胶原蛋白是动物体内分布最广泛的蛋白质,约占人体蛋白质总量的1/3[1]。研究表明,目前已鉴定出的胶原蛋白亚型达28种,其中Ⅲ型和Ⅰ型尤为关键,这2种胶原蛋白协同形成人体结缔组织的基本结构框架[2]。近年来,得益于生物工程技术的突破,重组Ⅲ型胶原蛋白在技术研究和产品开发取得了较大突破。技术方面致力于解决重组Ⅲ型胶原蛋白的稳定性、免疫原性和生物活性3大核心难题。MA等[3]基于链间盐桥工程合理设计了5种Ⅲ型胶原变体(ColP1～ColP5),以提高结构稳定性和生物活性,其中ColP2表现出优异的表达和功能。同时对4种微生物P4H的系统评估确定巨大芽孢杆菌P4H(BmP4H)是脯氨酸羟基化最有效的催化剂,能够形成稳定的三螺旋。经优化及5 L规模发酵,获得了2.54 g/L的高rhCol产量,并确认了三螺旋结构。徐兰举等[4]通过基因工程技术与大肠杆菌高密度发酵技术获得重组表达的RHC Ⅲ蛋白,与动物提取胶原相比,RHC Ⅲ蛋白有很好的水溶性,细胞活力实验结果表明RHC Ⅲ蛋白生物相容性好,显著促进细胞增殖。LI等[5]采用重组人源Ⅲ型胶原蛋白(rhCol Ⅲ)水凝胶人体临床试验中观察显示,局部涂抹12周后,受试者皱纹深度减少38.2%,皮肤弹性提升25.7%。产品方面,锦波生物自主研发的3款重组Ⅲ型人源化胶原蛋白创新三类医疗器械(重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维、注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液、注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白凝胶)的接连获批,为医疗器械产业的发展提供了更多选择。国内已经完成了从“实验室技术”到“规模化产业”的跨越,形成了技术、标准、产品、市场的闭环生态。
目前,重组胶原蛋白行业普遍存在发酵浓度低,纯化过程工序复杂,所需的设备和耗材价格偏高的问题,进而导致生产胶原蛋白成本较高,限制工业化生产及化妆品原料的广泛使用。本文精选人Ⅲ型胶原蛋白的部分基因片段,构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28a,诱导表达成功重组Ⅲ型胶原蛋白COL13(简称COL13蛋白),分子质量为16 kDa,采用5 L发酵罐进行基因工程菌的高密度发酵,并建立一条工艺简单且成本相对低的纯化路线,菌体依次经均质破碎,盐析,离子层析,脱盐,冻干,得到纯度大于95%的COL13蛋白,为重组胶原蛋白规模化生产鉴定了基础。采用圆二色谱COL13蛋白证明具有三螺旋结构,并通过稳定性测试证明了制备的COL13蛋白在高温条件下加热1 h都比较稳定,且具有促进细胞增殖和抗氧化的功能。
1 材料与方法
1.1 原料及试剂
宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)、载体pET-28a,北京百奥莱博科技有限公司;限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ,天根生化科技(北京)有限公司;蛋白胨(FP318)、酵母浸粉(FM888),安琪酵母股份有限公司;葡萄糖,青援生物科技有限公司;硫酸卡那霉素,阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁,国药集团化学试剂有限公司;蛋白质分子标准(Marker)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、市售胶原蛋白,北京索莱宝科技有限公司;阳离子填料SP Sepharose Fast Flow,百林科医药科技(上海)有限公司;表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
种子培养基:卡那抗性LB固体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化钠10,硫酸卡那霉素0.5,琼脂粉15。卡那抗性LB液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化钠10,硫酸卡那霉素0.5。
发酵培养基(g/L):葡萄糖38,酵母浸粉45,磷酸二氢钠5.2,磷酸氢二钾7.5,硫酸铵2.5,硫酸镁3.0,消泡剂1。
补料培养基(g/L):葡萄糖700,酵母浸粉350,磷酸二氢钠11.8,磷酸氢二钾28,硫酸铵18.3,硫酸镁15.8。
1.2 仪器与设备
EU210发酵罐,安徽霍尔斯生物科技有限公司;ZWYR-D2401摇床,上海旻泉仪器有限公司;UV-5200紫外分光光度计,上海元析仪器有限公司;CHT210R高速冷冻离心机,湖南湘仪实验仪器开发有限公司;AKTA PURE150蛋白纯化系统,思拓凡生物科技有限公司;AH-BASIC 30均质机,上海多宁生物科技股份有限公司;BONA-GM-20有机膜小型实验机,山东博纳生物科技集团有限公司;JY92-IIN超声细胞粉碎机,宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 重组表达菌株E.coli BL21/pET-28a-COL13的构建
重组Ⅲ型人源化胶原蛋白基因序列(节选自COL3A1 collagen type alpha 1 chain[Homo sapiens (human)],序列号:1281),经过密码子优化处理的氨基酸序列(适配大肠杆菌表达系统)委托生工生物(上海)进行全基因合成,将基因克隆至表达载体pET-28a的Hind Ⅲ和EcoRⅠ的酶切位点中,构建得到重组质粒pET-28a-COL13F。将提取的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,经过DNA测序验证后,采用Megalign生物信息学工具进行序列比对分析,将确认正确的重组表达载体通过热激法转入BL21(DE3)pLys化学感受态细胞,得到E.coli BL21/pET-28a-COL13F表达菌株。
1.3.2 COL13蛋白原核表达
菌株活化实验操作如下:于超净工作台中,将保藏于甘油管的工程菌株接种至含卡那霉素的LB琼脂平板,采用划线分离法于37 ℃恒温培养箱中培养12～14 h,待形成单克隆菌落后备用;使用灭菌的小枪头挑取单菌落于5 mL卡那抗性LB培养基中,在转速为220 r/min,37 ℃条件下振荡培养12～14 h。
菌株扩增培养步骤如下:将活化后的菌种以1%(体积分数)接种量接种至50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,置于250 mL锥形瓶中进行振荡培养,当培养温度维持在37 ℃且OD600值达到0.6时,在超净工作台内加入IPTG至0.6 mmol/L终浓度进行诱导表达,220 r/min条件下继续振荡诱导培养,另外一个三角瓶作为阴性对照,不加IPTG培养相同时间。
过程取样及检测方法如下:诱导过程每间隔4～8 h分别取5 mL菌液转移至10 mL离心管中,12 000 r/min离心1 min,收集菌体沉淀后,使用移液器准确量取5 mL 纯化水重悬沉淀,再准确称取50 mg溶菌酶加入离心管中,在漩涡振荡器上重悬菌体,采用超声破碎法,具体参数设置为:冰浴条件下,工作功率设定为设备最大输出的50%,脉冲模式(工作5 s,间歇5 s),循环处理10 min,12 000 r/min离心1 min收集上清液,再加入等体积的2×loading buffer振荡混匀,-20 ℃保存以备SDS-PAGE电泳分析检测。
1.3.3 COL13蛋白表达条件优化
1.3.3.1 诱导温度优化
采用1.3.2节所述培养方法制备种子液后,以1%(体积分数)的接种比例将菌液转移至5 L发酵系统,该系统预先装有3 L灭菌发酵培养基,诱导降温时由37 ℃分别降温至30、28、25、21 ℃,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,诱导表达蛋白16～20 h,过程中分别取样用于检测OD600值和COL13蛋白的表达量。
1.3.3.2 诱导OD600值优化
采用1.3.2节所述培养方法制备种子液后,以1%(体积分数)的接种比例将菌液转移至5 L发酵系统,该系统预先装有3 L灭菌发酵培养基,待OD600值分别达到60、80、100时开启降温,由37 ℃降温至25 ℃,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,诱导表达蛋白16 h,过程中每间隔2～4 h分别取样用于检测OD600值和COL13蛋白的表达量。
1.3.4 重组表达菌株5 L罐分批补料发酵
按照1.3.2节的方法进行菌种培养,按照1∶100(体积比)的接种量转接到含有3 L发酵培养基的5 L发酵罐中,设置初始发酵参数:转速300 r/min,通气量3 L/min,罐压0.05 MPa开启发酵;发酵过程通过流加氨水控制pH值为7.0～7.2,调节转速300～950 r/min,通气量3～6 L/min,罐压0.05～0.07 MPa控制溶解氧(dissolved oxygen,DO)维持在20%～40%。发酵过程若出现DO值骤升,说明发酵基础培养基中碳源物质耗尽,需连续流加补料培养基维持菌体正常生长及代谢,流加速率控制在发酵液中残留葡萄糖质量浓度≤4 g/L为宜。待发酵液中OD600值达到80时开始诱导,调节温度降低至25 ℃,添加IPTG至终浓度为0.6 mmol/L,诱导过程每4 h及下罐时分别取样SDS-PAGE检测蛋白发酵浓度,下罐后发酵液9 000×g离心10 min收集菌泥。
1.3.5 COL13蛋白制备
均质破碎:首先将菌泥用20 mmol/L Tris缓冲液(pH 7.0)溶解均匀,细胞裂解采用高压均质法处理,操作参数设定为1 000 bar压力条件下循环处理3～4次,随后在4 ℃条件下以9 000×g离心力进行10 min离心分离,收集含有目标蛋白的上清液组分。
盐析:离心上清溶液中加入5 mol/L盐酸调节pH值至2.8,加入30%(质量分数)的饱和氯化钠溶液,将混合溶液充分振荡均匀后,室温静置30 min使其充分反应,随后在4 ℃条件下以9 000×g相对离心力离心10 min,小心收集上清液组分,加入2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为7.0,过0.45 μm滤膜除去固体杂质。
层析:蛋白纯化采用阳离子交换层析技术,具体操作如下:将上述处理后的样品溶液以20 mL/min流速上样至预先平衡的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱,20 mmol/L Tris缓冲液洗杂后使用0.8 mol/L氯化钠,20 mmol/L Tris缓冲液(pH 7.0)洗脱收集目的蛋白。
脱盐:使用1 kDa中空纤维膜将上述收集溶液脱盐至电导率低于<1 mS/cm,冻干即得到COL13蛋白冻干纤维。
1.3.6 COL13蛋白不同温度加热稳定性测试
将COL13蛋白冻干纤维使用0.9%(质量分数)氯化钠溶解成1 mg/mL的溶液,分别于60、80、100 ℃条件下加热1 h,并分别取样进行SDS-PAGE检测。
1.3.7 圆二色谱扫描
设置圆二色谱仪参数,测试波长180～260 nm,速度200 nm/min,带宽3 nm。将空白样品(超纯水)放入比色管中进行基线测量,以便空白扣除;使用超纯水将COL13蛋白冻干纤维配制为0.5 mg/mL的溶液,放入比色管中,进行样品测量。
1.3.8 COL13蛋白促进细胞增殖实验
先采用CCK-8方法进行EGF和COL13蛋白细胞毒性实验,再根据结果选择合适浓度进行细胞增殖实验,2次实验步骤相同,样品添加浓度不同。
细胞准备与接种:将生长状态良好的NIH3T3细胞(对数增殖期)用胰酶消化处理,制备成单个细胞悬浮体系,以200×g离心3 min,调整浓度至1×105个/mL后,按每孔100 μL接种于96孔板,培养24 h,空白组仅加入培养基。
细胞毒性实验:弃去原培养液,分别加入100 μL不同浓度的COL13蛋白样品(终质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L),对照组和空白组不做处理,阳性对照组用EGF(12.5 mg/L)处理,每组做3个平行,培养24 h后,取出96孔板先做细胞形态学观察,弃去原培养液,每孔加入10 μL CCK-8溶液,轻轻摇晃培养板混匀,避免产生气泡。
细胞增殖实验:弃去原培养液,分别加入100 μL不同浓度的COL13蛋白样品(终质量浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 g/L),对照组和空白组不做处理,阳性对照组用EGF(12.5 mg/L)处理,每组做3个平行,培养24 h后,取出96孔板先做细胞形态学观察,弃去原培养液,每孔加入10 μL CCK-8溶液,轻轻摇晃培养板混匀,避免产生气泡。
孵育反应:放回培养箱继续孵育2 h。WST-8被活细胞线粒体脱氢酶还原为橙色甲瓒,颜色越深表明活细胞越多。
检测:在酶标仪上以450 nm为吸收波长测定吸光度值。
按照公式(1)进行计算细胞活力:
(1)
式中:E,细胞活力,%;As,样品组吸光值(含有CCK-8、细胞、培养基和COL13蛋白孔的吸光值);Ab,空白组吸光值(含有CCK-8和培养基孔的吸光值);Ac,对照组吸光值(含有CCK-8、细胞和培养基孔的吸光值)。
1.3.9 COL13蛋白抗氧化实验
将DPPH用乙醇溶解,配制终浓度为0.1 mmol/L;样品组:COL13蛋白配制不同浓度,与DPPH溶液1∶1(体积比)混合,至终质量浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6 g/L;对照组:取相同体积的纯化水与与DPPH溶液1∶1(体积比)混合均匀;阳性对照组:市售胶原蛋白配制质量浓度为2.0 g/L,与DPPH溶液1∶1(体积比)混合,至终质量浓度均为1.0 g/L;空白组:相同体积的样品溶液。将上述溶液室温避光静置30 min,在517 nm处测吸光度。按照公式(2)计算清除率:
(2)
式中:C,清除率,%;As,样品组吸光值(样品+DPPH溶液的吸光度);Ab,空白组吸光值(样品本身的吸光度);Ac,对照组吸光值[DPPH溶液(不含样品)的吸光度]。
1.4 数据分析
使用GraphPadPrism 10进行图表的制作,并进行数据分析。特定的图像分析使用BioAnaly软件完成,蛋白浓度等数据测算均进行了至少3次独立实验,以确保结果的可重复性和可靠性。用Origin 2021对发酵过程参数分析作图。
2 结果与分析
2.1 重组表达载体的构建与验证
经上海生工生物工程有限公司测序验证,pET-28a-COL13阳性克隆的序列正确,重组表达菌株E.coli BL21/pET-28a-COL13F构建成功。
2.2 COL13蛋白的摇瓶表达与验证
按照1.3.2节的步骤培养工程菌,在诱导表达COL13蛋白24 h后,离心获得菌体,经超声处理并离心,收集上清液用于SDS-PAGE分析。结果如图1所示,与未诱导的样品相比,在重组菌破碎上清液的20 kDa左右处出现1条明显条带,与预期的COL13蛋白分子质量相符,表明COL13蛋白得到成功表达,诱导16 h和24 h COL13蛋白质量浓度分别是1.89、1.94 g/L,多诱导8 h未见目的蛋白明显增加,为了节省时间及人工成本,在后续实验中诱导表达COL13蛋白的时间定为16 h。
1-标准蛋白分子质量Marker;2-未诱导;3-诱导8 h;4-诱导12 h;5-诱导16 h;6-诱导24 h。
图1 COL13蛋白发酵过程SDS-PAGE
Fig.1 SDS-PAGE of recombinant collagen COL13 in the fermentation process
2.3 COL13蛋白表达条件优化
采用5 L发酵罐进行实验,测试了不同温度诱导和不同OD600值进行诱导对COL13蛋白表达浓度的影响,结果如图2所示。结合BioAnaly软件分析,图2表明,诱导16 h不同温度(30、28、25、21 ℃)诱导的蛋白质量浓度分别是5.9、4.6、6.1、4.8 g/L,确定最佳诱导温度为25 ℃。滕飞等[6]研究表明大肠杆菌菌BL21(DE3)/pET21a(+)-SUMO-hCOL1A1 在30、25、20、16 ℃温度下诱导表达胶原蛋白时,25 ℃条件下蛋白表达量最高。LIU等[7]对比37、30、25 ℃下重组胶原蛋白(Ⅲ型)在E.coli BL21(DE3)中的表达量,发现25 ℃诱导时目标蛋白可溶性表达量最高,但菌体生长速率降低。CHEN等[8]构建表达菌株E.coli BL21(DE3) -pET-28a(+),发酵25 ℃低温条件下蛋白表达量最高。
1-标准蛋白Marker;2～5-诱导温度分别为30、28、25、21 ℃的蛋白表达结果。
图2 COL13蛋白诱导温度优化
Fig.2 Optimization of induction temperature for COL13 protein
图3数据分析表明,在菌种进入对数中期(OD600=60)开始诱导,最终的菌种密度相对较高,COL13蛋白的浓度达到中等水平,为5.7 g/L,推测原因是OD600值为60时细胞生长旺盛,胞内各种酶活性较高,菌种的比生长速率较高,但表达蛋白的速率较低;在对数生长后期(OD600=100)进行诱导时,最终的OD600值和COL13蛋白浓度都是最低水平,蛋白质量浓度只有4.8 g/L,推测原因是菌种进入诱导阶段,细胞活性降低,生长速率降低,导致代谢速率减慢;在对数生长中后期(OD600=80)进行诱导时,最终OD600值和COL13蛋白的浓度都相对较高,诱导16 h,蛋白质量浓度达到6.2 g/L。说明该菌株在对数生长中后期进行诱导表达蛋白效率较高。推测原因是对数中后期的菌体处于快速分裂阶段,细胞内ATP、NADPH等能量物质和还原力充足,核糖体、tRNA等翻译机器高效运作,有利于外源蛋白的合成,或对数中后期的菌体RNA聚合酶活性高,能高效响应诱导信号(如IPTG),启动外源基因转录[9]。通过发酵条件优化,使得COL13蛋白表达量比摇瓶高3.3倍,说明控制优越的培养环境在一定程度上有利于蛋白的表达。
图3 COL13蛋白诱导OD600值优化
Fig.3 Optimization of OD600 for COL13 protein
注:□、△、○:OD600值分别为60、80、100开始诱导蛋白过程菌种生长情况;■、▲、●:OD600值分别为60、80、100开始诱导蛋白表达情况。
2.4 重组菌株分批补料发酵过程分析
按照1.3.4节的方式进行5 L罐发酵培养,过程发酵参数如图4所示,在发酵时间为3.7 h,pH值和溶氧同时升高,碳源耗尽,开始流加补料培养基;OD600值达到80后,开启降温至25 ℃,发酵时间为12 h开始补加甲醇进行诱导表达蛋白。发酵过程每间隔4 h取样检测菌种浓度,诱导过程每间隔4 h取样检测COL13蛋白的含量,检测结果如图5所示,发酵28 h,诱导表达蛋白16 h,最终OD600值为115,COL13蛋白质量浓度为6.3 g/L。
图4 发酵过程参数变化图像
Fig.4 Fermentation process parameter profiles
图5 发酵过程菌种浓度和COL13质量浓度变化图像
Fig.5 Fermentation kinetics:Cell growth and COL13 yield
2.5 COL13蛋白的纯化与产品制备
按照1.3.5节的方法纯化含COL13蛋白的大肠杆菌菌泥,依次经过均质,盐析,阳离子层析和脱盐,冻干得到冻干纤维。每步纯化过程分别取样SDS-PAGE检测,结果如图6所示,均质处理后,溶液体系中存在大量杂蛋白干扰,由于传统盐析法对杂蛋白的选择性沉淀效果有限,且可能共沉淀部分核酸[8]或多糖类物质[9],因此需进一步优化纯化策略;采用阳离子层析技术,通过pH值依赖的电荷差异实现特异性纯化,将杂蛋白和目的蛋白分开的效果比较好,最终经过BioAnaly分析灰度计算COL13蛋白纯度达到96.8%。
1-Marker;2-均质后;3-盐析上清液;4-盐析沉淀;5-层析洗脱液;6-浓缩脱盐溶液;7-浓缩脱盐透过液;8-冻干纤维。
图6 纯化过程取样SDS-PAGE分析
Fig.6 SDS-PAGE analysis of purification fractions
2.6 COL13蛋白加热稳定性检测结果
将COL13蛋白冻干纤维使用0.9%氯化钠溶液溶解成1 mg/mL,分别在60、80、100 ℃温度下加热1 h,蛋白变化如图7所示,目的蛋白未见明显降解条带,证明该蛋白稳定性较好。
1-标准蛋白分子质量Marker;2-原样;3-60 ℃加热1 h;4-80 ℃加热1 h;5-100 ℃加热1 h。
图7 COL13蛋白稳定性检测结果
Fig.7 Stability assessment of recombinant collagen COL13
2.7 圆二色谱扫描实验
通过分析圆二色性,解析重组胶原蛋白的二级、三级构象,从而广泛应用于对其立体结构与功能及相互作用的研究之中[10]。圆二色谱扫描结果如图8所示。天然胶原蛋白在220 nm处出现1个小的正吸收峰,COL13蛋白在208 nm处出现1个明显的负吸收峰,在221 nm附近处出现1个明显的正吸收峰,表明制备的COL13蛋白具有三螺旋结构。
图8 天然胶原蛋白和COL13蛋白圆二色谱扫描结果
Fig.8 Circular dichroism scan results of natural collagen and COL13 protein
2.8 COL13蛋白促细胞增殖实验
根据《医疗器械生物学评价(第5版)》中体外细胞毒性试验内容“细胞存活率超过70%即表明无细胞毒性”的标准,细胞毒性结果如图9所示,在0.1～4 g/L内,COL13蛋白未表现出潜在细胞毒性。考虑产品成本和效果,选用0.05～0.6 g/L COL13蛋白进行了细胞增殖实验,结果如图10所示,与对照组相比,质量浓度为0.1～0.6 g/L的COL13蛋白样品显著促进了NIH3T3细胞增殖,在质量浓度为0.4 g/L时,细胞增殖率达到了139%,这与阳性对照EGF的增殖效应相当。于海雯[11]研究了ⅩⅦ型胶原蛋白的促细胞增殖作用,结果表明,在0.25～4 mg/mL内,重组ⅩⅦ型胶原蛋白对HaCaT细胞均表现出显著的增殖促进作用。朱云龙[12]研究了不同质量浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL)的重组胶原蛋白rhCOL1A3对人皮肤成纤维细胞增殖的影响,结果显示,在0.2 mg/mL时细胞活力达到峰值,rhCOL1A3的促细胞生长率可达14.4%。
图9 COL13蛋白细胞毒性实验结果
Fig.9 Cytotoxicity of COL13 protein
图10 COL13蛋白促细胞增殖实验结果
Fig.10 Results of cell prolifera tion promoted by COL13 protein
注:ns表示不显著,****表示P<0.000 1。
2.9 COL13蛋白抗氧化实验
胶原的抗氧化性主要来源于其所含有的一些氨基酸,如羟脯氨酸、羟赖氨酸和半胱氨酸等,且与分子质量大小有关[13-14],选用了4个质量浓度(0.2、0.4、0.8、1.6 g/L)的COL13蛋白(16 kDa)样品和市售胶原蛋白(1.0 g/L)进行DPPH自由基清除率测试实验,结果如图11所示,0.8、1.6 g/L的COL13蛋白样品的DPPH自由基清除率可以达到36.4%和37.0%,比市售胶原蛋白高。上述结果表明,制备的COL13蛋白具有一定的抗氧化功效。刘迪等[15]利用类胶原1A1C(20.1 kDa)测试DPPH自由基清除率,质量浓度为3 mg/mL时,自由基清除率达到19.8%。LE
N-LPEZ等[14]通过DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除实验证实,肽的分子质量越低,提供电子或氢来稳定自由基的能力就越强。
图11 COL13蛋白抗氧化实验结果
Fig.11 Antioxidant effects of protein COL13
3 结论与讨论
本文成功构建了E.coli BL21/pET-28a-COL13基因工程菌,通过5 L发酵罐验证了在菌种浓度为80,诱导温度为25 ℃时,COL13蛋白质量浓度较高,可以达到6.2 g/L,相较于已报道的文献,该浓度相对较高,且和酵母表达重组胶原蛋白相比,该菌种表达蛋白时间缩短3～4倍,大大降低了人员和生产成本。本研究采用简单的纯化工艺除去了溶液中的复杂的宿主蛋白色素等杂质,所使用的填料和耗材成本较低,可用于工业化放大生产。制备的胶原蛋白产品纯度高于95%,具有三螺旋结构,且该COL13蛋白在加热条件下表现出优异的稳定性,并具有一定的促进细胞增殖和抗氧化活性,促进胶原蛋白COL13在食品和化妆品领域的进一步开发。
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