的微波转化[23]及仿真消化[26]。发酵三七叶与未发酵三七叶的功能差异有待进一步研究。随着国内对三七地上部分在食品和餐饮行业应用限制的放开,市场上对于功效更强的三七叶产品的需求也更加迫切,利用益生菌对三七叶进行发酵和生物转化制备功能活性及生物利用度更高提取物或产品具有广阔的应用前景。本研究为三七叶的高值化开发利用和稀有皂苷相关产品的开发、三七叶生物转化皂苷的分析和12种人参皂苷的同步定量分析提供依据,同时也为可用于参属植物药材质控分析提供参考。
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