黑曲霉过表达柠檬酸转运蛋白和丙酮酸脱氢酶及其发酵产柠檬酸的研究

柠檬酸(citrate)为全球产量最大的有机酸,2024年全球产量272万t,我国产190万t,占世界总产量的70%。目前,柠檬酸工业化生产方式为利用黑曲霉(Aspergillus niger)以玉米、木薯或葡萄糖等为原料深层发酵,发酵液经钙盐法或色谱法提取[1]。

柠檬酸作为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)的核心代谢中间体,在生物体的能量代谢、碳源利用以及细胞稳态调控中扮演着关键角色[2]。柠檬酸的跨膜运输高度依赖特异性转运蛋白,近年来针对这类蛋白的功能研究逐渐成为微生物代谢工程和病原菌致病机制领域的热点[3]。柠檬酸胞外转运蛋白属于促进者超家族(major facilitator superfamily,MFS)亚类DHA1,作为药物H+逆向转运蛋白发挥作用,与玉米黑粉菌的衣康酸转运蛋白基因同源[4]。ODONI等[4]鉴定出黑曲霉基因组中编码柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA,并将该基因在酿酒酵母中异源表达,实现其以葡萄糖为碳源的生长过程中分泌柠檬酸。STEIGER等[5]在野生型黑曲霉中过表达cexA基因,该突变株分泌的柠檬酸比亲本菌株高5倍,而黑曲霉cexA缺失菌株完全失去分泌柠檬酸的能力,其代谢产物流向草酸[5]。NAKAMURA等[6]过表达和敲除白曲菌和米曲霉中的同源cexA基因,证明cexA不仅增强细胞外柠檬酸的积累,而且提高了细胞内产生柠檬酸的代谢通量。

丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)复合物是位于线粒体基质的多酶复合物,由PDH(E1组分)、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2组分)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3组分)组成[7],其中E1为该酶复合体的限速酶。PDH复合体催化丙酮酸不可逆的氧化脱羧生成乙酰Co A、CO2、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)和H+,此步反应与柠檬酸合成和积累呈正相关,是柠檬酸合成积累的关键步骤[8]。这一反应不仅是碳源进入TCA循环的必经步骤,也是调控细胞内还原力与能量(ATP)平衡的关键环节[9]。生成的乙酰CoA进入到TCA循环,与草酰乙酸共同参与生成柠檬酸。LEI等[10]用多组学方法来重排PDH旁路的中心碳通量,从而增强中间前体(特别是乙酰CoA)的供应,提高了酿酒酵母中乙酰CoA衍生化合物的生物合成。而ZHANG等[11]在酵母胞质中表达的细菌PDH复合物,降低胞质乙酰CoA合成的能量成本。张香香等[7]以黑曲霉自身启动子的过表达内源pdhA基因,使突变菌株的柠檬酸产量提高4%以上,上述研究结果表明,在黑曲霉中过表达PDH基因可能会提高乙酰CoA的生成,为柠檬酸的合成及整个TCA循环的运转提供了前提条件。

近年来,针对柠檬酸合成中心代谢途径关键节点的改造策略(如增强辅因子供应、平衡代谢通量或解除反馈抑制),已成为提高黑曲霉产柠檬酸能力的重要手段[12]。研究表明,过表达柠檬酸胞外转运蛋白基因cexA可显著提高黑曲霉对柠檬酸的胞外分泌能力[13],但同时可能使黑曲霉胞内乙酰CoA快速消耗,进而限制柠檬酸的合成。PDH作为连接糖酵解与TCA循环的核心酶复合体,催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA(图1),因此,可以通过增强PDH基因表达量,加速丙酮酸脱羧反应速度及时补充乙酰CoA。目前于产柠檬酸黑曲霉中,同时过表达柠檬酸胞外转运蛋白基因和PDH基因的研究尚未见报导。

本研究以高产柠檬酸的黑曲霉CGMCC 10142为出发菌株,采用基因工程技术在黑曲霉中共过表达其自身柠檬酸胞外转运蛋白cexA和丙酮酸脱氢酶基因pdhA,强化柠檬酸合成代谢前体物乙酰CoA,同时提高柠檬酸转运和糖酵解途径代谢速率,通过摇瓶筛选和30 L生物反应器的放大发酵实验,探究黑曲霉CGMCC 10142双基因共过表达后对其发酵产柠檬酸的影响,为后续柠檬酸生产菌的代谢工程改造提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用黑曲霉CGMCC 10142菌株、大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌AGL1,所用质粒p44、pf3、p60均由天津科技大学生物工程学院生化过程与技术研究室保藏,p94、pf4质粒为本研究构建。

1.1.2 试剂与仪器

酵母粉、(NH4)2SO4、KH2PO4、K2HPO4、蛋白胨、博来霉素,索来宝科技有限公司;尿苷(uridine)、5-氟乳清酸(5-fluoroborotic acid,5-FOA)采购自上海麦克林生化科技股份有限公司;乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)、2-(N-吗啉)乙磺酸一水[2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate,MES]、氯仿、异戊醇,天津市永大化学试剂公司,上述试剂均为分析纯;柠檬酸、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、富马酸、草酰乙酸等标准酸分析纯样品,南京诺唯赞生物科技有限公司;玉米液化液,日照金禾博源生化有限公司。

LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,蒸馏水定容至1 L,121 ℃,灭菌20 min。

PDA培养基(g/L):马铃薯去皮切成小块,称取200 g,加入适量蒸馏水煮20 min,纱布过滤,蒸馏水定容至1 L,加入葡萄糖20 g,121 ℃灭菌15 min[14]。

种子培养基:玉米液化液(初始总糖质量浓度为210 g/L)加蒸馏水稀释至糖质量浓度为100 g/L,115 ℃高温灭菌 20 min[15]。

发酵培养基:玉米液化液(初始总糖质量浓度为210 g/L)加蒸馏水稀释至糖质量浓度为160 g/L～184 g/L,115 ℃高温灭菌 20 min[15]。

IM(induction medium)诱导培养基(g/L):NaCl 0.15,K2HPO4 2.05, (NH4)2SO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl2 0.066,FeSO4·7H2O 0.00 248,0.04 mol/L MES(避光),1 mL 0.2 mol/L AS,甘油5.0 mL,蒸馏水定容至1 L[16]。

初筛培养基:含有15 μg/mL博来霉素,2.5 g/L 5-FOA的PDA培养基。博来霉素和5-FOA分别经0.22 μm滤膜过滤后添加至PDA培养基中。PDA培养基于115 ℃灭菌20 min。

复筛培养基:含有0.5%(质量分数)CaCO3和25 μg/mL博来霉素的PDA培养基。博来霉素经0.22 μm滤膜过滤,CaCO3母液经121 ℃灭菌20 min后添加至PDA培养基中。PDA培养基用115 ℃灭菌20 min。

本实验所用引物如表1所示。

1.2 仪器与设备

全自动凝胶成像仪,北京赛智创业科技有限公司;德国Eppendorf PCR仪,上海恒久医疗器械有限公司。V-5600 紫外分光光度计,南京伊若达仪器设备有限公司;ZWYR-D2403摇床,北京世纪科信科学仪器有限公司;TGL-16台式高速离心机,北京世纪科信科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 过表达pdhA质粒和柠檬酸转运蛋白cexA质粒的构建

以黑曲霉CGMCC 10142基因组为模板,利用引物对P13和P14,P15和P16,P17和P18,P23和P24分别扩增955 bp ku70左臂,651 bp gla启动子,2 090 bp柠檬酸转运蛋白cexA基因ORF区和终止子区,874 bp ku70右臂序列。以p60质粒为模板,利用引物对P21和P22(表1)扩增博来霉素抗性标记。以实验室构建保存的p44质粒为模板,p44质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切线性化的p44质粒和ku70左臂、gla启动子、cexA基因和终止子、Ble及ku70右臂通过融合PCR连接,得到的阳性转化子即为cexA过表达质粒 p94(图2)。

以黑曲霉CGMCC 10142基因组为模板,利用引物对P11和P12,P3和P4,P5和P6,P11和P12(表1)分别扩增756 bp icl左臂,1 065 bp gas启动子,1 725 bp pdhA基因ORF区和终止子区,816 bp icl右臂序列,然后通过融合PCR将Pgas-pdhA连接成大片段。以实验室构建保存的pf3质粒为模板,将pf3质粒用限制性内切酶SacⅠ和MluⅠ进行双酶切,在此之间插入融合的大片段,得到的阳性转化子即为pdhA过表达质粒pf4(图2)。

将质粒pf4和p94化转至大肠杆菌,以大肠杆菌菌液为模板验证质粒表达框全长。提取质粒送至华大公司进行基因测序比对。

1.3.2 根瘤农杆菌介导黑曲霉转化

将质粒p94和pf4分别电转化至农杆菌AGL 1感受态细胞中,并以菌液为模板PCR验证农杆菌。根据文献[14]中的方法孵育带有质粒p94和pf4农杆菌,之后将其与黑曲霉新鲜孢子置于IM固体培养基硝酸纤维膜上,25 ℃避光共培养48 h。

1.3.3 黑曲霉阳性转化子的筛选

用无菌镊子将附着菌体的硝酸纤维膜转移到无菌平板中,加入2 mL生理盐水,用无菌涂布器轻微刮下滤膜上的菌体,将200 μL菌体转移至初筛培养基上37 ℃培养60 h。用无菌牙签将初筛板长出的单菌落转接至复筛培养基37 ℃培养48 h,生长快且产孢子的菌落为可能的阳性转化子。

1.3.4 黑曲霉转化子酸圈筛选

将复筛培养基产孢较快的转化子转接至含有0.5%碳酸钙的PDA培养基,37 ℃培养72 h观察黑曲霉转化子的菌落透明圈直径与菌落直径。

1.3.5 黑曲霉转化子PCR验证

挑选上述透明圈直径比菌落径比值较大的转化子转接到PDA平板上,37 ℃培养3 d,获得足够的菌丝量后按照文献[17]的方法提取基因组,进而PCR验证。

1.3.6 CGMCC 10142与阳性转化子72 h摇瓶发酵

将出发菌株和突变菌株于PDA斜面培养基中活化产孢。收集孢子,以2×105个/mL的终浓度接种于装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,于37 ℃,300 r/min的摇床中培养72 h后进行产酸测定[18]。

1.3.7 黑曲霉转化子30 L发酵罐放大试验

将黑曲霉孢子以2×105个/mL的终浓度接种于种子罐,37 ℃培养24 h。将种子罐发酵液以10%(体积分数)的接种量转接至发酵罐。种子罐的控制条件为温度37 ℃,罐压0.1 MPa,通风率0.15 vvm,搅拌转速350 r/min;发酵罐的控制条件为温度37 ℃,罐压0.1 MPa,通风率0.18 vvm,搅拌转速450 r/min。每隔8 h取样,观察菌球形态,测柠檬酸含量、残总糖含量、糖酸转化率等[19]。

总糖含量测定:将样品过滤,取5 mL上清液置于50 mL容量瓶,加5 mL HCl(6 mol/L),在68～70 ℃水浴中加热15 min,用3 mol/L NaOH溶液中和至中性,冷却至室温后加水定容至刻度线。然后按斐林试剂法进行测定。

1.3.8 实时荧光定量PCR

1.3.8.1 总RNA的提取

RNA 提取步骤参照OMEGA生物技术公司Fungal RNA Kit试剂盒(目录号:R6840)说明书[20]。

1.3.8.2 逆转录合成cDNA

反转录PCR加样体系和反应条件见HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR说明书(目录号:R323)[19]。

1.3.8.3 实时荧光定量PCR

加样体系和反应条件见ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix说明书。

1.3.9 有机酸的HPLC检测

发酵结束后,将不同时间点的发酵液样品于12 000 r/min, 4 ℃离心10 min,取上清液稀释2倍并用0.22 μm滤膜过滤。HPLC检测使用Aminex HPX-87H有机酸柱(300 mm×7.8 mm;Bio-rad,Richmond,CA),检测器为紫外检测器(PDA,210 nm),检测条件为:流动相5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,柱温60 ℃,进样量:10 μL[20],根据文献[21]的方法计算有机酸含量。

2 结果与分析

2.1 阳性转化子PCR验证

参考方法1.3.2节,将电转化获得的带有p94和pf4质粒(图2和图3-A)的农杆菌与黑曲霉GCMCC 10142菌株进行共培养。将菌丝在初筛培养基上于37 ℃培养60 h,挑取单菌落至复筛培养基上37 ℃培养48 h,得到生长良好的36个转化子。将转化子挑至含有0.5%碳酸钙的PDA培养基,37 ℃培养72 h。经圈径比筛选获得8株比值较高的菌株分别为:94-2、94-7、94-15、94-18、94-21、P94-23、94-27、94-30(图3-B和表2),以这8株菌基因组为模板,分别以引物P13 ku70-F、P24 ku70-R和引物P9 ICL-F、P12 ICL-R PCR验证表达框(pgla-cexA-Ble)和表达框(pgas-pdhA-pyrG),同时以p94质粒和pf4质粒为模板PCR结果作为阳性对照,验证转化子是否正确。经过PCR检测cexA基因均随机插入出发菌株基因组内,再进行pdhA基因PCR检测只有94-2、94-7、94-18、94-27、94-30,5株菌具有pdhA过表达框,说明该5株菌同时过表达cexA基因和pdhA基因(图3-C),后续将这5株菌进行摇瓶发酵柠檬酸实验。

2.2 五株双过表达转化子摇瓶发酵产酸实验

将上述验证正确的5株转化子和出发菌株CGMCC 10142按照1.3.6节方法进行柠檬酸摇瓶发酵。结果如图4所示,5株菌株除94-30外,产酸均有一定程度提高,经HPLC检测94-18菌株的柠檬酸产量最高,达138.9 g/L,较出发菌株提高了7.7%,即选择94-18进行下一步30 L发酵罐实验。

2.3 94-18菌株30 L发酵罐实验

以摇瓶产酸最高的94-18菌株进行30 L罐发酵实验,设置3组平行。每8 h取发酵液测定其残总糖和柠檬酸产量,同时观察菌丝球形态。结果如图5所示,在整个发酵周期中,94-18菌株发酵液中柠檬酸含量都高于出发菌株CGMCC 10142,发酵56 h时柠檬酸积累量达到183.7 g/L,同期CGMCC 10142的柠檬酸积累量为178 g/L,94-18菌株产酸量提高了3.2%,并于60 h时结束发酵,柠檬酸产量为189.3 g/L,发酵强度为3.15 g/(L·h);CGMCC 10142在64 h结束发酵,柠檬酸产量为188.5 g/L,发酵强度2.94 g/(L·h)(图5-A和表3)。在发酵前48.5 h,94-18菌株的柠檬酸产率高于CGMCC 10142,在发酵48.5 h后,由于94-18菌株发酵液中残糖较低,产柠檬酸的速度下降(图5-B)。发酵结束时,94-18菌株与CGMCC 10142菌株的残总糖分别为0.3%和0.6%(图5-D),糖酸转化率分别达到了103.96%和103.57%。通过每8 h显微镜观察菌丝球发现,发酵0～24 h期间,2株菌的菌丝球逐渐增大,表明菌体呈快速生长状态;24 h后菌丝球直径趋于稳定,生长速度减缓且边缘伴有萌发细小菌丝,整体致密度适中,菌丝呈短粗分支密集的形态,与高产柠檬酸菌株的典型特征相符。菌丝球的生长过程如图5-C所示。94-18菌株的菌体干重平均为23.3 g/L,CGMCC 10142的菌体干重平均为23.1 g/L,无显著差异。由以上数据可见,同时过表达柠檬酸转运蛋白基因和丙酮酸脱氢酶基因的菌株94-18柠檬酸发酵周期缩短4 h,糖酸转化率和菌球生长无显著差异,最终发酵柠檬酸强度达到3.15 g/(L·h),比出发菌株有显著提升。

黑曲霉94-18在整个发酵周期内柠檬酸积累量均显著高于CGMCC 10142,发酵周期缩短4 h(图6-A和表3)。为探究2个基因共过表达对TCA循环中关键有机酸代谢通量分布的影响,通过HPLC测定2株菌在发酵24 h和48 h时TCA循环中关键有机酸的积累量。发现24 h时94-18菌株发酵液中丙酮酸积累高达207 mg/L,但48 h时发酵液中丙酮酸含量极低无法检测出;而出发菌株CGMCC 10142正好相反,24 h发酵液中丙酮酸含量极低,48 h发酵液出现28.45 mg/L的丙酮酸积累(图6-B)。在发酵24 h时,94-18菌株草酰乙酸积累量为86 mg/L,略低于CGMCC 10142菌株的97 mg/L;而48 h时,94-18菌株草酰乙酸积累量为156 mg/L,显著高于CGMCC 10142菌株的72 mg/L(图6-C)。94-18菌株在发酵期间,苹果酸和富马酸积累量始终低于CGMCC 10142菌株(图6-D和图6-E)。

2.4 过表达相关基因实时荧光定量PCR分析

分别取出发菌株CGMCC 10142和94-18菌株在30 L发酵罐中发酵24 h和48 h的菌丝,进行实时荧光定量PCR检测。结果如图7所示,在不同的时间点,94-18菌株pdhA和cexA表达量均显著高于出发菌株。在24 h时,94-18菌株的2个基因表达量较出发菌株分别上调了25倍和13倍;在48 h时,94-18菌株的两基因表达量较出发菌株分别上调了63倍和37倍。说明pdhA和cexA基因的过表达使转化子中该基因的表达水平显著高于出发菌株。

3 讨论

目前,提高黑曲霉生产柠檬酸的研究中,大多数集中于单一基因的改造,如STEIGER等[5]敲除黑曲霉中的cexA,完全消除了柠檬酸的分泌。张香香等[7]通过构建不同启动子的过表达pdhA质粒,使突变菌株的产酸量相较于出发菌株分别提高了5.17%和4.01%。因此,本研究以黑曲霉CGMCC 10142为出发菌株,通过基因改造工程共过表达pdhA和cexA ,获得柠檬酸高产菌株黑曲霉94-18,其30 L发酵罐60 h柠檬酸产量达到189.3 g/L,发酵周期缩短了4 h,最终发酵柠檬酸强度达到3.15 g/(L·h)比出发菌株有显著提升。

通过HPLC测定TCA循环中关键有机酸的积累量,结果显示94-18菌株发酵24 h丙酮酸积累达到207 mg/L,而CGMCC 10142在24 h几乎没有丙酮酸积累,表明94-18菌株0～24 h糖分解代谢速度增加,使丙酮酸显著高于出发菌株,同时从发酵过程残总糖快速下降趋势线可见,过表达cexA基因后94-18菌株EMP代谢流加速使胞外残糖浓度急速降低。同时由于pdhA和cexA基因共同在24、48 h获得高效表达,在增强了糖酵解途径的同时,加速丙酮酸下游柠檬酸合成代谢通量,为柠檬酸的持续高效合成奠定了物质基础。94-18菌株过表达cexA,显著增强柠檬酸主动转运至胞外的能力,直接降低了胞内柠檬酸浓度,有效解除了其对关键合成酶(如柠檬酸合成酶)的反馈抑制作用,使柠檬酸合成反应得以持续高效进行。而出发菌株CGMCC 10142丙酮酸转化为乙酰CoA的效率较低,胞内柠檬酸积累过快而受到一定反馈抑制,致使胞外柠檬酸积累量始终低于94-18菌株。对24 h和48 h发酵液中苹果酸和富马酸检测,发现94-18菌株发酵液中这2种酸的浓度均明显低于出发菌株,而未检测到琥珀酸和α-酮戊二酸的色谱峰,可能是因为94-18菌株中pdhA和cexA的高效表达,协同调控使碳代谢流主要进入柠檬酸的合成,最大限度减少代谢分支(如苹果酸和富马酸合成)的碳渗漏。94-18菌株48 h发酵液中几乎检测不到丙酮酸含量,CGMCC 10142菌株48 h则检测到28.45 mg/L丙酮酸积累,表明94-18菌株过表达pdhA基因,使PDH活性增加,将丙酮酸转化为乙酰CoA,为柠檬酸合成提供大量前体物质,从而实现柠檬酸高效合成。此外94-18菌株过表达cexA将柠檬酸持续高效转运至胞外,有效解除反馈抑制使糖酵解高速运转,实现了丙酮酸节点生成与消耗的高效动态平衡。相反,CGMCC 10142菌株的pdhA基因转录水平较低,限制丙酮酸主要氧化通路;同时胞内高浓度的柠檬酸强烈抑制糖酵解代谢,减少丙酮酸生成,使柠檬酸的合成速度减慢;使其丙酮酸生成速率因糖酵解被抑制而降低,但其更低的消耗能力仍导致丙酮酸积累。

在本研究中,黑曲霉94-18菌株同时过表达cexA和pdhA,一方面增强柠檬酸转运至胞外的能力,另一方面提升糖代谢效率,加速丙酮酸有氧分解,增加柠檬酸合成前体乙酰CoA的积累,进而显著提升黑曲霉柠檬酸合成效率。改造后菌株的发酵周期缩短4 h,柠檬酸产量达到189.3 g/L,发酵柠檬酸强度达到3.15 g/(L·h),均较出发菌株有显著提升。

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