羊肚菌(Morchella esculenta (L.) Pers.)又名羊肚菜、羊肚蘑、编笠菌,隶属于子囊菌门盘菌目羊肚菌属,是一种珍稀的药食两用真菌,享有“素中之荤”和“软黄金”的美誉。在《本草纲目》中记载,羊肚菌性平、味甘,具有益肠胃、消化助食、化痰理气、补肾纳气和补脑提神功效[1]。羊肚菌中蛋白、多糖、氨基酸、维生素、矿物质等营养元素含量丰富,其必需氨基酸含量比一般食用菌高出25%～40%[2],具有较高的食用价值与药用潜力。羊肚菌提取物在食品、医药和保健品等领域展现出广阔的应用前景。
糖蛋白是一类由蛋白质和多糖通过共价键或非共价键相互作用形成的生物大分子,在生物体内尤其是在食用菌中广泛存在,参与了机体多种生理过程[3]。从羊肚菌中提取出来的多糖、蛋白质及多糖-蛋白质复合物引起了国内外研究学者的广泛关注。有研究报道,羊肚菌多糖能通过抗氧化作用,对葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎小鼠起到保护作用[4];羊肚菌蛋白质-多糖复合物可以降低血液中的胆固醇和甘油三酯水平,抑制脂质过氧化,调节血脂代谢,预防动脉粥样硬化和心血管疾病的发生[5]。
目前,糖蛋白的制备仍依赖于蛋白的提取方法,包括碱提酸沉法[6]、酶解提取法[7]和物理场辅助提取法[8]等。在食用菌糖蛋白提取方面,何苗[9]研究了超声波辅助提取羊肚菌糖蛋白的相关工艺,对料液比1∶15(g∶mL)、提取温度为50 ℃、超声功率300 W、超声时间5 min和超声间歇比4 s∶1 s处理条件下得到的原料,采用碱溶酸沉法提取羊肚菌糖蛋白,羊肚菌蛋白质的提取率可达82.95%,纯度为62.85%。酶解提取法因其温和、无毒和环保的优势,被广泛应用于工业上食品加工中蛋白的提取与制备[10]。超声波辅助纤维素酶提取小米米糠蛋白,蛋白提取率显著提升[11]。当前,还未见酶解法提取制备羊肚菌糖蛋白的研究报道,羊肚菌糖蛋白的结构及活性仍未得到解析。
基于此,本研究以蛋白含量为评价指标,对羊肚菌糖蛋白基料进行酶解制备及工艺优化,分析优化条件下得到的羊肚菌糖蛋白基料的主要成分含量、氨基酸及单糖组成、糖蛋白序列等,评价其在降血压、降血脂和抗氧化等方面的功能活性,以期为羊肚菌糖蛋白的开发应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
六妹羊肚菌(M.sextelata)子实体干品,徐州菌源堂商贸有限公司;无水葡萄糖、冰醋酸、牛磺胆酸钠(沃凯)、猪胆盐(沃凯),国药集团化学试剂有限公司;BCA法蛋白含量测试盒,苏州梦犀生物医药科技有限公司;果胶酶(食品级,10万 U/g)、纤维素酶(食品级,50万 U/g)、木聚糖酶(食品级,5万 U/g)、半纤维素酶(食品级,20万 U/g)、β-葡萄糖苷酶(食品级,300 U/g)、β-葡聚糖酶(食品级,2万 U/g)、DPPH、ABTS,北京索莱宝科技有限公司;DOJINDO同仁化学ACE Kit-WST A502试剂盒,上海宥露生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(100 U/g)、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、胆固醇、油酸、邻苯二甲醛、维生素C、阿卡波糖、卡托普利,上海源叶生物科技有限公司;胆固醇酯酶,上海麦克林生化科技股份有限公司;4-硝基苯基丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate,pNPB),北京酷来搏科技有限公司;总胆汁酸试剂盒,南京建成生物工程研究所;氨基酸混合标准溶液Type B、Type AN-2,日本wako公司;氨基酸自动分析仪分离缓冲液、反应缓冲液,三菱化学株式会社(产品货号:608-07461;#299-70501);所有试剂除注明外均为分析纯(AR)。
1.2 仪器与设备
GDE酶解消化器,意大利VELP公司;XB-20II全自动雪花制冰机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Waters e2695高效液相色谱仪,美国怀雅特技术公司;Freezone 12L冷冻干燥机,美国Labconco公司;GHP-9050隔水式恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;Synergy HT多功能酶标仪,美国Bio-Tek公司;DFY-200C中药超微粉碎机,上海隆拓仪器设备有限公司;DGG-9247A鼓风干燥箱,上海卉绿科学仪器有限公司;Avanti JXN-26高速冷冻离心机,美国贝克曼库尔特有限公司;L-8900-2全自动氨基酸分析仪,美国日立公司;Thermo Scientific Q ExactiveTM,赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 实验方法
1.3.1 羊肚菌糖蛋白基料的制备及工艺优化
1.3.1.1 酶制剂筛选
将新鲜羊肚菌子实体置于50 ℃的烘箱内烘干至恒重,利用超细研磨机粉碎后过60目筛。以酶解时间60 min、加酶量5%(质量分数)、料液比1∶15(g∶mL)为固定条件,选取果胶酶(pH 6,温度55 ℃)、纤维素酶(pH 5,温度55 ℃)、木聚糖酶(pH 5,温度50 ℃)、半纤维素酶(pH 5,温度50 ℃)、β-葡萄糖苷酶(pH 5,温度50 ℃)、β-葡聚糖酶(pH 5,温度50 ℃)进行酶解反应。酶解结束后沸水浴灭酶10 min,10 000 r/min离心15 min,取上清液定容至固定体积测定蛋白含量,以蛋白含量为筛选指标确定后续酶解制备羊肚菌糖蛋白基料的酶制剂。以料液比1∶15(g∶mL)、提取温度50 ℃、提取时间60 min的水浴提取样品作为对照。
1.3.1.2 单因素试验
根据1.3.1.1节酶制剂筛选结果,确定果胶酶为酶解制备羊肚菌糖蛋白基料的酶制剂。按照1.3.1.1节酶解工艺,采用控制变量法,设置不同酶解时间(20、40、60、80、100 min)、不同果胶酶添加量(3%、4%、5%、6%、7%,质量分数)、不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g∶mL)、不同酶解pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、不同酶解温度(50、55、60、65、70 ℃)进行酶解反应,每个试验设置3组重复。
1.3.1.3 响应面试验
根据单因素试验结果,选择A(酶解时间)、B(加酶量)、C(料液比)、D(酶解温度)为自变量,以酶解液中蛋白含量为响应值,采用Box-Behnken实验对羊肚菌糖蛋白基料制备酶解工艺进行四因素三水平的响应面优化试验(表1),每个试验设置3组重复。对试验组数据进行回归拟合,确定羊肚菌糖蛋白基料的酶解制备最优工艺,并进行验证。将最优工艺获得的酶解液-80 ℃冻干48 h,得到羊肚菌酶解基料冻干粉。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface experiment factors and levels
水平因素酶解时间(A)/min加酶量(B)/%料液比(C)(g∶mL)酶解温度(D)/℃-12051∶155004061∶22.55516071∶3060
1.3.2 羊肚菌酶解基料成分含量分析
1.3.2.1 羊肚菌酶解液/基料蛋白含量分析
采用BCA法来测定羊肚菌酶解样品中的蛋白含量。10 μL酶解液离心上清液,或基料冻干粉配制溶液,加入190 μL试剂盒工作液(BCA法蛋白含量测定试剂盒),60 ℃烘箱保温30 min,于562 nm处测定吸光值。根据试剂盒法计算羊肚菌酶解液/基料中蛋白含量。
1.3.2.2 羊肚菌酶解基料多糖含量分析
采用苯酚-硫酸法(SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》)测定羊肚菌酶解基料中多糖含量。吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 mg/L标准葡萄糖工作液,用蒸馏水补至1.0 mL;加入0.5 mL苯酚溶液和2.5 mL硫酸,混合均匀后置于100 ℃水浴锅中反应15 min;490 nm下测定样品吸光值并绘制标准曲线。吸取由纯水配制成0.2 mg/mL的冻干粉样品溶液,按照上述步骤进行多糖分析,根据标准曲线计算样品中多糖含量。
1.3.2.3 羊肚菌酶解基料氨基酸组成及含量分析
参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的酸水解法,利用氨基酸自动分析仪测定羊肚菌酶解基料冻干粉中的氨基酸组成和含量。各取0.1 mL氨基酸混合标准溶液Type B和Type AN-2,纯水定容至1.0 mL备用。选用日立L-8900氨基酸分析仪分离柱(4.6 mm×60 mm,粒径3 μm,填充阳离子交换树脂);分析条件:进样量20 μL,分离缓冲液0.35 mL/min,反应缓冲液0.3 mL/min;在570、440 nm波长下分别进行氨基酸定性定量检测。
1.3.2.4 羊肚菌酶解基料单糖组成及含量分析
参考楚文琪等[12]方法,采用高效阴离子交换色谱法(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)分析羊肚菌酶解基料的单糖组成及含量。称取2.0 mg冻干粉样品于楔形瓶中,加入3.0 mL、2.0 moL/L的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),110 ℃酸水解4 h,自然冷却后50 ℃氮吹仪吹干,加入3.0 mL甲醇继续吹干,重复操作直至样品无酸味。用2.0 mL纯水溶解样品,12 000 r/min离心10 min,取1.0 mL上清液经0.22 μm水相微孔膜过滤后进行HPAEC单糖分析。流动相为H2O和0.1 mol/L NaOH。
1.3.2.5 羊肚菌酶解基料蛋白序列鉴定
参考LI等[13]的方法,利用LC-MS/MS对羊肚菌酶解基料中的糖蛋白序列进行鉴定。称取1.0 mg羊肚菌酶解基料冻干粉,加入10 μL 0.1%(体积分数)三氟乙酸溶解,层析柱脱盐处理后真空干燥。用20 μL、0.1%甲酸溶液溶解样品,17 000 r/min、4 ℃离心20 min,取3.0 μL上清液样品进行LC-MS/MS糖蛋白序列分析。LC-MS/MS流动相及设置参数同文献。
1.3.3 羊肚菌酶解基料活性评价
1.3.3.1 羊肚菌酶解基料的DPPH自由基清除抗氧化能力分析
参考倪策等[14]的方法,称取10 mg冻干粉样品加入1.0 mL蒸馏水,10 000 r/min离心5 min后取上清液,纯水逐级稀释配制成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.0312 5 mg/mL的待测样品。取0.5 mL待测样品,与0.5 mL、0.1 mmol/L DPPH溶液混合均匀,室温下避光反应30 min,517 nm下测定样品吸光值。以纯水代替样品作为空白对照组,以无水乙醇代替DPPH工作液作为实验对照组,样品DPPH自由基清除率计算见公式(1):
DPPH自由基清除率
(1)
式中:A1,样品组吸光值;A2,实验对照组吸光值;A0,空白对照组吸光值。样品DPPH自由基清除率50%时的样品浓度为IC50。
1.3.3.2 羊肚菌酶解基料的ABTS阳离子自由基清除抗氧化能力分析
参考倪策等[14]的方法,称取10 mg冻干粉样品加入1.0 mL蒸馏水,10 000 r/min离心5 min取上清液,纯水逐级稀释配制成1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的待测样品。取0.1 mL待测样品,与1.0 mL、3.5 mmol/L的ABTS阳离子工作液混合均匀,室温下避光反应6 min,734 nm下测吸光值。以纯水代替样品作为空白对照组,以PBS代替ABTS阳离子工作液作为实验对照组,样品ABTS阳离子自由基清除率计算见公式(2):
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
式中:A1,样品组吸光值;A2,实验对照组吸光值;A0,空白对照组吸光值。样品ABTS阳离子自由基清除率50%时的样品浓度为IC50。
1.3.3.3 羊肚菌酶解基料的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性分析
采用试剂盒的方法测定样品ACE抑制活性。称取0.1 g冻干粉样品,加入50 mL纯水溶解,逐级稀释为浓度梯度2.0、0.4、0.08、0.016、0.003 2 mg/mL的样品溶液。取20 μL样品溶液,加入20 μL试剂盒基质缓冲液和20 μL试剂盒酶工作液,37 ℃培养60 min,加入200 μL试剂盒指示剂工作液,25 ℃培养10 min,于450 nm处测定吸光值。样品ACE抑制率计算采用试剂盒法,样品抑制率为50%时的浓度为IC50。
1.3.3.4 羊肚菌酶解基料的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析
参考薛森等[15]的方法,称取40 mg冻干粉样品加入1.0 mL蒸馏水,10 000 r/min离心5 min取上清液,纯水逐级稀释配制成40、20、10、5、2.5 mg/mL的待测样品。取200 μL待测样品,与200 μL、2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液,37 ℃培养20 min后,加入200 μL、5 mg/mL对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液,37 ℃培养20 min后,在405 nm下测吸光度。以PBS代替酶溶液和样品溶液作为空白对照组,以PBS代替样品溶液作为空白组,以PBS代替酶溶液作为实验对照组。样品α-葡萄糖苷酶抑制活性计算见公式(3):
α-葡萄糖苷酶抑制活性
(3)
式中:A1,样品实验组吸光值;A2,实验对照组吸光值;A3,空白组吸光值;A4,空白对照组吸光值。样品α-葡萄糖苷酶抑制活性50%时的样品浓度为IC50。
1.3.3.5 羊肚菌酶解基料的胆固醇酯酶抑制活性分析
参考温柔等[16]的方法,称取10 mg冻干粉样品加入1.0 mL蒸馏水,10 000 r/min离心5 min取上清液作为待测样品。取50 μL待测样品,与50 μL、50 U/mL胆固醇酯酶溶液,在1.0 mL缓冲液(含5.16 mmol/L牛磺胆酸钠、0.1 mol/L NaCl的0.1 mol/L pH 7.0 PBS)中混合均匀,加入20 μL、4 mmol/L 4-硝基苯基丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate,pNPB),25 ℃培养30 min,在405 nm下测样品吸光值。以蒸馏水代替酶溶液和样品溶液作为空白对照组,以蒸馏水代替样品溶液作为空白组,以蒸馏水代替酶溶液作为实验对照组。样品胆固醇酯酶抑制活性计算见公式(4):
胆固醇酯酶抑制活性
(4)
式中:A1,空白组吸光值;A2,空白对照组吸光值;A3,样品实验组吸光值;A4,实验对照组吸光值。
1.3.3.6 羊肚菌酶解基料的胆酸盐吸附和胆固醇胶束溶解抑制活性分析
参考柯玉[17]的方法对羊肚菌酶解基料的胆酸盐吸附能力和胆固醇胶束溶解抑制能力进行测定。将KCl(6.8 mmol/L)、KH2PO4(0.8 mmol/L)、NaHCO3(85 mmol/L)、NaCl(38.4 mmol/L)、MgCl2(0.33 mmol/L)、HCl(8.4 mmol/L)溶解于去离子水中制备模拟肠液(simulated intestinal fluid,SIF)。将15.625 g胆盐、1.933 g胆固醇、3.531 g油酸用SIF溶解,超声乳化3 h至胆固醇完全溶解后用去离子水定容至1.0 L后装于密闭容器中,37 ℃下静置24 h获得胆固醇胶束溶液。称取10 mg冻干粉样品,加入1.0 mL胶束溶液溶解,37 ℃下孵育2 h,冰浴15 min后,10 000 r/min、4 ℃离心15 min取上清液。上清液按1∶1(体积比)比例加入甲醇,重复提取2次,合并收集溶液,参考总胆汁酸试剂盒法测定溶液中胆酸盐含量。采用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量,在400 μL上清液中加入1.5 mL、0.1 mg/mL的邻苯二甲醛(冰醋酸溶解配制)、1.0 mL硫酸,混合均匀后静置25 min,550 nm下测定样品吸光值。以只含胆固醇的胶束溶液作为空白组对照。样品胆酸盐吸附率和胆固醇胶束溶解抑制率计算见公式(5)、公式(6):
胆酸盐吸附率
(5)
式中:A1,空白组吸光值;A2,样品组吸光值。A1和A2为405 nm下吸光值。
胆固醇胶束溶解抑制率
(6)
式中:A1,空白组吸光值;A2,样品组吸光值。A1和A2为550 nm下吸光值。
1.3.3.7 羊肚菌糖蛋白分子对接ACE抑制活性分析
采用MOE 2019软件(Chemical Computing Group ULC, Montreal, Canada)进行1.3.2.6节鉴定得到的羊肚菌糖蛋白与ACE受体蛋白(PDB:1O86)的分子对接ACE抑制活性分析。MOE软件对ACE受体蛋白晶体结构进行优化,对羊肚菌蛋白分子进行糖基化位点修饰。分子对接参数设置“Pre-Placement,10 000;Placement,1 000;Refinement,100”。MOE软件分析羊肚菌糖蛋白与ACE受体的分子间结合情况。
1.4 数据处理
所有实验均重复平行3次,数据分析结果以“平均值±标准差”表示,采用GraphPad Prism 10.0进行组间单因素方差分析和数据绘图,Design-Expert.V8.0.6.1软件进行响应面分析,P<0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 酶制剂筛选结果
图1为羊肚菌酶解基料制备酶制剂筛选及单因素实验结果。由图1-A可知,不同酶制剂水解获得的羊肚菌酶解液中蛋白含量差异显著,相较于水提对照组(标记为空白组),经果胶酶酶解获得的羊肚菌酶解液中的蛋白含量最高,为12.39 mg/mL,较水提对照组提高了25.23%,经果胶酶酶解获得的羊肚菌酶解基料得率最高,并与其他组别有显著性差异(电子版增强出版附图1,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044374,以下附图、附表同)。因此,选择果胶酶进行后续羊肚菌酶解基料制备试验。
A-酶制剂筛选;B-酶解时间;C-加酶量;D-料液比;E-pH;F-酶解温度
图1 酶制剂的筛选及不同因素对酶解液中蛋白含量的影响
Fig.1 Screening of enzyme preparations and effects of different factors on protein content in enzymatic hydrolysate
注:不同小写字母表示各组之间具有显著性差异(P<0.05)。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 酶解时间对羊肚菌酶解液中蛋白含量的影响
由图1-B可知,酶解液中蛋白含量在酶解20 min时达到最高。随着酶解时间进一步延长,蛋白含量呈降低趋势,当酶解时间达到60 min后,蛋白含量趋于平稳,60、80、100 min试验组制备的羊肚菌酶解液中蛋白含量无显著差异。酶解前期,酶解底物浓度较高,随着时间的延长,底物进一步转化,促使蛋白产物含量增加;60 min后,酶解反应趋于平衡,蛋白含量不再明显升高。综上所述,选择酶解时间20～60 min进行后续试验。
2.2.2 果胶酶添加量对羊肚菌酶解液中蛋白含量的影响
由图1-C可知,随着果胶酶添加量的增多,酶解液中蛋白含量呈现先升高后趋于稳定的趋势。当果胶酶添加量在低水平时,酶解反应效率低,底物水解不充分;随着加酶量的增加,酶和底物充分接触,使得更多的蛋白分子被释放出来;当加酶量增加到一定程度时,酶和底物结合达到饱和,继续增加果胶酶添加量对蛋白释放影响不大。相较于水提对照组,在加酶量5%、6%、7%下获得的酶解液中,蛋白含量提升显著;在6%果胶酶添加量下,酶解液中蛋白含量最高,达到12.5 mg/mL,说明原料在6%果胶酶的作用下可以充分释放蛋白。综上所述,选择加酶量5%～7%进行后续试验。
2.2.3 料液比对羊肚菌酶解液中蛋白含量的影响
由图1-D可知,随着料液比的升高,酶解液中的蛋白含量总体呈缓慢上升趋势。在料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)时,酶解液中的蛋白含量较水提对照组中的蛋白含量有显著性差异。在1∶10料液比下,反应体系较为浓稠,不利于果胶酶与底物结合;随着反应体系溶剂比例的增大,体系黏稠度降低,酶解效率增加促进了蛋白的释放[18]。综上所述,选取1∶15～1∶30(g∶mL)作为后续响应面试验条件。
2.2.4 酶解pH值对羊肚菌酶解液中蛋白含量的影响
由图1-E可知,当pH值为5.0时,酶解液中的蛋白含量最高,达到13.69 mg/mL。随着酶解pH值的增加,果胶酶活性降低,蛋白释放减缓,因此确定pH值5.0为响应面优化固定条件。
2.2.5 酶解温度对羊肚菌酶解液中蛋白含量的影响
由图1-F可知,随着温度升高,酶解液中的蛋白含量先增加后减少。在55 ℃下,酶解液中的蛋白含量达到最高,为11.57 mg/mL。50、55、60 ℃下的酶解液中蛋白含量无显著性差异。适当的温度有利于底物分子结构的展开及增加果胶酶的活性,使得酶解反应更加充分,产生更多的蛋白;随着温度的进一步增加,果胶酶的活性结构被影响,果胶酶活性降低,酶解反应速率降低,酶解液中的蛋白含量降低。综上所述,酶解温度50～60 ℃下,采用果胶酶酶解制备羊肚菌糖蛋白基料效果较优。
2.3 Box-Behnken响应面试验结果
根据单因素试验结果设置响应面试验组,共计29个试验组合,试验结果见附表1所示。Design-Expert 8.0对响应面结果进行多元回归拟合,得到蛋白含量(Y)与酶解时间(A)、加酶量(B)、料液比(C)、酶解温度(D)的多元二次回归方程:Y=12.46-0.047 6A+0.264 8B+0.34C-0.462 5D+0.115AB+0.362 3AC+0.265AD+0.042 4BC-0.022 5BD-0.17CD-0.183 5A2-0.205 1B2-0.097 5C2-0.431 1D2。各试验组实际蛋白含量接近预测值,模型拟合精度高,拟合公式可用。
对响应面结果进行方差分析(附表2),其中,F值反映各试验因子对响应值影响的显著性,F值越大,该变量的显著性越高,本实验模型F值达到62.91,加酶量、料液比和酶解温度对响应值影响的F值均超过100。P值反映显著性差异,P值越小越显著,P<0.05时证明该模型具有统计学意义。本实验二次回归模型P<0.000 1,达到极显著水平。变异失拟项P值不显著(0.516 4>0.05),说明试验无失拟因素存在,回归模型能充分反映实际情况。决定系数R2为0.9844,模型能解释98.44%响应值的变化。模型相关系数
为0.968 7,试验结果有96.87%受试验因素的影响。方差分析结果说明预测结果与实际结果有着较好的一致性。
响应面模型结果显示,加酶量(B)、料液比(C)、酶解温度(D)对蛋白含量的影响均大于酶解时间(A)。因素交互作用响应面图形越陡峭、等高线越接近椭圆形,因素的交互作用越显著[19]。如图2结果所示,加酶量(B)与酶解温度(D)两因素交互的响应面曲线坡度最陡峭且等高线图呈椭圆形,说明上述2个因素对羊肚菌酶解液中蛋白含量具有显著影响。各因素交互作用对羊肚菌酶解液中蛋白含量影响排序为BD>BC>AB>CD>AD>AC。Design-Expert 8.0软件优化得到的羊肚菌酶解基料制备最佳工艺条件为:酶解时间55.94 min,加酶量7%,料液比1∶30,酶解温度52.42 ℃。在上述条件下,预测得到羊肚菌酶解液中蛋白含量为13.15 mg/mL。考虑到实际操作,在验证试验中,设定酶解时间为56 min,加酶量7%,料液比1∶30,温度53 ℃进行验证。经过3次重复性试验,测得羊肚菌酶解液中的蛋白含量为13.42 mg/mL,与最佳工艺预测值接近,证明获得的羊肚菌糖蛋白基料酶解制备工艺可靠。相对于水提样品组,果胶酶水解制备羊肚菌酶解液中蛋白含量提升了39%。GAO等[20]通过响应面法优化了超声波辅助酶法提取松茸多糖的工艺,最佳工艺条件下提取得到的松茸多糖得率为(19.74±0.51)%,较传统热水浸提法提高了4倍以上。由此说明,优化酶解工艺可使目标产物的含量及得率得到进一步提升。
A、D-AB;B、E-AC;C、F-AD;G、J-BC;H、K-BD;I、L-CD
图2 羊肚菌酶解制备糖蛋白基料响应面优化图
Fig.2 Response surface optimization diagram for the preparation of glycoprotein base material via enzymatic hydrolysis of Morchella esculenta
2.4 羊肚菌酶解基料成分分析结果
2.4.1 羊肚菌酶解基料蛋白和多糖含量分析
对冻干的羊肚菌酶解基料中的蛋白、多糖含量进行分析,结果显示,羊肚菌酶解基料中蛋白含量为(702.3±1.06) mg/g,多糖含量为(153.5±0.09) mg/g。上述结果高于超微粉碎处理得到的羊肚菌粉中的蛋白质和多糖含量[21],表明果胶酶酶解能有效提高原料中蛋白和多糖的释放。
2.4.2 羊肚菌酶解基料氨基酸组成及含量分析
羊肚菌酶解基料中氨基酸组成及含量见附表3。结果显示,羊肚菌酶解基料中含有17种氨基酸,氨基酸总量为140.19 mg/g;含有7种必需氨基酸,总量为37.89 mg/g,占氨基酸总量的27.03%;在17种氨基酸中,谷氨酸含量占比最高,占氨基酸总量的24.97%;其次是丙氨酸,占比9.94%;含量最低的是组氨酸,仅占比1.43%。
2.4.3 羊肚菌酶解基料单糖组成及含量分析
羊肚菌酶解基料中单糖组成及含量如表2所示。结果显示,羊肚菌酶解基料中单糖组成主要是葡萄糖、甘露糖、葡萄糖胺和半乳糖,葡萄糖含量最高,达(189.54±10.85) mg/g,占单糖总量的90.88%;半乳糖含量最低,仅占单糖总量的0.25%。该结果与高琛采用匀浆制备的羊肚菌蛋白质-多糖复合物的结果相似,羊肚菌蛋白质-多糖复合物中葡萄糖占比最高(70.92%)[5]。
表2 羊肚菌酶解基料中单糖组成和含量
Table 2 Monosaccharide composition and content in the Morchella esculenta enzymatic hydrolysate base material
单糖种类葡萄糖胺半乳糖葡萄糖甘露糖含量/(mg/g)6.45±0.120.53±0.05189.54±10.8512.03±1.55比例/%3.090.2590.885.77
注:数据表示为“平均值±标准差”(n=3)。
2.5 羊肚菌糖蛋白序列分析结果
经LC-MS/MS鉴定(图3),在羊肚菌酶解基料中,存在2种糖蛋白分子,蛋白的NCBI ID编号为A0A3 N4KY88|A0A3 N4KY88_9PEZI和A0A3 N4KBH0|A0A3 N4KBH0_9PEZI。羊肚菌蛋白A0A3 N4KY88|A0A3 N4KY88_9PEZI分子中,岩藻糖以O-连接糖基化方式,通过α-糖苷键连接到蛋白的丝氨酸羟基上,糖基化位点为282。羊肚菌蛋白A0A3 N4KBH0|A0A3 N4KBH0_9PEZI分子中,岩藻糖和葡萄糖以O-连接糖基化方式,通过α-糖苷键分别连接到蛋白的丝氨酸和苏氨酸羟基上,糖基化位点分别为2 510和564。2种糖蛋白分子质量分别为101、312 kDa,为含Zn(2)-C6真菌型结构域的糖蛋白和含SANT结构域的糖蛋白。
图3 羊肚菌糖蛋白LC-MS/MS图谱
Fig.3 LC-MS/MS spectrum of Morchella esculenta glycoprotein
2.6 羊肚菌酶解基料活性分析结果
2.6.1 羊肚菌酶解基料的抗氧化活性分析结果
抗氧化能力主要体现在自由基清除能力上,本文通过测定羊肚菌酶解基料的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,来评估羊肚菌酶解基料的抗氧化能力。羊肚菌酶解基料对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除抗氧化分析结果如图4-A所示。随着样品浓度的升高,样品对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除抗氧化能力逐渐增大,清除率与浓度呈正相关。当样品质量浓度为0.5 mg/mL时,羊肚菌酶解基料对DPPH自由基清除率达到96.48%;当样品质量浓度为1.0 mg/mL时,羊肚菌酶解基料对ABTS阳离子自由基清除率达到99.85%。DPPH自由基清除IC50值为0.082 7 mg/mL,ABTS阳离子自由基清除IC50值为0.261 1 mg/mL。与文献报道的羊肚菌醇提物相比,羊肚菌酶解基料具有较强的自由基清除抗氧化能力,抗氧化活性处于较优水平[22]。
A-抗氧化活性;B-ACE抑制活性;C-降糖活性;D-降脂活性
图4 羊肚菌酶解基料活性分析
Fig.4 Activity analysis of the Morchella esculenta enzymatic hydrolysate base material
2.6.2 羊肚菌酶解基料的ACE抑制活性分析结果
血管紧张素转换酶可以通过调节肾素-血管紧张素系统,将血管紧张素Ⅰ转化成具有升压作用的血管紧张素Ⅱ。同时还可以分解降压肽之一的缓激肽。抑制ACE活力可以起到降血压的作用。羊肚菌酶解基料的ACE抑制活性结果如图4-B所示。随着样品浓度的升高,样品对ACE抑制活性逐渐增大,ACE抑制活性与样品浓度呈正相关,在2 mg/mL样品质量浓度下,羊肚菌酶解基料的ACE抑制率达到95.12%,ACE抑制IC50值为0.011 5 mg/mL。羊肚菌酶解基料的ACE抑制活性远高于文献报道的蟋蟀多肽,说明羊肚菌酶解基料具有较好的ACE抑制活性[23]。
2.6.3 羊肚菌酶解基料的α-葡萄糖苷酶抑制活性分析结果
食物中的碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下被分解成葡萄糖,机体吸收过量葡萄糖后引发餐后血糖升高。因此,通过分析羊肚菌酶解基料对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,来评价羊肚菌酶解基料的潜在降糖效果。羊肚菌酶解基料的α-葡萄糖苷酶抑制活性结果如图4-C所示。随着样品浓度的升高,样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐渐增大,α-葡萄糖苷酶抑制率与样品浓度呈正相关,羊肚菌酶解基料的α-葡萄糖苷酶抑制IC50值为12.82 mg/mL。
2.6.4 羊肚菌酶解基料的胆固醇酯酶抑制活性、胆酸盐吸附和胆固醇胶束溶解抑制活性分析结果
胆固醇酯酶是一种关键的脂质消化酶,降低胆固醇酯酶的催化能力可以有效下调胆固醇水平,从而达到降低血脂的目的。通过分析基料对胆固醇酯酶的抑制活性,来评价基料的潜在降脂效果。提高胆酸盐吸附能力,破坏胆酸盐肝-肠循环路径,可降低胆酸盐重吸收量、肝细胞中胆固醇浓度、破坏胆酸盐胶束结构,从而达到降低脂质消化吸收的效果[24]。通过分析基料的胆酸盐吸附和胆固醇胶束溶解抑制活性,来评价潜在降低脂质消化吸收效果。羊肚菌酶解基料的胆固醇酯酶抑制活性、胆酸盐吸附和胆固醇胶束溶解抑制活性如图4-D所示。当样品质量浓度为10 mg/mL时,羊肚菌酶解基料的胆固醇酯酶抑制率为35.68%,胆酸盐吸附率为32.48%,胆固醇胶束溶解抑制率为24.88%。羊肚菌酶解基料的胆酸盐吸附率、胆固醇胶束溶解抑制率,与10 mg/mL的奥利司他效果相当,说明羊肚菌酶解基料具有降脂活性。
2.7 羊肚菌糖蛋白分子对接活性分析
采用分子质量为101 kDa的羊肚菌糖蛋白A0A3 N4KY88|A0A3 N4KY88_9PEZI,进行羊肚菌糖蛋白与ACE受体蛋白的分子对接活性评价。结果显示,糖蛋白分子与ACE受体蛋白分子之间形成了氢键和静电相互作用力,分子间形成的结合键键能总和为-818.17 kcal/mol,单一结合键能最低达-8.328 kcal/mol,键能在-6.0 kcal/mol以下的有23个结合键。蛋白结合构象及结合能量图如图5所示。分子间结合键能越低,分子间结合效果越好[25]。上述结果说明,糖蛋白以低键能、多位点结合ACE受体发挥ACE抑制活性作用。
图5 羊肚菌糖蛋白与ACE受体蛋白分子对接结果
Fig.5 Docking result of Morchella esculenta glycoprotein and the ACE receptor
3 结论
本文研究了果胶酶水解制备羊肚菌糖蛋白基料的工艺,并通过优化工艺条件,获得了酶解时间56 min,加酶量7%,料液比1∶30,温度53 ℃的羊肚菌糖蛋白基料的最优制备工艺,在此条件下得到的羊肚菌酶解基料中的蛋白含量为702.3 mg/g,多糖含量为153.5 mg/g,氨基酸总量140.19 mg/g。羊肚菌酶解基料中鉴定得到2种糖蛋白分子,分子质量为101、312 kDa。羊肚菌糖蛋白酶解基料具有抗氧化、降血压、降血糖和降血脂活性。研究结果为羊肚菌糖蛋白相关产品开发提供理论依据。本研究中获得的羊肚菌糖蛋白酶解基料仍是混合物,后续工作中可结合超滤等分离技术,进一步对羊肚菌糖蛋白进行分离纯化,探究其活性作用机制及应用场景。
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