中国白酒产业作为全球规模最大的烈酒生产与消费市场,在我国食品工业中占据着举足轻重的支柱地位[1]。其中,酱香型白酒以其独特的风味品质与卓越的品牌价值,已成为引领行业增长的重要引擎,尤其在高端消费市场贡献了显著的产值。高温大曲作为酱香型白酒酿造的主要原料之一(约占投料比的50%)[2],其质量优劣直接决定了基酒品质,是酱香型白酒生产中不可或缺的“糖化剂、发酵剂和生香剂”[3]。
传统高温大曲在自然发酵过程中,受曲块位置、温湿度等微环境差异的影响,形成外观、理化及微生物群落结构迥异的黄曲、黑曲与白曲。明确这3种大曲的功能分化与协同作用,是揭示酱香型白酒风味形成的关键,也是实现产品质量调控的核心科学问题。
关于3种颜色大曲的特征性功能已多有报道。研究表明,黄曲、黑曲与白曲在理化特性和微生物群落上存在显著功能分化[4-5]。黄曲通常被视为优质曲,其糖化力、液化力等酶系指标较为均衡,在高温大曲中占比80%左右[6-7];黑曲因发酵温度较高,其酶活力相对较低,但富含特定的嗜热菌群,被认为是酱香风味物质(如吡嗪类)的重要贡献者[8];白曲则由于发酵温度偏低,其糖化力最高但发酵生香能力较弱[9]。现代测序技术应用揭示,不同颜色大曲在核心功能菌群的构成上均存在显著差异[10],进而导致其代谢产物与风味组分明显不同[11]。
目前业内多数研究集中于对单一类型大曲的静态描述,鲜有关于3种大曲在功能互补方面的报道。然而,在酱香型白酒实际生产中,往往需要将3种大曲混合后再进行投用,对3种大曲如何通过科学配比实现风味与功能互补,缺乏系统、量化的科学阐释。导致大曲的生产与应用仍高度依赖经验,制约了酱香型白酒品质的稳定提升。
本研究通过多维度评估不同颜色高温大曲的质量差异及其混合曲功能协同机制,旨在为酱香型白酒不同发酵轮次的生产用曲提供数据支撑,为制曲工艺的定向优化、3种大曲的科学配比使用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试大曲样本来源:赤水河左岸中游某酒企生产大曲(E 106°12′58″,N 28°6′30″);样品采集于2025年4月。
大曲样本制作方法:采用完全随机方法抽取白曲、黑曲、黄曲各10块,分别粉碎后制成黑曲样本(BQ)、白曲样本(WQ)、黄曲样本(YQ);混合曲样本按质量比,分别制成混合曲样本1(MQ1,黑曲∶白曲∶黄曲=1∶1∶8)、混合曲样本2(MQ2,黑曲∶白曲∶黄曲=1∶2∶7)、混合曲样本3(MQ3,黑曲∶白曲∶黄曲=2∶1∶7)及混合曲样本4(MQ4,黑曲∶白曲∶黄曲=2∶2∶6)。每组设置3个生物学重复,共采集21个大曲样品。
1.2 主要仪器与设备
7890B-5977B气质联用仪、50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取头、DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm),美国安捷伦科技公司;PAL多功能自动进样器,瑞士斯特分析仪器有限公司。
1.3 测定方法
1.3.1 高温大曲理化指标测定方法
水分含量、酸度、糖化力及淀粉含量的测定参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》。
1.3.2 高温大曲酶活力指标测定方法
酸性蛋白酶及中性蛋白酶活力测定方法参照GB/T 23527.1—2023《酶制剂质量要求 第1部分:蛋白酶制剂》。纤维素酶活力测定方法参照QB/T 2583—2023《纤维素酶制剂》。α-淀粉酶活力测定采用比色法,参照α-淀粉酶活力检测试剂盒进行测定。酯化酶活力的测定方法采用1-萘酚法[12]。糖化酶活力测定采用DNS法[13]。
1.3.3 高温大曲可培养微生物数量的测定
真菌可培养微生物数量测定参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。细菌可培养微生物数量测定参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。
1.3.4 高温大曲挥发性风味物质的测定
样品的前处理:称取样品10.0 g(精确至0.000 1 g),加入30 mL饱和NaCl溶液,超声波浸泡提取1 h,4 000 r/min离心5 min后过滤,取上清液加入50 mL二氯甲烷溶液(分液漏斗),振荡5 min,取下层有机液,重复萃取2次合并有机相,再加入5 g无水Na2SO4干燥过夜,氮吹浓缩至1 mL。
GC条件:DB-WAX色谱柱,流量1 mL/min,载气N2,进样口温度250 ℃;进样量1 μL,分流比10∶1。程序升温条件:初始温度35 ℃,持续5 min;3 ℃/min升温到90 ℃,持续1 min;3 ℃/min升温到150 ℃,持续1 min;5 ℃/min升温至190 ℃,持续1 min;最后再以10 ℃/min升温至220 ℃,持续8 min。
MS条件:电子电离源,电离能量70 eV,离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,检测方式为选择离子监测,质谱扫描范围20～300 m/z。
检测质谱数据通过与标准谱库(NIST 20)对照进行组分鉴定,采用内标法定量大曲样品的挥发性风味物质的含量。
1.3.5 统计与分析
不同样本间理化指标、酶活力指标和可培养微生物数量差异性通过DMSAS数据分析系统进行One way-ANOVA方差分析及Duncan检验;利用SIMCA 14.0软件对风味物质数据进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)以筛选差异挥发性风味化合物;使用Origin 2024、联川生物云平台(https://www.omicstudio.cn)作图、Metware Cloud(https://cloud.metware.cn)作图。
2 结果与分析
2.1 不同颜色大曲及混合曲的理化差异
高温大曲的水分含量、酸度、糖化力和淀粉含量等在一定程度上反映大曲品质优劣,是评价大曲是否成熟的重要指标[14]。从图1-a可以看出,WQ水分含量显著低于BQ与YQ,BQ与YQ水分含量则较为接近,在10.3%～10.6%,但3种大曲的水分含量总体处于低水平;这是由于大曲在贮存前期吸附水及部分毛细管水分逐渐挥发,在贮存后期变化很小所致[15]。4组混合曲的水分含量介于3种单色曲区间范围,符合加权平均规律,但MQ2、MQ3仍显著高于MQ1、MQ4。水分含量在一定程度上能够指征微生物的活性,水分含量过高大曲易生霉,过低则不能为微生物提供良好的存活条件,从而导致大曲的质量降低[16]。
酸度主要由微生物代谢活动所调控,特别是脂肪水解与蛋白质水解过程,酸度过高或过低均不利于微生物生长繁殖。如图1-b所示,不同类型大曲酸度整体接近,无显著性差异,维持在1.1～1.4 mmol/10 g。
大曲糖化力代表相关酶和微生物转化淀粉为可发酵性糖的能力,适宜的糖化力值有助于提高酒醅发酵质量。研究表明,不同类型大曲糖代谢途径相关基因表达量受发酵温度的差异性调控(如淀粉和蔗糖代谢),同时,温度在一定程度上会影响部分糖化酶活性,导致不同类型大曲糖化力分化[17-18],这与本研究结论基本一致(图1-c)。由于3种颜色大曲的糖化力不同,经混合后,4组混合曲的糖化力也表现出明显差异,MQ2、MQ4组显著更高,其次是MQ1组,MQ3组最低。证明调节不同颜色大曲占比可显著影响综合糖化力,这对于指导制曲与酿造生产具有现实意义。
淀粉作为高温大曲原料(小麦)中含量最高的成分,是微生物繁殖代谢的能量来源和代谢产物合成的底物来源;同时,大曲淀粉含量一定程度上也反映了大曲的发酵程度,并最终影响大曲品质[19]。由图1-d可知,YQ与BQ的淀粉含量更低,介于56.2%～57.2%,证明其发酵相对更彻底;WQ淀粉含量更高,这与其发酵温度较低,物质消耗较少有一定关系。4组混合曲的淀粉含量与白曲基本一致,组间差异不具有显著性,介于57.2%～59.5%。
a-水分含量;b-酸度;c-糖化力;d-淀粉含量
图1 不同颜色大曲及混合曲的理化差异
Fig.1 Physicochemical difference diagram of different color Daqu and mixed Daqu
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
综上,不同类型大曲的理化呈显著性差异,但按4种比例混合后,有效地弥补了单色大曲在水分、糖化力、淀粉等方面的不足。此外,组间差异性分析表明,不同比例下各项指标也有所不同,这为酿造生产的大曲搭配使用提供了科学依据。
2.2 不同颜色大曲及混合曲的酶活力差异
高温大曲中含有多种生物活性酶,这些酶通过降解酒醅中的大分子物质,生成风味物质及其前体物质,在酱香型白酒风格特征的形成过程中发挥着关键作用。本研究对3种单色曲、4种混合曲中由酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶、酯化酶、糖化酶、α-淀粉酶构成的酶系进行了测定,除白曲酸性蛋白酶活力值低于检测限未被检测出外,其余酶均成功检出。结果如表1所示。
表1 不同颜色大曲及混合曲的酶活力差异 单位:U/g
Table 1 Differences in enzyme activity of different color Daqu and mixed Daqu
酶活力指标BQWQYQMQ1MQ2MQ3MQ4酸性蛋白酶13.75±1.71ab—26.30±3.98a8.20±2.81ab9.54±0.26ab5.53±1.59b10.54±2.66ab中性蛋白酶12.51±2.42c19.56±3.24bc32.00±1.56ab27.47±2.91ab34.87±0.77a26.23±3.77abc25.10±1.06abc纤维素酶15.33±1.38ab6.34±1.34d18.55±0.15a13.23±0.46bc11.20±0.361c12.10±0.27bc14.53±1.07bc酯化酶9.10±0.71c23.93±1.36a10.36±0.57c15.37±1.95b20.87±0.18a10.92±1.40c10.44±0.99c糖化酶170.0±9.0e692.0±16.3a219.7±2.9d304.0±6.9c370.7±4.1b319.3±20.9c370.7±11.0bα-淀粉酶0.133±0.047b0.359±0.188b0.297±0.131b0.682±0.338ab0.964±0.016a0.670±0.293ab1.433±0.187a
注:“—”表示该酶活力低于方法或所用仪器的检测限,并不代表该样品的某种酶无活性;同行字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2种蛋白酶活力在黄曲中整体相对较高[酸性蛋白酶(26.30±3.98) U/g;中性蛋白酶(32.00±1.56) U/g],这与DENG等[20]的报道有所差异,可能源于环境、工艺等因素所致。3种大曲混合后的酸性蛋白酶活力表现出协同减弱的现象,其内在机制可能在于不同大曲的微生物代谢产物引发了酸性蛋白酶的反馈抑制。这与GAO等[21]的研究揭示的机制相吻合,在枯草芽孢杆菌BSNK-5发酵大豆蛋白时,产物肽和游离氨基酸的积累会对蛋白酶活性产生抑制作用。
WQ纤维素酶活力在3种大曲中显著偏低,这可能与碳源分解代谢抑制[22]有关。WQ淀粉含量明显高于其他颜色大曲,丰富的淀粉作为易利用碳源,促使微生物优先合成淀粉酶进行利用,而纤维素酶的合成则受到抑制。酯化酶、糖化酶在WQ中表现最佳;相较于4组混合曲,YQ的酯化酶、糖化酶活力略低,但差异相对更小;而BQ表现最差。纤维素酶、酯化酶、糖化酶等3类酶活力在不同类型大曲中表现各异,按比例混合后,处于适中范围。
α-淀粉酶作为一类具有诱导特性的酶,其活性受底物诱导调控。本研究中,WQ的α-淀粉酶活力为(0.359±0.188) U/g,在3种颜色大曲中处于最高水平,分别约为BQ、YQ的2.7、1.2倍,此现象或与WQ中较高的淀粉含量存在直接关联。3种颜色大曲按比例混合后,其α-淀粉酶活力均高于单色曲,且在MQ2、MQ4中显著更高。这一现象可能与WQ中高淀粉含量的诱导调控作用相关,也可能归因于不同颜色大曲间存在的酶系互补协同作用[9],抑或是2种机制共同影响所致。α-淀粉酶虽不直接参与糖化作用,但却是间接影响糖化力的核心组成部分,在实际生产中,调控大曲糖化力可通过调控淀粉含量及3种曲比例得以实现。
综上,3种颜色大曲经混合后,大曲酶系变化趋势总体一致,但呈现出一定的梯度关系,这为研究大曲酶活性对酱香型白酒产质量的影响提供了一定的理论支撑。此外,α-淀粉酶活力在混合曲组表现出的增强现象,也为实际生产调控提供了科学依据。
为进一步解析不同类型高温大曲在理化指标和酶活力特征上的异同,对7个试验组大曲的理化指标和酶活力指标进行冗余分析(redundancy analysis,RDA)。如图2所示,7个试验组大曲的理化指标和酶活力,既表现出一定的关联性,也存在组间差异性。
图2 不同颜色大曲及混合曲理化与酶活力的RDA图
Fig.2 RDA diagram of physical and chemical properties and enzyme activity of different color Daqu and mixed Daqu
高温大曲传统生产中,BQ和YQ由于所处发酵环境温度更高、氧含量更低,适宜于乳杆菌、芽孢杆菌等产酸微生物的繁殖代谢,为酸性蛋白酶的合成提供了适宜条件;较高的含水量也为曲霉等产纤维素酶微生物提供了生长条件,使得大曲水分与纤维素酶活性呈较强的相关性。糖化力、糖化酶、酯化酶是WQ生化特征区别于其他曲的主要贡献因素,但并不包含淀粉。淀粉是制曲原料小麦中含量最高的营养物质,能够通过底物诱导作用调控α-淀粉酶的活性,故二者在分布上表现出一定的相关性。大曲发酵时,原料中淀粉在微生物与酶类共同作用下,被分解为小分子糖,这些糖类物质经糖酵解途径进入三羧酸循环,生成柠檬酸、苹果酸等大量有机酸,进而影响大曲酸度、酸性蛋白酶活性,这可能是淀粉含量与酸性蛋白酶、酸度与α-淀粉酶呈现出负向趋势的主要原因。
2.3 不同颜色大曲及混合曲的可培养微生物差异
温度、湿度、溶氧量及质热传递速率等条件的差异,对微生物增殖产生了不同的影响,不同颜色大曲的形成反映了微生物群体在不同发酵微环境中的生态偏好和适应策略[10]。
图3 不同颜色大曲及混合曲的可培养微生物数量差异图
Fig.3 Difference in the number of culturable microorganisms in different color Daqu and mixed Daqu
通过可培养微生物数量分析显示(图3),3种大曲中可培养细菌数量占比较高,而真菌数量相对较少,这与ZHANG等[5]研究一致。细菌数量依次为:WQ>YQ>MQ3>MQ2>MQ1>MQ4>BQ;真菌数量依次为:YQ>MQ2>MQ1>MQ3>BQ>MQ4>WQ。不同颜色大曲的可培养细菌与可培养真菌在数量上呈现出差异化分布特征,通过不同比例混合后,优化了大曲微生物的数量平衡。研究表明,通过搭配工艺将黑曲、白曲、黄曲混合,可使得优势细菌和优势真菌多数包含在白曲、黄曲和黑曲组成的优势菌群集合之内,构成优质曲特殊的微生物群落结构,而不具有与某一颜色大曲突出相似的特征[23]。
2.4 不同颜色大曲及混合曲的挥发性风味物质差异
通过液液萃取-气相色谱-质谱联用技术测定了高温大曲中挥发性风味物质含量,共鉴定出35种挥发性物质,包括8种吡嗪类、7种醇类、3种酯类、3种醛类、7种酸类和7种其他风味物质。根据化合物的浓度绘制风味物质热图,如图4所示。吡嗪类风味物质在YQ中的相对含量显著高于其他类型高温大曲;而酸类与醇类风味物质在WQ和BQ中含量较高,表现优于其他大曲类型;酯类及其他类风味物质在WQ中更为突出;醛类物质则在BQ中含量最高。此外,4组混合曲中各类风味物质的分布更为均衡,协调性更佳(图4-b)。
a-环形热图;b-风味物质分类矩阵热图
图4 不同颜色大曲及混合曲的挥发性风味物质热图
Fig.4 Heat map of volatile flavor substances of different color Daqu and mixed Daqu
为探究不同大曲样本挥发性风味物质的差异,借助SIMCA软件构建PLS-DA分类模型,通过可视化分析发现(图5-a):WQ样点主要集中于第1象限,YQ样点主要位于第3象限,BQ样点则集中在第4象限,4组混合曲样点多分布在第2象限,且4组混合曲的风味分布特征更近似于黄曲。不同类型大曲的样本点显著分离,表明不同大曲样本的分离趋势清晰。为确保模型有效性,采用置换检验对其进行验证,如图5-b所示,R2与Q2数值相近,且Q2回归线在纵坐标的截距<0。综上可知,该模型无过拟合现象,具备有效性与可靠性。
a-PLS-DA 得分图;b-置换检验结果图
图5 不同颜色大曲及混合曲的挥发性代谢物的PLS-DA结果
Fig.5 PLS-DA results of volatile metabolites of different color Daqu and mixed Daqu
通过计算变量权重值(variable importance for the projection,VIP)筛选差异挥发性风味物质,以VIP值>1作为差异挥发性代谢物,共筛选出15种差异挥发性风味物质。如图6所示,2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、乙酸乙酯及2,3-二甲基吡嗪等挥发性代谢物在YQ中相对含量较高。其中,吡嗪类物质是赋予高温大曲典型焦香与烘焙香的关键风味活性成分,是酱香型白酒的特征风味物质之一[24]。苯乙醇及丁酸等挥发性代谢物在WQ中相对含量较高。异丁酸、异戊酸等挥发性代谢物在BQ中相对含量较高,异丁酸、异戊酸等有机酸在大曲豆豉香风味塑造发挥关键作用[25]。4组混合曲各种差异挥发性风味物质的协调性较好,其中愈创木酚在MQ3、MQ4中相对含量较高,愈创木酚是高温大曲中重要的芳香活性成分,其不仅具有风味化合物的基本特征,而且具有生态意义[26];而3-糠醛在MQ2中相对含量略高与其他组,作为一种重要的呋喃衍生物,3-糠醛常被描述为具有杏仁香气[27]。
图6 不同颜色大曲及混合曲的差异风味物质热图
Fig.6 Heat map of different flavor substances in different color Daqu and mixed Daqu
图7 不同颜色大曲及混合曲酶活力指标与差异挥发性风味物质的关系网络图
Fig.7 The network diagram of the relationship between enzyme activity indexes of different color Daqu and mixed Daqu and different volatile flavor substances
大曲中生物活性酶通过催化碳水化合物、蛋白质等大分子底物降解、转化,驱动多种风味化合物的生成,从而塑造高温大曲独特而丰富的风味特征。为解析高温大曲的酶活性与风味物质的关系,基于Spearman相关性(|R|>0.5和P<0.05)绘制酶活力指标与差异挥发性风味物质相关性网络图。如图7所示,酸性蛋白酶、纤维素酶与2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪呈显著正相关,酸性蛋白酶可分解蛋白质生成氨基酸类前体物质,纤维素酶降解纤维素产生糖类或小分子碳源,二者通过协同提供吡嗪类化合物合成所需的关键前体,共同促进了吡嗪类化合物生成。糖化酶、酯化酶与棕榈酸乙酯呈显著正相关,糖化酶分解淀粉生成的葡萄糖,通过酒精发酵生成乙醇,乙醇在酯化酶催化作用下与棕榈酸发生酯化反应,二者通过“提供前体+直接催化”的协同作用,共同促进了棕榈酸乙酯生成。中性蛋白酶与异戊酸、异丁酸呈显著负相关,这可能是因为其最适pH环境接近中性。
2.5 不同颜色大曲及混合曲的微生物代谢差异
为了阐明不同类型高温大曲潜在的差异代谢过程,对不同类型高温大曲差异挥发性风味物质的KEGG通路进行富集。如图8所示,以气泡图与柱状图2种形式对富集结果进行呈现。共富集到3条代谢通路,其中显著富集的代谢通路为丁酸盐代谢,而已有研究表明,丁酸盐代谢通路是浓香型、酱香型及清香型大曲代谢谱差异的关键代谢途径之一[28]。由此可见,丁酸盐代谢通路是介导不同颜色大曲代谢差异的核心途径。
a-气泡图;b-柱状图
图8 不同颜色大曲及混合曲差异挥发性风味物质KEGG通路富集图
Fig.8 KEGG pathway enrichment diagram of different volatile flavor substances in different color Daqu and mixed Daqu
3 结论
本研究通过多维度分析,系统比较了不同颜色高温大曲及其不同比例混合曲的理化特性、酶活力特性、可培养微生物数量、挥发性风味物质组成等差异。结果表明,不同颜色高温大曲的理化指标、酶活力、可培养微生物分布、风味代谢物等呈现出显著的功能分化与互补性。其中,WQ具有水分含量低、糖化力高的特点,是糖化酶、酯化酶的主要来源;YQ、BQ的纤维素酶活力较高,且YQ还表现出较高的蛋白酶活力;风味代谢物组成明显不同,造成这种特征差异的原因主要源于丁酸盐代谢途径的不同。
混合曲组的各项质量指标符合加权平均规律,但糖化力、酶活力、挥发性风味物质等关键指标呈组间梯度差异。此外,3种大曲混合协同减弱了酸性蛋白酶活力,但增强了α-淀粉酶的活力,进一步分析发现,淀粉分解产生的有机酸,通过影响大曲酸度,进而调控了酸性蛋白酶活力与α-淀粉酶活力。
本研究明确了不同颜色高温大曲的质量差异及其混合曲的功能协同机制,为调控酿造大曲质量需求提供了支撑,同时也为解读大曲作用于酒醅发酵机制提供了依据。后续研究可进一步将不同比例混合曲应用于酱香型白酒的酿造生产,以验证其应用效果并指导制曲工艺优化。
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