2,6-二氟苯甲酰胺(2,6-difluorobenzamide,DFBA)是一种苯甲酰胺衍生物[1],是重要的有机合成原料及某些除草剂、杀虫剂的关键中间体,被广泛用于化工和制药等行业[2-3]。目前工业生产DFBA主要依赖强酸碱条件下的水解反应或酸衍生物的氨解反应,存在反应条件剧烈、工艺路线复杂、使用腐蚀性试剂、后处理步骤繁琐、产生大量三废污染物等问题[4-6]。针对这些问题,本研究室前期开发了基于微生物催化的绿色合成工艺,利用赤红球菌(Rhodococcus ruber)产生的腈水合酶催化2,6-二氟苯甲腈(2,6-difluorobenzonitrile,DFBN)生成DFBA,具有反应专一性强、反应条件温和等优势[7]。
为了提升赤红球菌(Rhodococcus ruber)的催化效率,同时避免高底物浓度下较强的毒性及水合反应产热使赤红球菌发生不可逆转的失活[7],亟需提高赤红球菌的催化效率及底物、温度的耐受性。在发酵工程领域,往往通过诱变结合适应性进化等方式提高微生物的发酵产能[8-10]。常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变通过产生高能活性离子改变细胞壁的结构造成DNA损伤,从而引起菌株突变[11],ARTP与其他诱变方法结合使用时,可显著提升突变效率[12]。吕高原[13]使用ARTP诱变、微波诱变、甲基磺酸乙酯诱变(ethyl methanesulfonate mutagenesis,EMS)3种单因子复合诱变,筛选出一株腈水合酶酶活力提高33.13%的菌株。马东旭等[14]采用ARTP诱变筛选获得较原始出发菌株酶活力提高2.27倍的菌株。此外,适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)是一种通过在特定压力下对微生物进行连续传代培养,模拟自然进化的过程[15-17],获得优良个体的方法,为提高底物及温度等的耐受性提供了有效手段[18-19]。LIU等[11]通过ARTP诱变与ALE相结合的方法改善凝结芽孢杆菌的益生菌性能,经过ARTP诱变及连续40代ALE实验后,提高了所得突变体对胆汁盐的耐受性。古永红等[20]利用ARTP诱变与适应性进化相结合,获得耐抑制物的优势酿酒酵母。综上,ARTP诱变结合ALE是一种有效的诱变策略,可以提高菌株性能,具有潜在的工业应用价值。全自动微生物适应性进化仪(automatic microbial adaptive evolution instrument,EVOL cell)是基于高气体透过性微管路及单相微流控技术开发的微生物驯化装备,具有微生物传代培养、化学因子梯度添加、实时检测等功能,用于微生物的毫升级规模培养[21],应用于多种微生物的培养和适应性进化。
为进一步提高菌株的催化效率,本研究以赤红球菌CGMCC3090为研究对象,采用ARTP-LiCl复合诱变技术,筛选得到一株遗传稳定的高效DFBA生产菌株,应用EVOL cell对其进行全自动微生物适应性进化,提升菌株的底物和温度耐受能力,提高了赤红球菌CGMCC3090生产DFBA的强度,为DFBA的酶法工业生成提供优良菌株和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株来源
赤红球菌CGMCC3090,天津科技大学系统微生物与生物制造工程研究室保藏。
1.1.2 主要试剂
蛋白胨、牛肉膏、麦芽浸粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;酵母粉,安琪酵母股份有限公司;葡萄糖、CoCl2·6H2O、吐温80,国药集团化学试剂有限公司;NaCl、MgSO4·7H2O、尿素、KH2PO4、K2HPO4(均为分析纯),天津市风船化学试剂科技有限公司;2,6-二氟苯甲腈、2,6-二氟苯甲酰胺,江苏维尤纳特精细化工有限公司;色谱纯甲醇,美国赛默飞世尔科技有限公司。
1.1.3 培养基
斜面和平板培养基(g/L):蛋白胨8.0,牛肉膏5.0,NaCl 5.0,琼脂粉20.0,pH值7.2。在121 ℃条件下灭菌20 min。
种子培养基(g/L):甘油5.0,蛋白胨8.0,麦芽浸粉5.0,酵母粉5.0,pH值7.2。在121 ℃条件下灭菌20 min。
发酵培养基(g/L):葡萄糖10.0,尿素6.0,酵母粉3.0,NaCl 2.0,K2HPO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO40.5,谷氨酸钠1.0,CoCl2·6H2O 0.02,pH值7.2。在115 ℃条件下灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
Agilent1260型HPLC仪,安捷伦科技有限公司;ARTP-Ⅱ常压室温等离子体诱变系统,无锡源清天木生物科技有限公司;ZQZY-AF8恒温培养摇床,上海知楚仪器有限公司;SpectraMax Plus 384光吸收型酶标仪,美国Molecular Devices公司;EVOL cell-A1型全自动微生物适应性进化仪,洛阳华清天木生物科技有限公司;BIOTECH-5BG-2型5 L发酵罐,保兴赛斯制药装备(上海)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 ARTP-LiCl复合诱变条件的确定
将出发菌株于种子培养基活化,32 ℃、180 r/min培养30 h,用生理盐水洗涤菌体2遍后重悬至OD600nm值为0.3～0.5,作为后续诱变处理的出发菌株悬液。
取出发菌株悬液10 μL均匀涂布在灭菌的金属载片上,在诱变功率70 W、气体流量10 slm、照射距离3 mm的条件下,设置不同的诱变照射时间(0、20、40、60、80、100、120、150、200 s)进行诱变处理。样品处理结束后,金属载片移至装有生理盐水的无菌离心管中,用涡旋振荡仪振荡5 min,使金属载片附着的菌体充分洗脱到生理盐水中,稀释10倍后取200 μL菌株悬液均匀涂布平板,30 ℃培养72 h后进行平板菌落计数;同时取200 μL稀释10倍的出发菌株悬液涂布于含有不同质量浓度LiCl(0、2、4、6、8、10、12、15、20、25 g/L)的平板上,不含LiCl的培养基作为空白对照组,同样条件培养72 h,分别按照公式(1)计算不同ARTP处理时间的致死率及不同LiCl质量浓度下的致死率:
致死率
(1)
式中:U,未经ARTP诱变或LiCl处理的菌落数;T,经ARTP诱变或LiCl处理后的菌落数。
1.3.2 初筛方法的建立
挑取待验证的诱变菌株分别接种到每孔含3 mL发酵培养基的24深孔板中,32 ℃、180 r/min培养72 h,向孔板的发酵液中加入1 mL DFBN及体积分数为1%的吐温80进行转化,转化不同时间后取1 mL转化液于1.5 mL离心管中,13 000 r/min离心1 min,取上层液体于96孔板中用酶标仪在254 nm测其吸光度,同时用HPLC测定DFBN的转化率。
1.3.3 复合诱变菌株的复筛
将初筛得到的优势菌株于斜面培养3 d,刮取斜面菌株于种子培养基,180 r/min、32 ℃培养30 h,以3%的接种量接种至发酵培养基,在180 r/min、32 ℃的条件下发酵72 h后将发酵液离心得到静息细胞。在pH 7.5的KH2PO4-NaOH缓冲液体系中,菌体浓度OD600nm值为10,DFBN浓度2.5 mol/L,吐温80体积分数1%,于30 ℃、180 r/min的条件下进行催化反应,比较出发菌株及诱变菌株的时空产率[单位为mol/(L·h)][22-23]。
DFBN分析检测方法:取200 μL转化液样品于2 mL 离心管中,用2倍体积的乙酸乙酯和1倍体积的甲醇萃取15 min,13 000 r/min下离心10 min,取100 μL有机相挥干后加1 mL流动相溶解,0.22 μm有机膜过滤后用高效液相色谱仪检测,色谱柱为Kromasil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相为V(乙腈)∶V(水)=2∶1;流速为0.8 mL/min;柱温为40 ℃;检测波长为254 nm。
1.3.4 腈水合酶酶活力检测
采用1.3.3节培养菌体的方法培养菌体得到发酵液,将100 μL发酵液加入400 μL 125 mmol/L的DFBN水溶液中,30 ℃反应10 min加入500 μL乙腈终止反应,于4 ℃下13 000 r/min离心10 min取上清液,上清液稀释10倍,经0.22 μm微孔滤膜进行过滤后采用1.3.3节中的HPLC检测方法检测DFBA的生成量,根据不同浓度DFBA标准品的对应吸收值制作标准曲线,并依此计算出酶活力,腈水合酶酶活力单位(U)定义为30 ℃条件下1 min催化底物DFBN生成1 μmol DFBA所需的酶量,其中,发酵活力(U/mL)表示1 mL发酵液中的腈水合酶活力。
1.3.5 底物胁迫适应性实验室进化
不同体积分数的DFBN对菌株的抑制程度存在差异,为确定适宜的目标底物浓度,将ARTP-LiCl复合诱变获得的菌株分别接种于含不同体积分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%DFBN的培养基中,待菌体生长至对数生长期,测定其菌体浓度。根据菌株对不同体积分数DFBN的耐受性,选取0.1%、0.2%和0.3%作为适应性进化的体积分数梯度。将培养24 h后的菌液以3%的接种量稀释后转入耗材瓶,培养基瓶中加入灭菌培养基,试剂瓶中装入含一定体积分数DFBN的培养基。利用EVOL cell进行连续传代培养,适应性进化的传代时间应为生长代谢较为旺盛的对数期,此时细胞在选择压力下的自发突变率较高[24-25],因此设定传代周期为24 h,接种量为3%,培养温度为32 ℃。进化结束后,将菌液涂布在固体平板上培养,挑取生长良好的单菌落,采用1.3.3节所述方法进行发酵性能验证。
1.3.6 温度胁迫适应性实验室进化
温度适应性进化采用与底物适应性进化相同的策略,首先根据1.3.3节和1.3.4节所述方法,测定底物适应性进化获得的菌株于不同温度(30、32、36、38、40、42 ℃)下的时空产率及相对酶活力,并测定其在该温度培养24 h后的菌体浓度,以确定目标进化温度,之后在36、38、40 ℃温度梯度下连续培养后得到温度适应性进化菌株,比较该菌株与出发菌株在目标温度下的催化效果。
1.3.7 复合诱变结合适应性进化菌株的遗传稳定性验证
将复合诱变结合适应性进化得到的菌株采用斜面转接培养[14],每代菌株“z”字形划线到斜面培养基30 ℃培养3 d,再次刮取斜面培养基上的菌株于新的斜面培养基,以此类推传代培养6次,且每代均刮取斜面培养基上的菌株于种子培养基,180 r/min、32 ℃培养30 h,以3%的接种量接种至发酵培养基,在180 r/min、32 ℃的条件下发酵72 h后将发酵液离心得到静息细胞后按照1.3.3节所述方法进行验证,以考察菌株的遗传稳定性。
1.3.8 复合诱变结合适应性进化菌株的发酵罐培养
将复合诱变结合适应性进化菌株的种子液以3%的接种量接种于5 L发酵罐中培养,发酵温度32 ℃,发酵过程中pH值控制在7.0～7.2,溶氧维持在30%左右,定时取样测定发酵罐中的生物量,发酵培养48 h后每6 h取样收集静息细胞按照1.3.3节所述方法检测菌体的时空产率。
2 结果与分析
2.1 ARTP处理时间及LiCl添加质量浓度的确定
ARTP-LiCl复合诱变能满足不同类型微生物诱变育种的需求[13],本研究将此技术用于产腈水合酶赤红球菌CGMCC3090的诱变选育,以进一步提升该菌生产DFBA的能力。为确定ARTP诱变时间和LiCl质量浓度作用条件,测定不同ARTP处理时间及LiCl质量浓度下出发菌株的致死率。如图1所示,随着ARTP处理时间的延长及LiCl质量浓度的增加,出发菌株的致死率呈上升趋势,一般认为致死率在90%左右是有效的诱变时间[26],ARTP诱变处理100 s时,致死率为92.6%,LiCl质量浓度为10 g/L时,致死率为92.3%,因此,选择该条件进行ARTP-LiCl复合诱变实验。
a-ARTP诱变致死率曲线;b-LiCl诱变致死率曲线
图1 ARTP-LiCl复合诱变条件的确定
Fig.1 Determination of the combined mutagenesis conditions of ARTP-LiCl
2.2 初筛方法的建立
在建立快速高效诱变体系的同时,对于高产菌株高效筛选平台的建立提出了更为迫切的需求。目前关于腈水合酶的快速筛选方法鲜有报道,REISINGER等[27]通过催化反应过程中NADH变化产生的荧光效应来筛选以甲基丙烯腈为底物的菌株,但是需要在反应体系中额外添加酰胺酶。林志坚[28]基于亚铁离子和铁离子与α-氨基腈溶液中的氰离子的反应,提出一种以α-氨基腈为底物的高通量筛选方法,但不适用于本研究的体系。
通过对本转化体系中底物和产物特性分析,发现转化条件下底物DFBN因体系中吐温80的乳化作用为白色乳液,随着反应的进行生成的产物DFBA因在水中溶解度低呈结晶析出,菌株的转化能力越强剩余底物量越少,转化体系越澄清,如图2-b所示,可以通过体系中底物的浓度快速筛选高效转化菌株。为此,通过在反应过程中将24深孔板中的转化液离心分离菌体和产物晶体得到上清液,用酶标仪在254 nm下检测上清液的吸光度,并用HPLC检测转化率,如图2-a所示,发现转化率与吸光值呈负相关,吸光度越低菌株的转化率越高,为此本研究建立了一种基于体系中底物和产物特性的高产菌株的快速筛选方法。
a-上清液透光度与转化率的关系;b-上清液变化趋势
图2 初筛方法的建立
Fig.2 Establishment of the primary screening method
2.3 ARTP-LiCl复合诱变菌株的获得
如图3所示,在ARTP处理时间100 s,LiCl质量分数10 g/L的条件下对出发菌株进行复合诱变,通过前期建立的初筛方法对复合诱变获得的菌株进行初筛,在初筛过程中,选择上清液吸光值低于出发菌株所对应的诱变菌株进行摇瓶发酵复筛,得到的优势菌再进行下一轮的ARTP-LiCl复合诱变,经3轮复合诱变后得到一株赤红球菌优势菌株AL3-17,与出发菌株的时空产率0.167 mol/(L·h)相比,该菌的时空产率为0.313 mol/(L·h),提高了87.43%。
图3 三轮ARTP-LiCl复合诱变筛选结果
Fig.3 The results of the three-round ARTP-LiCl compound mutagenesis screening
2.4 适应性进化菌株的获得
2.4.1 底物胁迫适应性进化菌株的获得
在发酵工业中,在高底物浓度下改善微生物的生长表型是细胞工厂开发的一个重要目标[15]。环境胁迫进化时生长细胞处于活跃的代谢和增殖状态,对环境的胁迫更为敏感,通过在环境胁迫条件下培养生长细胞,可以诱导细胞产生突变,从而筛选出能够适应胁迫环境的突变体[29]。
如图4-a所示,AL3-17在DFBN体积分数为0.1%的培养基中生长良好,经24 h培养,OD600nm值能够保持在1.4左右,与其在不含DFBN的培养条件下所达到的菌体浓度基本一致,DFBN体积分数为0.2%时菌体生长受到轻微抑制,DFBN体积分数提高到0.3%时,菌体生长抑制明显,经24 h培养OD600nm值仅为0.5左右,故以0.3%的DFBN体积分数作为底物适应性进化的目标浓度。
ALE技术使菌株克服生长环境造成的不利影响,增强菌株的稳定性,得到既能耐受不利的生长环境,又能在有利的培养条件下快速生长的微生物菌株[15],如图4-b所示,利用EVOL cell对AL3-17进行底物耐受性驯化,设定初始DFBN体积分数为0.1%,OD600nm值保持在1.4左右,当DFBN体积分数增加至0.2%时菌体生长受到抑制,因此将DFBN体积分数降低至0.1%使菌株恢复生长活力后再将体积分数升至0.2%继续驯化,以此类推,DFBN体积分数增加至0.3%时菌体生长再次受到抑制,采用上述相同的方法调整底物浓度以缓解菌株的生长压力。在底物浓度提高的过程中,部分不能耐受体积分数为0.3%底物浓度的菌株得以淘汰,从而逐渐提高AL3-17耐受底物的能力。在随后的培养过程中,菌体浓度逐渐提高,能够稳定在1.3～1.5,表明菌株能够稳定耐受体积分数为0.3%的DFBN,最终获得底物耐受能力提高的菌株AL3-ALE-1。
适应性能力强的菌株在胁迫条件下的关键酶活力显著提升,展现出良好的催化活性[30-31],适当的底物浓度为处于胁迫环境的菌株AL3-17提供压力,腈水合酶通过催化底物能够解除其毒性胁迫,增强了菌株的底物耐受性,从而增加单位时间的产物生成量。静息细胞处于非增殖状态,但具有催化能力,可以排除生长代谢活动及培养基组分对催化活性带来的干扰,将经胁迫进化后的生长细胞置于静息状态评估进化后菌体的酶催化活性[32]。按照1.3.3节的方法对菌株AL3-ALE-1与AL3-17发酵培养,测定各菌株的时空产率及相对酶活力,如图4-c所示,AL3-ALE-1时空产率为0.5 mol/(L·h),与AL3-17的时空产率0.313 mol/(L·h)相比提高了59.74%,AL3-ALE-1的腈水合酶酶活力较AL3-17提高了36.91%。
a-不同浓度DFBN对AL3-17生长的影响;b-底物适应性进化进程;c-AL3-17与AL3-ALE-1时空产率及相对酶活力对比
图4 底物适应性进化菌株的获得
Fig.4 The acquisition of substrate adaptive evolutionary strains
2.4.2 温度胁迫适应性进化菌株的获得
2.4.2.1 温度适应性进化压力的确定
在适应性进化中,适当的胁迫压力不仅可以使菌株在对数生长期内获得抵抗胁迫压力的随机突变,也可以快速淘汰不能耐受压力的菌株,从而加速适应性进化的进程[9]。检测AL3-ALE-1于不同温度下的时空产率及菌体浓度,如图5所示,菌株AL3-ALE-1在转化及培养阶段均对温度敏感:在转化阶段,温度处于30～40 ℃时,随着温度的上升,AL3-ALE-1的时空产率随之增加,在40 ℃时时空产率最高,达到0.714 mol/(L·h),且AL3-ALE-1在40 ℃下的酶活力达到最高,此时温度继续增加,时空产率下降。在培养阶段,培养温度为30～36 ℃时,菌体浓度呈现上升趋势,当培养温度升高至38 ℃时,菌体生长受到轻微抑制,而在40 ℃条件下,菌体生长受到显著抑制,培养24 h后菌体浓度显著低于36 ℃培养条件下的菌体浓度,因此,选择40 ℃作为温度适应性进化的目标温度。
图5 AL3-ALE-1在不同温度下时空产率、酶活力的变化及种子生长24 h菌体浓度
Fig.5 Space-time yield and enzyme activity of AL3-ALE-1 at various temperatures, along with the 24 h biomass concentration of the seed culture
2.4.2.2 温度胁迫适应性进化菌株的获得
本研究利用EVOL cell进行赤红球菌菌株AL3-17的温度适应性进化,如图6-a所示,菌株AL3-ALE-1在培养温度为36 ℃和38 ℃条件下生长良好,培养24 h后OD600nm值稳定在2.75左右,将培养温度提升至40 ℃后菌株生长受到抑制,因此将培养温度调至38 ℃恢复菌株生长活力后再将温度提高至40 ℃继续进行温度驯化,在之后的驯化过程中,采用同样的方法缓解高温驯化的压力,随着传代培养的进行,菌体浓度逐渐提高并趋于稳定,最终获得了温度适应性进化菌株AL3-ALE-T1。
将菌株AL3-ALE-1与AL3-ALE-T1按照1.3.3节的方法发酵培养后收集静息细胞于40 ℃下进行催化反应,投入DFBN的浓度均为2.5 mol/L,定时取样用高效液相色谱检测反应体系中DFBA的积累量,结果如图6-b所示。在相同的催化条件下,菌株AL3-ALE-T1的催化速率相较于AL3-ALE-1的催化速率更快,在转化2.75 h的产物DFBA积累量已达到2.5 mol/L,时空产率为0.91 mol/(L·h),相较于菌株AL3-ALE-1在40 ℃下的时空产率0.714 mol/(L·h)提高了27.45%,测定各菌株的相对酶活力如图6-c所示,AL3-ALE-T1较AL3-ALE-1的腈水合酶酶活力提高了17.29%。
a-AL3-ALE-1的温度适应性进化进程;b-AL3-ALE-1与AL3-ALE-T1在40 ℃下催化过程对比;c-AL3-ALE-1与AL3-ALE-T1时空产率及相对酶活力对比
图6 温度适应性进化菌株的获得
Fig.6 Acquisition of temperature-adaptive evolutionary strains
注:图c中30 ℃与40 ℃为菌株转化温度。
2.5 复合诱变结合适应性进化菌株的遗传稳定性验证
菌株的连续传代是导致菌种出现衰退现象的直接因素[33]。为了验证ARTP-LiCl复合诱变结合适应性进化获得菌株的遗传稳定性,对菌株AL3-ALE-T1进行连续6次传代培养,检测时空产率。如图7所示,菌株AL3-ALE-T1的时空产率稳定在0.91 mol/(L·h)左右,说明遗传稳定性良好。
图7 AL3-ALE-T1遗传稳定性测定
Fig.7 Determination of genetic stability of AL3-ALE-1
2.6 5 L发酵罐中AL3-ALE-T1的性能测定
为了进一步评估高产突变株AL3-ALE-T1生产能力,对该菌在5 L小试水平的发酵性能进行了测定。AL3-ALE-T1在5 L发酵罐中的生长曲线如图8-a所示,AL3-ALE-T1在发酵罐中培养6 h后进入对数生长期,在48 h左右生物量趋于稳定,在菌体生长进入稳定期后,随着发酵时间的延长,收集静息细胞检测菌体的时空产率继续增加,但菌体量不再增加,这与腈水合酶属于尿素诱导酶有关[34],尿素作为诱导剂在稳定期持续诱导菌体产酶,到72 h时,菌体的时空产率达到最高的0.93 mol/(L·h),与摇瓶的时空产率基本一致(图8-b)。
a-AL3-ALE-T1的发酵过程曲线;b-摇瓶与发酵罐培养菌体的时空产率对比
图8 AL3-ALE-T1在5 L发酵罐中的培养
Fig.8 The culture of AL3-ALE-T1 in a 5 L fermenter
相对于传统的化学法生产DFBA时存在环境污染等问题,生物催化法更加绿色环保[1],TANG等[7]研究的DFBN的生物催化方法在12 h时的DFBA的积累量为2 mol/L,YANG等[1]利用重组大肠杆菌催化生产DFBA,在11 h时DFBA的积累量为2 mol/L,李培清等[35]发明的针对来源于锰氧化橙单胞菌的腈水合酶,对α、β亚基的位点进行迭代饱和突变,提供了一种腈水合酶突变体,所述突变体在催化合成DFBA时12 h的产物积累量为0.36 mol/L,这些报道生产DFBA的效率均较低,本研究提供的赤红球菌AL3-ALE-T1在生产DFBA时2.75 h的产物积累量可达2.5 mol/L,在高效生产DFBA方面展现出显著优势。
3 结论
本研究从实验室保藏的一株赤红球菌CGMCC3090出发,利用ARTP-LiCl复合诱变结合适应性进化的技术选育高效催化DFBN生成DFBA的菌株,建立了基于转化体系特征的孔板初筛方法,在诱变时间100 s、LiCl质量浓度10 g/L的条件下,经3轮ARTP-LiCl复合诱变,筛选到一株优势菌株AL3-17,初步提高出发菌株的时空产率达到了0.313 mol/(L·h),较出发菌株提升了87.43%;进一步用EVOL cell先后进行底物和温度适应性进化,获得菌株AL3-ALE-T1,该菌株在40 ℃下的时空产率可达0.91 mol/(L·h),在5 L发酵罐内培养72 h的时空产率依然可达到0.93 mol/(L·h)。综上所述,本研究显示出ARTP-LiCl复合诱变结合适应性进化的技术在提高赤红球菌生产DFBA方面的适用性及可行性,为其他酰胺类生产菌株的选育提供有益借鉴,并为DFBA及其他酰胺化合物的高效生产提供了优良菌株,具有广阔的应用前景。
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