灵芝(Ganoderma lucidum)是一种重要的食药用真菌,兼具免疫调节、抗炎及益生元等多种药理活性[1-3],其主要活性成分包括多糖、三萜及甾体类化合物[4]。其中,灵芝多糖(G. lucidum polysaccharides,GLPs)作为一种真菌多糖因其结构多样性和广泛的生物活性,目前处于功能食品和医疗应用研究和开发的前沿[5-6]。GLPs是由多种单糖组成的杂多糖,主要包含β-1,3、β-1,6、α-1,3及α-1,4等糖苷键,其生物合成过程分为3个阶段:糖供体的合成、糖链的延伸与修饰和多糖的输出与装配[7]。在糖供体合成阶段,磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase,PGM)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGP)的过表达可促进UDP-葡萄糖的生成,提升葡萄糖含量;而磷酸甘露糖异构酶(phosphomannomutase,PMM)、磷酸甘露糖变位酶(phosphomannose isomerase,PMI)及GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)则参与GDP-甘露糖的合成,影响GLPs的甘露糖组成[8]。这些关键酶不仅能够引导碳流向糖供体合成途径,同时也决定了GLPs的单糖组成[9-10]。
在糖链延伸过程中,糖基转移酶(glycosyltransferases,GTs)通过特定糖苷键将糖供体转移至受体分子,形成结构明确的多糖链[11]。已有研究证明糖基转移酶对多糖合成的影响,例如:在Pleurotus ostreatus[9]与Grifola frondosa[10]中,沉默β-1,3-葡糖基转移酶基因可显著抑制菌丝生长和影响多糖合成;而在灵芝中,α-葡萄糖基转移酶的过表达在不影响细胞壁几丁质含量的情况下,可降低细胞壁中的β-1,3-葡聚糖含量,进而影响菌丝体形态[12];此外,β-1,3-葡萄糖基转移酶基因gl20535及其同工酶gl24465基因的过表达不仅显著提升了多糖产量并改变菌丝体多糖(mycelial cellular polysaccharide,MPS)与胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)的单糖组成,还关联调控着多个糖苷水解酶基因[13]。这些研究也为食药用真菌的多糖合成途径提供了理论支持。
目前,针对多糖的合成过程,已有多种策略研究灵芝MPS和EPS的产量与组成变化,包括构建高产菌株[14]、优化发酵条件[15]及添加诱导剂[16]等。本研究团队前期基于比较基因组学技术和灵芝液体发酵转录组分析筛选出与GLPs密切相关的5条糖基转移酶基因[17],其中gl22535在前期研究中表现出显著的转录水平变化,例如过表达灵芝α-1,3-葡萄糖基转移酶后MPS与EPS含量显著上升,gl22535的相对转录水平上调86.61%,推测gl22535在灵芝生长及多糖合成中具有关键作用[12]。阐明该酶的作用机制将为系统解析GLPs合成网络提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 菌株、质粒与培养基
本论文所用灵芝菌株(G. lucidum)CGMCC 5.26、大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及pMD19-T载体由本实验室保藏,所有灵芝沉默与过表达重组质粒均由本实验室自行构建,具体方法参考CHEN等[12]。
LB培养基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10;固体培养基中另外添加琼脂18。
灵芝种子/发酵培养基(g/L):无水葡萄糖20,蛋白胨5,无氨基酵母氮源(yeast nitrogen base,YNB)5,KH2PO4 3,MgSO4·7H2O 2。
CYM 培养基(g/L):麦芽糖10,无水葡萄糖20,酵母粉20,蛋白胨2,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO4 4.6。
CYM复生培养基:CYM培养基的基础上加入0.6 mol/L甘露醇。
1.1.2 主要试剂和仪器
萎锈灵、YNB、氨苄青霉素钠,上海源叶生物技术有限公司;聚乙二醇4000、PDA培养基,上海生工生物工程股份有限公司;2×Taq PCR Master Mix、2×Phanta Flash Master Mix,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;2×Ezmax®Ultra Universal CloneMix,上海吐露港生物科技有限公司。
原生质体制备过程相关试剂:亚精胺(50 mmol/L):7.26 g/L;肝素钠(50 mg/mL):50 mg溶于1 mL超纯水;STC buffer:0.6 mol/L山梨醇,10 mmol/L Tris-HCl(pH值为7.0)、10 mmol/L CaCl2;PTC buffer:550 g/L聚乙二醇4000、10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、10 mmol/L CaCl2。
DIONIEX ICS-5000离子色谱系统、Heraeus Pico17离心机,赛默飞世尔科技公司;S1000型PCR仪、荧光定量PCR仪,美国Bio-Rad公司;TCS SP8 STED激光共聚焦显微镜,徕卡微系统股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 生物信息学蛋白质在线分析工具
本研究所用生物信息学在线分析工具见表1。
表1 本研究主要使用的生物信息在线分析工具
Table 1 Principal online bioinformatics analysis tools utilized in this study
名称网址功能及原理Deep TMHMMhttp://services.healthtech.dtu.dk/services/DeepTMHMM-1.0/基于隐马尔可夫模型,识别预测蛋白质氨基酸序列中的跨膜区域CAZyhttps://www.cazy.org/分类和注释与碳水化合物相关的酶所属家族和该家族已有研究情况ExPASyProtParamhttp://web.expasy.org/protparam/预测蛋白质基本理化性质(等电点、脂肪系数等)MEGA12本地软件进化树绘制DTU Health Techhttps://services.healthtech.dtu.dk/预测蛋白翻译后修饰情况(糖基化位点)SignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP预测序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点
1.2.2 灵芝糖基转移酶基因gl22535的扩增
根据FastPure® Universal Plant Total RNA Isolation Kit使用说明提取灵芝的总RNA,并以此为模板利用HiScript® Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录以获取灵芝的总cDNA,设计特异性引物(表2),扩增得到灵芝糖基转移酶全长基因gl22535。
表2 目的基因验证所用特异性引物
Table 2 Specific primers designed for validation of the target gene
引物名称序列oexg-22535-F1GGCCCCCTTCTCACAGGTACGCGTCCCGGAGTGTACATTGAGTTCCAoexg-22535-R2CTCTCAGACCCGCTCATGCTAGCTTAGAGTTCAAGGTGCTTGACGGGGiudpg-22535-F1CTTCATCCCCCTCTCAACACGCGTACTAGCGACTCGACGCCTATCGCGiudpg-22535-R1CGCGCACAGGCGGAGAGGTACCGTTGATCTCAGCCTGCCCATCGCigt24-22535-F1CTTCATCCCCCTCTCAACACGCGTTGGGCGTACAAGATCTTGTTCCTCGigt24-22535-R1GCGCACAGGCGGAGAGGTACCGCGCAGCATGTCTCCGGCCGCG
1.2.3 重组质粒的构建及转化
构建过表达质粒骨架pSdhB-gpd和双启动子沉默质粒骨架pSdhB-35S-gpd,扩增所得灵芝糖基转移酶基因gl22535,通过同源重组的方式将其连接至Mlu I和Nhe I双酶切位点之间,构建过表达质粒Oexg-gl22535与N端带有增强型绿色荧光蛋白eGFP标签的质粒Oexg-egfp-gl22535。以NCBI及InterPro对gl22535功能域的分析结果,分别扩增其2个结构域片段127AA-261AA(UDP_g)与338AA-438AA(GT24),以同源重组的方式构建沉默质粒igl22535-udpg与igl22535-gt24。
从PDA平板上切取约1 cm2灵芝菌丝块,切碎后接种于种子培养液,30 ℃、160 r/min培养9 d。加入玻璃珠,经磁力搅拌打散,取2 mL接种于150 mL灵芝液体发酵培养基,30 ℃静置培养4 d。收集菌丝体,使用分子筛过滤并以0.6 mol/L甘露醇冲洗,收集菌丝于无菌离心管中。加入20 g/L溶壁酶溶液(0.6 mol/L甘露醇溶解),30 ℃、160 r/min酶解3.5 h。滤除未完全酶解的菌丝后,于4 ℃、3 500×g离心10 min,弃上清液。沉淀以1 mL预冷STC缓冲液重悬并重复2次。随后加入新配制的SSTC缓冲液[V(STC)∶V(亚精胺)∶V(肝素钠)=160∶5∶2]轻轻重悬。取20 μL原生质体镜检,余量用于后续转化实验。
取10 μg质粒与新鲜的原生质体混合,冰浴10 min,加入200 μL聚乙二醇缓冲液混匀,再次冰浴10 min,上述步骤重复1次。随后加入600 μL聚乙二醇缓冲液,于28 ℃金属浴中孵育30 min。室温下5 000×g离心10 min,弃上清液后加入1 mL CYM液体培养基混合,静置培养12 h。再于28 ℃、4 500×g离心10 min,弃上清液,用CYM液体培养基轻轻重悬沉淀,并涂布于CYM平板。28 ℃培养48 h后,覆盖含4 μg/mL萎锈灵的低熔点琼脂进行筛选。以转入pSdhB空载质粒的原生质体作为对照(control)。
将上层板长出的转化子转接于含有4 μg/mL萎锈灵的CYM筛选平板中,传代3次后从平板上刮取适量菌丝体提取基因组,使用特异性引物进行PCR验证,电泳条带正确的PCR产物送往上海生工公司进行测序,测序正确的菌株用于后续实验。
1.2.4 糖基转移酶GL22535的荧光定位
获得带有荧光标记的过表达转化子后,将转化子转接到含有萎锈灵抗性的CYM培养基中,在28 ℃下培养3～4 d后,插入数个载玻片,待菌丝长至载玻片平面后,采用共聚焦激光显微镜进行荧光观察,计算分析平均荧光强度使用Image J v1.8.0(NIH, Bethesda, MD, USA)。
1.2.5 转录水平分析
将新鲜发酵菌丝经液氮速冻研磨后,采用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit 提取总RNA。依据试剂盒说明,使用HiScript® Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA。实时荧光定量PCR采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行,内参基因为18S rRNA,定量分析采用2-ΔΔCt法。每份样品均进行3次生物学重复及技术重复以保证结果可靠性。
1.2.6 发酵还原糖、生物量及多糖测定
收集灵芝发酵液,5 000 ×g离心10 min。上清液用于残糖量与EPS分析;沉淀以无菌水洗涤3次后冻干称重以计算菌体生物量。取上清液,按适当比例稀释,用DNS法测定残糖含量[18]。提取EPS,将上清液与4倍体积无水乙醇混合,4 ℃静置过夜,8 000×g离心5 min,弃上清液;沉淀以75%(体积分数)乙醇洗涤后吹干,用去离子水复溶,并用苯酚-硫酸法测定多糖含量[19]。制备MPS,称取冻干菌丝体,加入去离子水,于沸水浴中提取2.5 h,8 000×g离心5 min,取上清液经醇沉、洗涤、复溶后,使用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
1.2.7 单糖组成测定
称取6 mg MPS或EPS,加入12 mol/L硫酸600 μL,于37 ℃水解30 min,随后加入3 mL去离子水并沸水浴2 h。水解液经1 mol/L NaOH溶液中和至pH值为7,8 000×g离心10 min,重复2次。取200 μL上清液经0.22 μm水系滤膜过滤,置于液相小瓶内衬管中,进行离子色谱检测。以不同浓度的单糖混合标准品绘制标准曲线,依据保留时间定性单糖种类,并根据标准曲线计算其含量[12]。
1.2.8 统计分析
实验数据采用GraphPad Prism 10.1.1与Orgin Pro 2025软件进行单因素方差分析,然后进行Tukey检验,P≤0.05为差异显著,P≤0.01为差异非常显著。
2 结果与讨论
2.1 糖基转移酶基因gl22535的扩增与重组菌株的构建
灵芝中糖基转移酶基因gl22535序列全长为1 653 bp(图1-a),共编码551个氨基酸残基。生物信息学预测显示该蛋白分子质量为62.48 kDa,理论等电点(isoelectric point,pI)为6.36。该蛋白被鉴定为一种中性亲水蛋白,无跨膜结构与信号肽。保守结构域分析识别gl22535基因主要有2个核心结构域:葡萄糖糖基转移酶结构域(UDP-g_GGTase)和糖基转移酶GT24家族特征结构域(GLuco_transf_24)。此外,系统发育树显示gl22535与污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)的葡萄糖基转移酶基因具有高度序列相似性。
提取灵芝cDNA并以此为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶GL22535的全长基因,并构建过表达质粒oexg-egfp-gl22535、oexg-gl22535和针对2个结构域的沉默质粒(igl22535-gt24与igl22535-udpg),结果如图1-b、图1-c所示,oexg-egfp-gl22535与oexg-gl22535的PCR产物在2 397 bp与1 653 bp左右有清晰条带,沉默质粒igl22535-gt24与igl22535-udpg分别对应的402 bp与300 bp区域有清晰条带,这与目标基因片段的大小相符合。选择条带一致的菌落送样测序,结果显示与GenBank中报告的氨基酸序列完全吻合,进一步表明重组质粒构建成功。经PEG法转化入灵芝原生质体细胞获取重组菌株,在含萎锈灵的抗性平板上传代3次后,仍能稳定生长且菌落PCR结果正确的菌株,经测序验证无误后用于后续转录水平分析。
a-NCBI保守结构域数据库比对结果;b-oexg-egfp-gl22535、oexg-gl22535目的片段电泳条带;c-igl22535-udpg与igl22535-gt24目的片段电泳条带
图1 gl22535的生物信息学分析与PCR扩增产物分析
Fig.1 Bioinformatics analysis and PCR product analysis of gl22535
2.2 重组菌株的转录水平分析
随机选择15个转化子进行液体发酵培养,分别于第4、6天收集新鲜菌球并提取灵芝RNA。采用RT-qPCR对野生型(wild type,WT)、对照组与转化菌株(oe-gl22535-n、igl22535-udpg-n、igl22535-gt24-n;n=1、2、3、4、5)中gl22535的转录水平进行比较分析,结果如图2所示。其中,过表达菌株oe-gl22535-2与oe-gl22535-3的过表达效果最显著,在第4、6天相对转录水平提高了3～8倍。而沉默菌株igl22535-udpg-3、igl22535-udpg-5与igl22535-gt24-2、igl22535-gt24-3的沉默效果最为明显,转录水平均下调50%以上。因此后续实验选择该6株重组菌株进行研究。
a-过表达菌株;b-igl22535-udpg沉默菌株;c-igl22535-gt24沉默菌株
图2 重组菌株gl22535基因的相对转录水平
Fig.2 Relative expression level of the gl22535 gene in recombinant strains
注:结果以“平均值±标准差”表示,*和**表示与WT相比,在5%和1%水平上存在显著差异(下同)。
图3 GL22535在灵芝菌丝体细胞中的荧光定位
Fig.3 Fluorescence localization of GL22535 in G.lucidum cells
2.3 糖基转移酶GL22535的荧光定位分析
为研究GL22535在灵芝中的亚细胞定位,通过构建携带oexg-egfp-gl22535过表达质粒的重组菌株egfp-GL22535,经激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况(图3)。与野生型菌株相比,绿色荧光信号清晰可见,证明oexg-egfp-gl22535在灵芝中成功表达。该荧光主要沿菌丝体的丝状结构分布,且非弥散式整体荧光,局限在菌丝体内部,部分位置呈现团块状或点状荧光。结合gl22535编码蛋白无信号肽及跨膜结构的预测结果,很可能为胞质侧糖基转移酶。
2.4 重组菌株的发酵培养与生长情况
将野生型菌株与重组菌株转接至PDA平板上观察gl22535对灵芝生长表型的影响,结果如图4所示。平板培养过程中,野生型菌株呈放射状生长,相比之下,过表达菌株整体更紧实;而沉默菌株菌丝更蓬松,igl22535-gt24沉默株尤为明显;生长速率方面,野生型菌株的平均生长速率为(1.067±0.021) cm/d,2个过表达菌株则分别降低至(0.382±0.039) cm/d与(0.396±0.025) cm/d,沉默菌株igl22535-udpg降低至(0.764±0.024) cm/d与(0.722±0.017) cm/d,沉默菌株igl22535-gt24降低至(0.287±0.008) cm/d与(0.338±0.009) cm/d。
a-在PDA培养基上培养的WT、过表达和沉默菌株的菌落形态;b-过表达菌株和沉默菌株菌落直径
图4 gl22535对灵芝菌丝生长的影响
Fig.4 Effect of gl22535 on the growth of G.lucidum mycelium
图5 野生菌株与重组菌株菌球形态
Fig.5 Morphology of mycelial pellets in wild-type and recombinant strains
图6 野生菌株与重组菌株菌球直径分布情况
Fig.6 Size distribution of mycelial pellets in wild-type and recombinant strains
液体发酵培养过程中,灵芝野生型与重组菌株发酵6 d后的菌球形态,如图5所示。在发酵过程中,过表达菌株形成的菌球明显大于野生型菌株,且表面明显粗糙;沉默菌株igl22535-udpg菌球大小变化不明显,但菌球表面粗糙程度降低;沉默菌株igl22535-gt24表面菌丝丰富,与其摇瓶发酵过程中生长旺盛相关,研究表明参与多糖合成的糖基转移酶不仅会影响糖链的延伸,也会影响菌体形态[20]。各取3个平行样本并随机选定区域取点80个,共计240个,利用Image Pro Plus软件(v7.0)进行分析统计,根据费雷特直径大小[21]将灵芝菌球分为S(0.1～0.5 mm)、M(0.5～1.5 mm)、L(1.5～2.5 mm)、XL(>2.5 mm)四类,结果如图6所示,过表达菌株中XL菌球有明显增多,与之相反,沉默菌株igl22535-gt24无XL菌球,但是S与M尺寸的菌球数量占比明显上升。丝状真菌发酵中,菌体形态是最直观的工艺参数之一,且对其生理生化特征及发酵效率具有重要影响,灵芝形态的转变能够显著改变多糖的产量[22-23]。
2.5 gl22535对灵芝发酵水平和多糖产量的影响
对野生型和重组菌株进行液体发酵,测定了其在发酵过程中的生物量与残糖量变化。生物量检测结果显示,野生型菌株和沉默菌株在第9天达到最大生物量,过表达菌株的生物量峰值较野生型菌株显著前移24 h(图7-a)。在菌体生长方面,oe-gl22535的最大生物量为6.46 g/L,较野生株下降23.46%;而沉默株igl22535-udpg与igl22535-gt24最大生物量分别为8.66、9.01 g/L,较野生株提高了2.61%和6.75%。
与此相反,gl22535过表达后,碳源消耗速率显著提升;而gl22535沉默后,碳源消耗速率明显下降,且沉默菌株igl22535-gt24残糖量高于沉默菌株igl22535-udpg,整体变化趋势与灵芝野生型菌株一致(图7-b)。gl22535过表达后碳源消耗速率显著加快,但细胞生物量并未相应增加,反呈下降趋势。这一现象表明部分碳流未被有效用于细胞生长相关的生物合成过程,而是可能被重新分配至其他代谢途径。结合GL22535作为糖基转移酶在多糖合成中的潜在作用,需要探究其GLPs含量变化以验证碳流是否被引导至多糖合成途径。
a-生物量;b-残糖量
图7 gl22535对灵芝生物量和残糖量的影响
Fig.7 Effect of gl22535 on biomass and residual sugar of G.lucidum
对MPS与EPS含量的检测结果显示,MPS产量方面(图8-a),gl22535过表达菌株oe-gl22535-2与oe-gl22535-3较野生株提升30.18%、31.89%;而沉默菌株igl22535-udpg-3、igl22535-udpg-5、igl22535-gt24-2和igl22535-gt24-3较野生株分别降低4.51%、1.25%、15.92%和17.00%。在EPS产量方面(图8-b),过表达菌株的最大EPS产量为1.22 g/L,是WT的1.54倍;沉默菌株igl22535-udpg与igl22535-gt24的最大EPS产量为0.91 g/L和0.58 g/L,较野生型菌株分别提升15.19%与降低26.58%。总体上过表达gl22535基因显著提高了MPS与EPS含量;而gl22535基因的沉默出现2种不同的情况。
结合gl22535重组菌株的生物量和残糖量变化,过表达gl22535会减少生物量、加速碳源消耗并提高MPS与EPS产量,推测gl22535的过表达致使代谢流向多糖合成;沉默菌株igl22535-udpg在提高生物量的情况下,略微降低碳源消耗速率,但MPS与EPS含量总体变化不明显,推测更多碳流优先用于生物量累积而非多糖合成,且多糖含量可能有其他回补途径,导致总量保持相对一致;沉默菌株igl22535-gt24的结果与过表达完全相反,推测gl22535基因在维持灵芝糖基转移酶功能和GLPs合成中发挥重要作用。
a-菌丝体多糖含量;b-胞外多糖含量
图8 gl22535对灵芝菌丝体多糖与胞外多糖产量的影响
Fig.8 Effect of gl22535 on G.lucidum mycelial and extracellular polysaccharide production
2.6 gl22535对灵芝菌丝体及多糖组成的影响
分别取各组EPS达到峰值的发酵天数进行梯度醇沉,分为25%乙醇沉淀(A)、50%乙醇沉淀(B)和75%乙醇沉淀(C)3个组分,理论上不同组分与分子质量大小的关系为A>B>C[24-25]。野生株和重组菌株在不同乙醇浓度下收集到的EPS具体对比情况如图9所示。野生型灵芝EPS的A、B、C三组分浓度占比分别为72%、20%和8%,oe-gl22535-2与oe-gl22535-3过表达菌株分别为72%、20%、8%和73%、18%、9%;沉默菌株igl22535-udpg-3与igl22535-udpg-5各组分比例为71%、20%、9%和70%、18%、12%,小分子质量多糖组分占比稍有上升;沉默菌株igl22535-gt24-2与igl22535-gt24-3各组分比例为73%、19%、8%和74%、17%、9%,差异均不显著。说明该基因对EPS分子质量分布方面影响较小。
图9 灵芝胞外多糖梯度醇沉结果
Fig.9 Results of graded ethanol precipitation of extracellular polysaccharides from G.lucidum
为进一步探究糖基转移酶GL22535对GLPs合成的影响,分析了灵芝MPS与EPS的单糖组成差异,GLPs的单糖差异主要体现在组成种类和比例分布方面[7]。灵芝MPS主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成,比例为7.3%、90.0%和2.7%;而EPS主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成,比例分别为7.4%、87.1%、2.1%和3.4%,结果如图10-a所示。与野生株相比,过表达菌株MPS的半乳糖和甘露糖比例最多可提高9.2%和11.0%,葡萄糖占比则可降低至71.3%;沉默菌株igl22535-udpg半乳糖和甘露糖比例最多可降低至4.6%、1.5%,葡萄糖占比最多提高至94.1%,igl22535-gt24中半乳糖和甘露糖比例分别降低至2.1%和1.8%,葡萄糖占比至多提高至96.8%。gl22535基因的过表达使得MPS葡萄糖含量下降,半乳糖与甘露糖含量上升,沉默菌株则情况相反。
EPS方面(图10-b),过表达菌株的半乳糖与木糖比例可降低至1.8%和2.5%,甘露糖小幅提升至4.1%,葡萄糖比例最多可提高至91.9%;沉默菌株igl22535-udpg半乳糖、木糖和甘露糖比例最多可提升至21.9%、14.5%和12.9%,葡萄糖比例降低至58.0%;igl22535-gt24的半乳糖和甘露糖比例可大幅提升至25.0%和38.0%,葡萄糖含量可大幅降低至37.1%,木糖含量变化不明显。gl22535基因的过表达使得EPS葡萄糖含量上升,半乳糖、木糖与甘露糖比例下降;沉默菌株情况大致相反,这一结果说明糖基转移酶GL22535可能参与调控多糖链中不同单糖比例的分布,进而影响GLPs的结构复杂性。
a-菌丝体多糖;b-胞外多糖
图10 gl22535对灵芝菌丝体多糖和胞外多糖的单糖组成的影响
Fig.10 Effect of gl22535 on monosaccharide composition of G.lucidum MPS and EPS
综合上述分析,糖基转移酶GL22535及其功能结构域不仅影响多糖产量,还调控其单糖组成。过表达gl22535可促进MPS中半乳糖和甘露糖的积累,降低葡萄糖比例,同时降低EPS中半乳糖与木糖的比例,提高EPS的葡萄糖与甘露糖比例;而沉默菌株则普遍导致MPS葡萄糖升高、半乳糖与甘露糖下降,并在EPS中大致表现出相反趋势,其中沉默菌株igl22535-gt24导致葡萄糖占比大幅降低,而甘露糖与半乳糖占比显著提升。
2.7 灵芝糖供体合成酶的转录水平分析
在MPS产量峰值前1天(图11-a),gl22535过表达菌株中pmm2、uge1/2与gmp的转录水平显著上调,分别为野生型的7.78、9.92/4.66、7.67倍;而沉默菌株igl22535-udpg中,除pgi、pmi1与ugp转录水平略升高外,其余糖供体合成相关基因多呈现下调趋势。相比之下,沉默菌株igl22535-gt24的整体下调趋势更为明显。这些结果表明,gl22535的过表达可能促进碳流向葡萄糖代谢途径,增加UDP-葡萄糖的合成,同时提高GDP-甘露糖与GDP-半乳糖的活性,从而增强其在MPS合成中的利用。
在EPS产量峰值前1天(图11-b),gl22535过表达菌株中糖供体合成相关基因的整体表达水平显著下降,其中pgm、ugp与uge1的转录水平较野生型下调超过70%。相反,沉默菌株中这些基因普遍上调,尤其是pmi1/2、gmp与uge1/2的转录水平升幅最为明显,其中pgi与uge1的相对表达量最高可分别为野生型的11.88、29.04倍。这表明,在EPS形成阶段,gl22535的沉默可能促进碳流由葡萄糖代谢途径转向半乳糖、甘露糖及木糖的合成方向,导致EPS中葡萄糖比例降低、其他单糖比例升高。
根据糖供体合成途径(图11-c),葡萄糖-6-磷酸可经pgi或pgm作用下分别流向GDP-甘露糖与UDP-半乳糖的合成,同时,UDP-半乳糖与UDP-葡萄糖可在uge1/2作用下相互转变[14,26]。gl22535的过表达与沉默可能伴随着糖供体合成酶的上调与下调变化,且MPS与EPS峰值前后pgi、pgm、ugp、uge、gpm的转录水平具有时序性变化,致使葡萄糖流向不同的核苷酸糖前体,造成多糖中单糖组成的差异。
a-MPS发酵第6天重组菌株糖供体相关酶转录水平;b-EPS发酵第7天重组菌株糖供体相关酶转录水平;c-核苷酸糖前体合成途径
图11 重组菌株糖供体合成酶基因的转录水平分析
Fig.11 Analysis of relative transcriptional levels of sugar donor synthase genes in recombinant strains
3 结论
本研究对灵芝gl22535基因进行了功能验证。生物信息学分析和细胞荧光定位结果表明,gl22535编码蛋白为GT24家族葡萄糖基转移酶,并定位于胞质中。gl22535过表达菌株在生长上较为缓慢,菌球直径增大,碳源消耗加快,同时MPS与EPS产量显著增加;而沉默菌株ig122535-gt24则表现出生长旺盛、生物量增大,且MPS与EPS产量降低的现象。gl22535的表达水平显著影响了MPS与EPS的葡萄糖、半乳糖、甘露糖及木糖的比例,但对多糖的分子质量影响不大。推测gl22535可能通过调控上游糖供体合成途径相关基因(如pgi、pgm、ugp、uge、gpm)的表达,影响核苷酸糖前体的分配,从而改变多糖的单糖组成。研究结果不仅能深化对GLPs合成及其调控途径的理解,也为系统阐明灵芝及食药用真菌糖基转移酶的功能机制及其在代谢调控中的作用提供重要的理论支撑,对推动真菌多糖合成机制研究具有重要价值。未来研究可采用CRISPR-Cas9等基因敲除技术,对gl22535基因进行精准编辑,或构建gl22535与其他GLPs合成相关基因的共表达菌株,从而深入揭示其在灵芝生长及多糖合成过程中的功能与调控机制。
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