酱香型白酒是中国传统蒸馏酒的代表之一,其独特风味的形成,依赖于酿造过程中功能微生物的协同作用及代谢产物,酱香大曲作为核心发酵剂,其质量对酱香型白酒的风味和产量具有显著贡献[1]。酱香大曲的微生物主要来源为母曲、原料、生产环境及设施等,其中母曲富含多种功能微生物(如丝衣霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属等)及酶类,在曲坯整个发酵过程中对微生物群落的演替、风味物质的产生以及大曲的稳定性均起到关键作用[2]。研究表明,来源于母曲的细菌菌属(如枝芽孢杆菌属、克罗彭斯特菌属等)及真菌菌属(如曲霉菌属、丝衣霉菌属等)与吡嗪类、酯类等风味物质呈正相关[3],有助于酱香大曲及酱香型白酒典型风味的形成。
在酱香大曲生产过程中,由于堆积位置、温度、水分、微生物代谢活动等因素的差异,会形成黑曲(black Daqu,BQ)、黄曲(yellow Daqu,YQ)和白曲(white Daqu,WQ)3种不同类型,通常,将优质酱香大曲选作下一轮次的母曲。研究显示,这3种类型的酱香大曲在微生物多样性和功能方面均表现出显著的差异[4]。具体而言,YQ和BQ中总挥发性物质及吡嗪类物质的相对含量远高于WQ[5],吡嗪类物质是酱香型白酒的重要组分[6];且WQ所酿酒体较为单薄,BQ与YQ则能赋予酒体突出的酱香、曲香并增强其醇厚感[7]。目前,针对酱香大曲制曲工艺关键控制点的研究,主要聚焦于原料的选择[8]与粉碎度、母曲添加量、拌合水分[9]等参数,但不同母曲(如BQ、YQ)对酱香大曲发酵过程的影响尚未得到系统的研究。
非靶向代谢组学是一种通过LC-MS或核磁共振等技术全面检测样本中代谢物谱系的分析方法,是解析复杂生物体系代谢信息的常用策略,该技术已成功应用于探究大曲的代谢特征及其变化规律。例如:揭示不同颜色酱香大曲(BQ、YQ及WQ)的代谢物组成差异[10],分析季节因素对酱香大曲贮藏期间代谢的动态影响[11],以及解析中温、低温与酱香大曲之间代谢功能差异及其风味形成的潜在机理[12]等。
基于上述研究背景与技术可行性,本研究选用同批次生产的优质BQ及YQ作为母曲,采用非靶向代谢组学技术,系统解析代谢物组成差异,旨在揭示母曲类型对酱香大曲制曲过程中代谢的动态影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
传统酱香大曲,四川省泸州市某白酒企业的制曲车间;甲醇、乙腈、甲酸、纯水、2-丙醇,均为色谱纯,美国Fisher Chemical公司;L-2-氯苯丙氨酸(纯度≥98%),瑞士Adamas-beta公司。
1.2 仪器与设备
UHPLC-Q Exactive HF-X超高效液相色谱-傅里叶变换质谱,赛默飞公司;HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),美国Waters公司;Wonbio-96C型多样品冷冻研磨仪,上海万柏生物科技有限公司;SBL-10DT型超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;Centrifuge 5430R型高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;MS105DU型电子天平,瑞士梅特勒公司。
1.3 实验方法
1.3.1 制曲工艺
分别选用同批次生产的BQ和YQ作为母曲,BQ要求呈棕黑色、曲香明显、略有焦味、皮薄、曲心呈菊花状,YQ要求呈金黄色或棕黄色、曲香浓郁、皮厚、曲心呈菊花状,按传统制曲的生产工艺制备酱香大曲。母曲选择标准及酱香大曲制曲工艺参考书籍《中国酒曲制作技艺研究与应用》[13]和T/GZRHJX 006—2019《仁怀产区酱香大曲生产技术规范》。
1.3.2 取样
分别采集以不同母曲(BQ、YQ)制曲时的过程样品,取样时间点为:发酵第0天(安曲),第9天(一次翻曲)、第21天(二次翻曲)、第40天(拆曲),取样后将曲坯粉碎并混匀,每份样品设3个重复。样品编号遵循“BQ/YQ_发酵时长”的规则,如:BQ_0 d代表母曲为BQ,发酵第0天的安曲样品。
1.3.3 非靶向代谢组学检测
样本前处理:取50 mg固体样本于2 mL离心管中,内置一颗直径6 mm的研磨珠。加入400 μL含0.02 mg/mL内标(L-2-氯苯丙氨酸)的提取液[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]进行代谢产物提取。样本溶液于组织研磨仪中研磨6 min(-10 ℃,50 Hz),后低温超声波提取30 min(5 ℃,40 kHz)。样品于-20 ℃静置30 min后,离心15 min(4 ℃,13 000×g),移取上清液至带内插管的进样小瓶中上机分析。
质控样本:取等体积的所有样本代谢物混合制备成质控样本,在仪器分析过程中,每5～15个样本中插入1个质控样本,以考察整个分析过程的重复性。
GC条件:流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸),流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸),以上均为体积分数,进样量3 μL,色谱柱为HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),流速0.40 mL/min,柱温40 ℃。
MS条件:样品质谱信号采集采用正、负离子扫描模式,采用DDA模式采集数据,具体参数:质量扫描范围70～1 050 m/z,鞘气流速50 psi,辅助气流速13 psi,辅助气加热温度425 ℃,正离子模式喷雾电压3 500 V,负离子模式喷雾电压-3 500 V,离子传输管温度325 ℃,归一化的碰撞能为20 V-40 V-60 V的循环碰撞能,一级质谱分辨率60 000,二级质谱分辨率7 500。
1.3.4 数据分析
LC-MS原始数据使用代谢组学分析软件Progenesis QI进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正和峰对齐等处理,将MS和MSMS质谱信息与代谢公共数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/)、Metlin(https://metlin.scripps.edu/)以及美吉自建库进行匹配与鉴定。搜库后的数据矩阵上传至美吉云平台进行后续处理与分析。在上海美吉生物医药科技有限公司生物云平台进行绘图;采用R语言中的ropls包(Version 1.6.2)进行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),并使用7次循环交互验证评估模型的稳定性。根据变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1,Student’s t检验的P<0.05以及差异倍数为1[14]筛选差异代谢物。结合KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)对差异代谢物进行注释解析。采用Python软件包scipy.stats进行通路富集分析。
2 结果与分析
2.1 PCA及PLS-DA
对BQ组和YQ组曲坯发酵各阶段样本及质控样本进行PCA,以评估组间整体差异与组内变异度。图1-a和图1-b分别展示了正、负离子模式下2组的PCA得分图。结果显示,正离子模式下前2个主成分(PC1、PC2)的累计方差贡献率为76.4%,负离子模式下为78.9%。在2种离子模式下,安曲时BQ与YQ组样本聚集,随着发酵时间的延长,2组样本呈现出清晰的分离趋势,表明添加不同母曲(BQ vs YQ)的曲坯在发酵过程中的代谢谱存在显著差异。质控样本在图中紧密聚集,表明分析方法稳定性良好,数据可靠性高。
a-正离子模式;b-负离子模式
图1 正、负离子模式下PCA图
Fig.1 PCA score plot in positive and negative ion mode
为进一步探究制曲过程中BQ组与YQ组样本的代谢差异,进行了PLS-DA。图2展示了正、负离子模式下2组的PLS-DA得分图及相应的置换检验结果。得分图(图2-a、图2-b)显示,在二次翻曲及拆曲阶段,BQ组与YQ组样本分布于不同象限,呈现出明显的空间分离;即使在一次翻曲阶段,2组样本于同一象限,也表现出良好的区分性。为验证模型可靠性并避免过拟合,进行了200次随机置换检验(图2-c,图2-d)。置换检验结果表明,随着置换保留度的降低,R2和Q2值下降,回归线呈向上的趋势,模型不存在过拟合现象。在正离子模式下,
累积值为
累积值为0.999,Q2累积值为0.954;负离子模式下,累积值为
累积值为1.000,Q2累积值为0.966。表明所构建的PLS-DA模型具有高度的解释力、拟合优度和预测能力。
a-正离子模式PLS-DA得分图;b-负离子模式PLS-DA得分图;c-正离子模式置换检验图;d-负离子模式置换检验图
图2 正、负离子模式下PLS-DA得分图及置换检验图
Fig.2 PLS-DA score plot and permutation test plot in positive and negative ion mode
2.2 差异代谢物分析
2.2.1 曲坯中代谢物概况
经过滤、补值、归一化、对数转换等数据预处理,在曲坯中共鉴定出4 221种代谢物,其中正离子模式下2 250种,负离子模式下1 971种。其中,在KEGG数据库中注释到1 327种代谢物,在HMDB数据库中注释到3 194种代谢物。代谢物数量前20的HMDB分类结果见图3,主要包括有机酸及其衍生物(823种)、脂质和类脂分子(741种)、有机杂环化合物(526种)、有机氧化合物(347种)以及苯环型化合物(257种)。
图3 HMDB数据库化合物分类
Fig.3 Compounds classification in HMDB database
2.2.2 不同发酵时间点曲坯中差异代谢物分析
以差异倍数为1、VIP值>1及P<0.05为标准,筛选了各阶段BQ组与YQ组间的差异代谢物,并绘制火山图(图4)。结果显示,在一次翻曲阶段,相较YQ组,BQ组共检测到1 267种差异代谢物(图4-a),其中上调593种,下调674种。极显著差异代谢物(VIP>2,P<0.01,|log2FC|>0.5[15])共11种,包括上调4种及下调7种(如S-腺苷甲硫氨酸、大麦芽胍碱B等)。在二次翻曲阶段,共鉴定1 427种差异代谢物(图4-b),其中上调615种,下调812种。极显著差异代谢物共51种:仅6种上调(如溶血磷脂酰胆碱、吩嗪),其余超过80%显著下调,尤其曲坯中9种类黄酮化合物(包括桑根皮醇、高良姜精、甜橙黄酮、甘草素等)在YQ组的表达量均极显著高于BQ组。在拆曲阶段,共鉴定1 594种差异代谢物(图4-c),其中上调881种,下调713种。极显著差异代谢物共59种:超过70%显著上调(如异锁链素、毛蕊花糖等)。其中,8种氨基酸、肽及其类似物(包括L-异亮氨酸、蛋氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸、天冬酰胺-亮氨酸等)在BQ组的表达量均极显著高于YQ组。
a-BQ_9 d vs YQ_9 d;b-BQ_21 d vs YQ_21 d;c-BQ_40 d vs YQ_40 d
图4 不同发酵阶段BQ组与YQ组曲坯中代谢物的差异分析
Fig.4 Differential analysis of metabolites in the BQ group and YQ group during different fermentation stages
极显著差异代谢物中S-腺苷甲硫氨酸参与多种生化反应,包括转甲基、转硫和转氨丙基,是甲基化反应的主要甲基供体,甲基化反应涉及香草酸、维生素、辅酶Q及抗生素等天然分子的生物合成[16],而香草酸是白酒中重要的酚酸化合物[17];溶血磷脂酰胆碱结构中的不饱和脂肪酸链在发酵过程中酶解生成游离脂肪酸,为白酒中醛、酮、醇等关键风味化合物提供重要的脂质前体[18];L-异亮氨酸可显著提高复合酵母菌发酵果酒中的活性戊醇、2-苯乙醇及其乙酸酯等风味物质的浓度[19]。这些极显著差异代谢物对白酒风味物质的形成具有重要作用。此外,极显著差异代谢物中类黄酮化合物(如桑根皮醇[20]、高良姜精[21]、甜橙黄酮[22]、甘草素[23]等)具有抗菌、抗氧化等生物活性,由L-苯丙氨酸及L-酪氨酸通过莽草酸途径和苯丙素途径,经系列酶促反应生成,链霉菌属(Streptomyces)和曲霉属(Aspergillus)是合成该类化合物的主要微生物菌属[24]。
差异代谢物的HMDB分类及其在发酵过程中的变化情况如图5所示,排名前5的差异代谢物种类依次为有机酸及其衍生物、脂质和类脂分子、苯丙类和聚酮类、有机氧化合物、有机杂环化合物(图5-a)。翻曲及拆曲阶段均在有机酸及其衍生物分类中有超80%的差异代谢物属于氨基酸、肽和类似物亚类(图5-b),精氨基琥珀酸、苯丙氨酰-酪氨酸、亮氨酰-甲硫氨酸、γ-谷氨酰甲硫氨酸、苯乙酰甘氨酸、脯氨酰-缬氨酸等77种氨基酸、肽及其类似物属于共同差异代谢物(图5-c),如电子版增强出版附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044486,下同)所示,其在2种曲坯发酵过程中交替上调,在翻曲阶段上调数量多于下调,在拆曲阶段下调数量多于上调。精氨基琥珀酸是尿素循环中的中间代谢产物,由精氨基琥珀酸合成酶催化瓜氨酸和天冬氨酸生成,并在精氨基琥珀酸裂解酶作用下分解为精氨酸和富马酸。亮氨酰-甲硫氨酸、γ-谷氨酰甲硫氨酸、脯氨酰-缬氨酸等二肽被用作鲜味和厚味的活性成分[25]。脂质和类脂分子及有机氧化合物在制曲过程中下调数量均高于上调数量。有机氧化合物中包含的碳水化合物和碳水化合物缀合物如水苏糖、D-木糖、蔗果三糖、蜜二糖等,是微生物生长的重要碳源。差异代谢物种类及表达量变化趋势表明,2种曲坯在发酵过程中微生物的生长代谢存在显著差异。
a-各发酵时间点差异代谢物种类统计图;b-有机酸及其衍生物中氨基酸、肽和类似物的占比图;c-差异代谢物中氨基酸、肽及其类似物Upset图
图5 不同发酵阶段的差异代谢物变化情况
Fig.5 Differential metabolite changes during different fermentation stages
2.3 发酵过程中曲坯差异代谢物代谢通路分析
对BQ组与YQ组曲坯发酵过程中的差异代谢物进行KEGG通路富集分析,结果显示,在一次翻曲、二次翻曲及拆曲阶段,分别富集到89、95、100条代谢通路;其中显著富集(P<0.05)的通路数量依次为12、17、14条。如图6所示,图中每个气泡表示1个KEGG代谢通路;横坐标表示代谢物在通路中的相对重要性,用Impact值表示;气泡大小代表Impact值,气泡越大,表示通路重要性越大;纵坐标表示代谢物参与通路的富集显著性,P<0.05代表该途径具有显著性。
在一次翻曲阶段(图6-a),Impact值均大于0.12的显著富集(P<0.05)通路有6条,分别为色氨酸代谢,精氨酸生物合成,各种生物碱的生物合成,角质、木栓碱和蜡的生物合成,组氨酸代谢,甜菜素生物合成,其中3条与氨基酸代谢相关;在二次翻曲阶段(图6-b),Impact值均大于0.12的显著富集(P<0.05)通路共10条,其中6条为氨基酸代谢通路,分别为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,酪氨酸代谢,色氨酸代谢,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢;在拆曲阶段(图6-c),Impact值均大于0.12的显著富集(P<0.05)通路共6条,分别为磷壁酸生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,嘧啶代谢,核苷酸代谢,甘油磷脂代谢,精氨酸生物合成。
a-BQ_9 d vs YQ_9 d;b-BQ_21 d vs YQ_21 d;c-BQ_40 d vs YQ_40 d
图6 差异代谢物KEGG富集通路
Fig.6 KEGG enrichment pathways of differential metabolites
注:Tryptophan metabolism-色氨酸代谢;Arginine biosynthesis-精氨酸生物合成;Cutin, suberine and wax biosynthesis-角质素、软木脂和蜡质生物合成;Biosynthesis of various alkaloids-各种生物碱的生物合成;Furfural degradation-糠醛降解;Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;Tyrosine metabolism-酪氨酸代谢;Nucleotide metabolism-核苷酸代谢;Pyrimidine metabolism-嘧啶代谢; Teichoic acid biosynthesis-磷壁酸生物合成;Sphingolipid metabolism-鞘脂代谢。
代谢通路富集分析显示,氨基酸代谢相关通路在显著富集通路中占比最高,表明BQ组与YQ组曲坯在发酵过程中的核心代谢差异集中于氨基酸代谢。氨基酸不仅可通过美拉德反应生成吡嗪类、呋喃类等特征风味化合物,还能够显著影响微生物的发酵性能。例如,丝氨酸可促进拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)的生长与代谢[26];某些功能性氨基酸(如脯氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)可通过参与多种代谢途径、产物合成及信号传导,调控酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生长、代谢与基因表达[27]。氨基酸的含量和种类亦是评价酱香大曲品质的重要潜在指标[28]。研究表明,酱香大曲中氨基酸含量与曲坯水分、温度和酸度以及Bacillus丰度均存在显著相关性,其中精氨酸与成品酒中乙醇、乙酸乙酯含量呈正相关,与乳酸和高级醇含量呈负相关[28];不同类型的酱香大曲在氨基酸含量上存在显著差异,BQ游离总氨基酸含量高于YQ及WQ,脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸等在其中尤为富集[29]。
氨基酸代谢对酱香大曲及酱香型白酒独特风味物质的形成贡献显著。在制曲及白酒酿造过程中,微生物可通过氨基酸分解途径,将支链氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸转化为相应的高级醇,如Saccharomyces cerevisiae能够将缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸分别代谢为异丁醇、异戊醇、活性戊醇[30],马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)将L-苯丙氨酸代谢生成2-苯乙醇[31]。这些高级醇在后续发酵与陈酿过程中,可进一步与其他组分(如有机酸)发生反应,生成酯类、醛类等关键风味物质。
综上,氨基酸对酱香大曲及酱香型白酒酿造体系具有重要作用,可通过调控微生物群落、提供前体物质或直接参与风味物质的形成反应,影响酱香大曲及酒体品质。本研究结果发现,添加不同母曲的曲坯在一次翻曲、二次翻曲及拆曲阶段的差异代谢物,均在氨基酸代谢通路显著富集,进一步凸显了该通路的核心地位,值得未来深入研究。
2.4 氨基酸代谢网络图构建
将BQ组及YQ组曲坯发酵过程中涉及氨基酸代谢部分的差异代谢物映射到代谢途径中,图7为构建的氨基酸代谢途径。与氨基酸代谢途径相关的差异代谢物热图如电子版增强出版附图2所示。
在一次翻曲及二次翻曲阶段,关于色氨酸、组氨酸及谷氨酸的代谢途径中8-甲氧基犬尿氨酸、肌肽、吲哚-3-乙酰胺、黄尿酸、γ-氨基丁酸、亚胺甲基谷氨酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、高肌肽等代谢物在BQ组中的表达量显著高于YQ组。在拆曲时,与苯丙氨酸、酪氨酸代谢途径相关的代谢物如预苯酸、莽草酸、多巴胺、香草扁桃酸、2,5-二羟基苯甲酸、氢醌、香草胺、前酪氨酸、吩嗪、橘皮素、紫铆因等在YQ组中表达量显著高于BQ组,而与精氨酸合成途径相关的N-乙酰鸟氨酸、N-α-乙酰基-L-瓜氨酸、精氨基琥珀酸等代谢物在BQ组中表达量显著高于YQ组。
L-组氨酸在组氨酸氨裂解酶催化下发生脱氨反应,生成β-咪唑丙烯酸,逐步水解生成L-谷氨酸,L-谷氨酸在谷氨酸脱羧酶催化下脱羧生成γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸在4-氨基丁酸转氨酶及琥珀酸半醛脱氢酶的连续催化下转化为琥珀酸,从而进入三羧酸循环,乳杆菌属是合成γ-氨基丁酸的主要细菌种属,尤其是短乳杆菌(Lactobacillus brevis)[32]。L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸属于芳香族氨基酸,其合成源于莽草酸途径,L-色氨酸通过邻氨基苯甲酸合成,L-苯丙氨酸及L-酪氨酸通过预苯酸合成。酪氨酸代谢与酶促褐变反应相关,L-酪氨酸在酪氨酸酶催化下生成左旋多巴,进一步氧化为多巴醌,最终形成黑色素聚合物,已有研究指出,酱香大曲中BQ的形成机制与酪氨酸代谢相关[33],香草扁桃酸作为儿茶酚胺合成通路的终产物,与黑色素的合成存在竞争关系。L-苯丙氨酸在苯丙氨酸羟化酶的催化下转化为L-酪氨酸,在苯丙氨酸代谢过程中可产生苯乙酸、苯乙醇、香草醛等多种芳香族化合物,对酱香型白酒骨架风味的形成具有重要作用[34]。BQ组与YQ组在发酵过程中涉及的差异氨基酸代谢途径,与大曲风味物质形成、大曲颜色差异密切相关。
图7 氨基酸代谢的相关途径
Fig.7 Related pathways of amino acid metabolism
注:图中黑色字体代表样品中检测到的代谢物,红色字体代表代谢途径中的差异代谢物,实线代表直接代谢途径,虚线代表间接代谢途径。
3 结论
本研究基于非靶向代谢组学技术,分析了在酱香大曲制备过程中,分别以BQ与YQ作为母曲所引起的曲坯代谢差异。2种曲坯共鉴定代谢物4 221种,其中KEGG数据库注释1 327种,HMDB数据库注释3 194种,主要包括有机酸及其衍生物823种,脂质和类脂分子741种,有机杂环化合物526种,有机氧化合物347种,苯环型化合物257种。在一次翻曲、二次翻曲及拆曲阶段,分别检测到1 267、1 427、1 594种差异代谢物,KEGG富集分析显示,3个阶段分别富集89、95、100条通路,其中12、17、14条显著富集(P<0.05),且氨基酸代谢通路占比最高;在翻曲阶段,色氨酸、组氨酸及谷氨酸代谢途径的关键差异代谢物(如肌肽、吲哚-3-乙酰胺、γ-氨基丁酸、亚胺甲基谷氨酸、5-甲氧基吲哚-3-乙酸等)在BQ组显著高表达,在拆曲阶段,与苯丙氨酸、酪氨酸代谢途径相关的关键差异代谢物(如预苯酸、莽草酸、前酪氨酸、香草胺、吩嗪等)在YQ组显著高表达。本研究证实了采用不同母曲(BQ与YQ)可显著影响酱香大曲发酵过程中的代谢特征,氨基酸代谢途径的差异尤为凸显,其中苯丙氨酸及酪氨酸代谢与酱香大曲风味及颜色形成密切相关。氨基酸代谢过程中生成的中间及终产物可能是影响成品曲风味与品质的关键因素。然而,上述代谢差异对酱香型白酒终产品的实际影响,仍需通过后续酿造实验进一步探究。
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