酵母菌是果酒发酵过程中最主要的微生物,对果酒整体口感、酒体色泽和果香风味有直接影响[1]。然而,随着气候改变,热带水果的糖度逐渐上升,大部分菠萝存在糖度高或口感严重偏酸等问题。在菠萝果酒酿造过程中,高糖、高乙醇、高SO2浓度和pH值过低等高渗透问题[2]均会影响酵母菌的生长和发酵水平,导致发酵提前终止、酒精度偏低以及酒样香味损失等问题。因此,筛选出适合发酵菠萝果酒的酵母菌,不仅可以丰富菠萝果酒发酵菌株的选择,还可以提高菠萝果酒整体品质。
然而目前果酒发酵行业面临许多挑战和困难。其中在发酵产业生产中,大多数选择进口的商业酵母,存在成本昂贵,耐受性一般、风味贡献不足,尤为明显的是酒样中水果香气难保留等问题[3]。适合菠萝果酒发酵的酵母菌应该具备发酵速度快、综合耐受性强、能适应高渗透压环境的特点,酿造的菠萝果酒口感丰富、酒体协调,具有典型的菠萝香气。随着发酵产业的发展,现阶段我国果酒行业发达,微生物资源丰富,不乏优良的酿造果酒酵母菌[4]。近年来,胡江南等[5]从宁夏葡萄酒产区的土壤、葡萄中筛选出耐受乙醇体积分数14%、pH值为3.0、400 g/L葡萄糖和300 mg/L SO2环境的J1和J3这2株酿酒酵母。赵海霞等[6]从贺兰山东麓产区筛选得到Y7和Y28 2株发酵速度快、产乙醇能力强,耐受乙醇体积分数18%、pH 2.0、400 g/L葡萄糖和350 mg/L SO2环境的酿酒酵母,丰富了葡萄酒酿造菌株的选择。然而,目前关于从高渗透原料里筛选出适合发酵菠萝果酒的优良酵母的报道较匮乏。
该研究从高渗透原材料筛选出适用于菠萝果酒发酵的优良酵母菌株,通过菌株的起酵能力快慢和产乙醇能力进行初筛,再经耐受性测定和产H2S实验进行复筛,筛选出发酵速度快、高产乙醇且综合耐受性强的优良菌株,采用分子生物学进行菌株鉴定。以相同发酵条件下发酵制备菠萝果酒,通过常规的果酒分析方法和顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)法对菌株发酵的菠萝果酒进行理化指标和挥发性香气物质分析,比较其发酵性能。筛选得到1株产乙醇能力强、耐受性优良且适合于菠萝果酒酿造的酵母菌,可有效丰富菠萝果酒发酵产业菌株的选择。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
阳光玫瑰葡萄、腌制蔬菜,湖光市场;豆豉,阳江特产营业部;葡萄,新疆红山干果市场;香水菠萝,广东徐闻锦灿餐饮生鲜有限公司。
1.1.2 化学试剂
偏重亚硫酸钾、果胶酶,山东齐鲁生物科技样品店;KCl、酒石酸(均为分析纯)、2-甲基-3-庚酮(色谱纯),上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
YPD液体培养基(g/L):葡萄糖20.0,酵母浸膏10.0,蛋白胨20.0;121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
PDB液体培养基(g/L):马铃薯浸出粉300.0,葡萄糖20.0;121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
PDA培养基(g/L):马铃薯浸出粉5.0,葡萄糖20.0,琼脂20.0,氯霉素0.1;121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
CaCO3营养琼脂培养基(g/L):酵母浸出粉4.5,葡萄糖10.0,CaCO3 3.0,琼脂15.0;121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
氯化三苯基四氮唑(TTC)上层培养基(g/L):葡萄糖0.5,琼脂15.0,TTC 0.5;121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
TTC下层培养基(g/L)[7]:葡萄糖20,蛋白胨10.0,酵母浸膏7.5,KH2PO4 5.0,MgSO4 2.0,柠檬酸1.35,氨苄青霉素1.0,琼脂30.0;调整pH>4.0,121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
亚铋甘氨酸葡萄糖酵母琼脂(BIGGY)培养基(g/L):葡萄糖10.0,酵母浸膏1.0,柠檬酸铋铵5.0,Na2SO3 3.0,甘氨酸10.0,琼脂15.0;121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
HZQ-F160恒温振荡摇床,金坛市万华实验仪器厂;7820A-5975C GC-MS,美国安捷伦科技有限公司;Jasper HPLC,美国AB SCIEX公司;K3 TOUCH酶标仪,美国赛默飞世尔科技有限公司;SPX-250B-Z生化培养箱、YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌锅,宁波久兴医疗器械有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 高渗透原料中酵母菌的分离纯化
将豆豉、葡萄、腌制蔬菜和菠萝装于无菌锥形瓶中室温自然发酵3～5 d,待发酵液产生明显酒精香气后结束发酵。将自然发酵的原材料进行切碎均质,各取10 g样品于90 mL PDB培养基中进行富集24 h。各取10 mL富集液于生理盐水中进行梯度稀释,根据富集液OD值不同,选取3个合适的稀释梯度,进行100 μL稀释涂布,30 ℃培养48 h。挑取表面光滑且湿润、乳白色或者带有淡黄色、中间部位隆起、具有酵母菌特征的单菌落进一步划线纯化,纯化后菌株于斜面保藏和甘油管保藏。
1.3.2 酵母菌菌株的初筛
1.3.2.1 酵母菌起酵速度的测定
酵母起酵速度的测定参考张雪等[8]的方法,略作修改。将甘油保藏的菌株活化,按照体积分数3%分别接种到装有杜氏小管的PDB培养基的试管中,28 ℃静置培养,每隔6 h观察各菌株的产气量,记录菌株的起酵时间和产气速度。
1.3.2.2 酵母菌产乙醇能力测定
酵母菌产乙醇能力测定参考张驰等[9]的TTC双层培养基法,略作修改。将斜面保藏菌株划线于TTC下层平板上,28 ℃倒板静置培养48 h,然后将TTC上层培养基缓慢倒入长有单菌落的TTC下层培养基,28 ℃避光培养3～5 h后观察。其中具有产乙醇能力的菌株在TTC平板上呈红色或者深红色[10]。根据显色情况可筛选产乙醇能力强的酵母菌株。
1.3.3 酵母菌菌株的复筛
1.3.3.1 酵母菌耐受性测定
菌株耐受性测定参考陈力等[11]的方法,并作一定修改。将初筛得到的菌株从甘油保藏中活化,按照体积分数3%分别接种到含有不同质量浓度的盐酸、焦亚硫酸钾、无水乙醇和无水葡萄糖的YPD液体培养基中,28 ℃下恒温培养24 h后,用酶标仪在波长600 nm处测定其OD值,根据OD值大小分析其耐受性[12-13]。耐酸能力试验测定,利用盐酸调整pH值为5、4.5、4、3.5、3、2.5、2.0;耐SO2能力试验测定,调整不同培养基中的焦亚硫酸钾质量浓度为50、100、150、200、250、300 mg/L;耐酒精能力试验测定,调整不同培养基中的无水乙醇体积分数分别为3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%;耐葡萄糖性能试验测定,调整不同培养基中的葡萄糖质量浓度分别为250、300、350、400、450、500 g/L。
1.3.3.2 酵母菌产H2S能力测定
将筛选出耐受性优良的菌株,划线于BIGGY培养基中测定产H2S能力。通过菌落颜色深浅来判断酵母产H2S的能力。在28 ℃培养3 d后,菌落颜色为白色或浅褐色的菌株可以判断为不产或低产H2S菌株,而颜色为深棕色或黑色的菌株则判断为中产或高产H2S菌株[14]。
1.3.4 菌株18S rDNA鉴定和系统发育树分析
根据罗方雯[15]的方法,挑取单菌株接种至装有50 mL YPD液体培养基的锥形瓶中,28 ℃、180 r/min摇床过夜培养。按照酵母基因组DNA提取试剂盒说明书中对酵母进行基因组DNA提取。
1.3.5 菠萝果酒的制备
选择表皮淡黄无损伤,约八成熟的徐闻香水菠萝,去皮切块后,参考张开平等[16]的方法进行水浴灭酶,并作适当修改。冷却得到菠萝原浆与纯净饮用水料液比1∶1(g∶L)混合,使用葡萄糖调整糖度值为20%(质量分数)。将甘油保藏的菌液活化,根据3%接种量接种到装有100 mL YPD液体培养基锥形瓶中培养24 h,测定OD600nm值,调整种子液OD600nm值约0.5。将扩培后发酵液按发酵果酒规程3%的接种量离心,用无菌生理盐水洗涤沉淀2次后加入到料液比为1∶1(g∶L)的菠萝果浆,发酵规模为1 L,装罐静置于恒温培养箱28 ℃密封发酵数天,每天测定糖度值,直到糖度降至4%终止发酵。发酵结束的果酒用2层无菌纱布过滤,低温冷藏贮存。
1.3.6 发酵菠萝果酒的分析检测
1.3.6.1 糖发酵曲线
利用糖度计以发酵24 h为固定时间点测定菠萝果酒糖度,以糖度值(%)为单位绘制糖发酵曲线。
1.3.6.2 基础理化指标
发酵菠萝果酒的酒精度、总酸、残糖、挥发酸、pH值和总SO2等理化指标参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法(含第1号修改单)》测定。
1.3.6.3 有机酸的测定
采用HPLC法,取10 mL澄清酒样,用超纯水稀释40倍,经过0.22 μm滤膜后上机检测。色谱条件:4.6 mm×60 mm色谱柱,阳离子树脂;检测波长210 nm,洗脱液流量0.4 mL/min,反应液流量0.35 mL/min,柱温57 ℃,反应温度135 ℃[17-19]。
1.3.7 挥发性化合物测定
果酒挥发性化合物采用HS-SPME-GC-MS方法[20]测定。将10 mL菠萝果酒原液稀释40倍后取2 mL稀释酒样转入40 mL顶空瓶中,加入1 mL饱和食盐水和1 μL 0.816 mg/mL 2-甲基-3-庚酮,55 ℃平衡10 min后顶空萃取30 min。萃取结束后,将萃取头插入气相色谱进样口,230 ℃解析3 min。色谱条件:HP-5MS石英毛细管色谱柱;升温程序:40 ℃保持1 min,以6 ℃/min 升温至150 ℃,保持2 min,再以4 ℃/min升温至230 ℃保持5 min;载气为氦气,流速1 mL/min;进样口温度为250 ℃;
定性:通过查阅相关文献和计算机谱库检索,对GC-MS分析得到的质谱数据进行定性,要求匹配度大于75,最大值为100。
定量:采用半定量法,以2-甲基-3-庚酮作为内标物,各组分峰面积相对于内标2-甲基-3-庚酮的峰面积对菠萝果酒样品中各挥发性化合物进行定量。
1.3.8 感官评价
感官评价参考杨山芮等[21]的方法并作一定修改,发酵得到的菠萝酒应呈淡黄色,澄清透明,具有菠萝果香,清香纯正,符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法(含第1号修改单)》的要求。由10名酿酒专业人员对样品进行感官评分。
1.3.9 数据处理
所有实验均重复3次,最终结果以“平均数±标准偏差”表示。采用Origin 2021、Excel 2020、MEGA 6.0等软件进行数据统计及作图分析。
2 结果与分析
2.1 菠萝果酒酵母菌的筛选
2.1.1 高渗透原料中的酵母菌分离纯化
利用平板划线法从多种高渗透原料中分离纯化得到108株疑似酵母菌。菌落特征为表面湿润光滑、边缘整齐、乳白色或带有一点淡黄色[22],带有轻微的酒香,光学显微镜下为球形或椭圆形,并有典型的出芽生殖。
2.1.2 酵母菌发酵能力的初筛
酵母菌发酵的过程会产生CO2,气体充满杜氏小管的时间直接反映菌株发酵能力强弱[23]。对分离纯化得到的108株酵母菌开展杜氏小管起酵能力实验,具体结果如表1所示。在培养时间到第12 h时,共有50株产气快的菌株完全充满杜氏小管,产气速度极快,表明具有较好的发酵性能。
TTC能够与乙醇发生显色反应,菌株产乙醇能力越强,菌落呈红色或深红色,产乙醇能力弱的菌落呈白色或者粉红色[24]。产气速度快的50株酵母菌在TTC培养基上的具体显色结果如表2所示。50株产气速度快的酵母菌中有5株菌株显深红色(菌株DC1、YG5、XJ4、XW8、HT1),代表其产乙醇能力极强,生长旺盛,有利于后续菠萝果酒的发酵。其余菌株颜色呈淡红或白色,产乙醇能力一般。
表1 108株菌株产气情况
Table 1 Gas production of 108 strains
气体充满杜氏小管时间/h数量菌株编号1250HT1 HT2 HT3 YG1 YG2 YG3 YG4 YG5 YG6 MJ1 MJ2 MJ4 XJ1 XJ2 XJ4 XJ5 XJ6 XW2 DC2 DC3 DC4 DC5 DC6 DC8 DC9 DC10 DC11 DC16 XW1 HT4 HT5 XW3 XW4 XW5 XW6 XW7 XW8 HT6 SC1 SC2 SC3 MZ1 MZ2 MZ6 XJ3 XJ7 MZ12 DC7 DC1YG71820XJ8 XJ9 XJ10 FJ11 DC12 DC13 DC14 DC15 MJ3 LM1 LM2 LW4 MZ8 MZ9 FJ1 FJ3 FJ4 FJ5 MZ10 MZ112427XJ11 LBC7 MZ3 MZ4 MZ5 MZ7 FJ7 FJ9 LBC1 LBC2 LBC3 LBC4 LBC5 LBC6 LBC8 FJ2 SC4 FJ10 SC5 LM3 LM4 LM5 LM6 LM7 LM8 LM9 LW13011FJ6 FJ8 SC6 SC7 SC10 LW2 LW3 SC8 SC9 FJ12 FJ13
表2 菌株TTC显色情况
Table 2 TTC coloration of strain
菌株显色产乙醇能力菌株编号-HT2 HT3 YG1 YG2 YG3 YG4 YG7+YG6 MJ1 MJ2 MJ4 XJ1 XJ2 XJ5 XJ6 XW2 DC2 DC3 DC4 DC5 DC6 DC8 DC9 DC10 DC11 DC16 XW1 HT4 HT5 XW3 XW4 XW5 XW6 XW7 HT6 SC1 SC2 SC3 MZ1 MZ2 MZ6 XJ3 XJ7 MZ12 DC7++DC1 XW8 YG5 HT1 XJ4
注:无颜色变化为“-”,颜色微红为“+”,颜色深红为“++”。
2.1.3 酵母菌的复筛
在果酒发酵酿造过程中,初始糖度、酒精度、pH值以及SO2等因素会对酵母菌的生长与发酵产生直接影响。酵母菌在合适的环境下生长更加旺盛,发酵水平高。将酵母菌置于不同浓度的高渗透环境下进行培养,在600 nm波长下测定OD值,数值越高代表酵母菌耐受能力越强。在耐受性实验中,测定5株菌株在不同梯度的葡萄糖质量浓度、乙醇体积分数、SO2添加量以及pH值条件下的OD值,结果如图1所示,菌株DC1、XW8和YG5在pH 2.5、400 g/L葡萄糖、300 mg/L SO2、体积分数为15%的无水乙醇环境下生长依旧良好,表现出优良的耐受性。其中菌株XW8的综合耐受性在5株菌中最佳,优于菌株DC1和YG5,能够耐受pH值为2.0、450 g/L葡萄糖、300 mg/L SO2、体积分数为18%的无水乙醇,与乔喜玲[25]研究成果相似。以安琪商业酵母BV818为对照,通过BIGGY培养基显色沉淀法,对3株综合耐受性优良的菌株开展产H2S能力检测,结果如图2所示。菌株YG5、DC1、XW8呈现淡褐色,为低产H2S菌株,均优于业酵母BV818,符合果酒发酵条件。
a-耐酸性;b-耐糖;c-耐SO2;d-耐乙醇
图1 五种菌株的高渗环境耐受性测定
Fig.1 Determination of tolerance of five strains to hyperosmotic environment
a-BV818;b-YG5;c-DC1;d-XW8
图2 四种菌株产H2S情况
Fig.2 H2S production of four strains
2.2 菌株的分子生物学鉴定
利用真菌PCR扩增菌株XW8、DC1、YG5的18S rDNA序列,将测序结果在NCBI数据库进行同源序列比对,选取不同相似度的菌株,用MEGA-X软件构建系统发育树,如图3所示。XW8、DC1、YG5经过比对序列和亲缘关系判定,分别鉴定确认为酿酒酵母、卡利比克迈耶氏酵母、酿酒酵母。
图3 基于18S rDNA测序构建的YG5、DC1、XW8菌株系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of YG5, DC1, and XW8 strains based on 18S rDNA sequencing
2.3 菠萝果酒的理化指标分析
2.3.1 糖发酵曲线分析
在果酒发酵产业中,糖度值降至4%的时候为发酵完毕。如图4所示,4株菌株的整体发酵时间较短,均在7～9 d完成发酵,为快速发酵。在糖度值降至4%时,XW8和YG5所需时间最短,只需要7 d,而DC1和BV818则分别需要8、9 d。表明菌株XW8和YG5可能具备更好的发酵效果。
2.3.2 菠萝果酒基础理化指标分析
如表3所示,所有菌株酿造的菠萝果酒理化指标均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法(含第1号修改单)》。与BV818、YG5、DC1酿造的酒样相比,XW8的酒精度最高,达到11.7%vol,对应残糖质量浓度最低,而商业酵母BV818的残糖质量浓度达到(12.02±0.47) g/L,发酵时间最长,对应酒精度最低。菌株XW8在酒精度提升和残糖消耗两方面呈现更好的优势,与菌株本身的高耐受性有直接联系,尤其优异的耐高糖、耐乙醇特性,使其在酒精发酵上对可发酵糖利用更充分,乙醇转化率更高,后期发酵对产生的乙醇适应更好,发酵速度也更快。
图4 糖发酵曲线
Fig.4 Sugar fermentation curve
表3 不同菌发酵菠萝果酒理化指标
Table 3 Physicochemical indexes of pineapple wine fermented by different bacteria
菌株编号发酵时间/d酒精度/%vol总酸/(g/L)残糖/(g/L)挥发酸/(g/L)pH总SO2/(mg/L)XW8711.7±0.014.81±0.288.82±0.560.52±0.043.45±0.0860.12±4.98DC1810.6±0.075.02±0.489.51±0.380.60±0.033.50±0.0965.05±5.47YG5710.8±0.025.49±0.5710.23±0.290.55±0.033.55±0.0755.03±4.49BV81899.9±0.035.18±0.3912.02±0.470.62±0.053.40±0.1170.01±5.98
2.3.3 菠萝果酒有机酸分析
果酒中的有机酸种类丰富,为果酒总酸的主体,具有一定的呈香、呈味作用,并能与其他呈味化合物共同赋予果酒特有的芳香,其种类和质量浓度是引起果酒风味改变的重要因素。如表4所示,所有菌株发酵酿造的菠萝果酒均没有检测出富马酸,表明果酒具有安全性和食用性。菌株XW8在有机酸组成上表现出“低乳酸、低乙酸、适中酒石酸”的代谢特征,与GAO等[26]的研究结果相似。其乳酸和乙酸含量均低于其他菌株,有效降低挥发酸带来的刺激感;酒石酸含量适中,既保证了酸度结构的完整性,又避免了过强酸感。该菌株的发酵果酒酸度平衡可以突出菠萝果酒的果香特性,提升整体口感清爽度。相比之下,DC1和YG5菌株乳酸、乙酸含量偏高,易导致酸感过重。商业酵母BV818菌株酸度适中,但酒石酸偏低,风味贡献可能不及其他发酵果酒。因此,XW8菌株发酵的果酒所含有机酸的种类和质量浓度呈现最好,确保果酒安全性,在4种菌株中表现最优,表明XW8菌株在提升果酒品质方面具有一定优势。
表4 有机酸种类与含量 单位:mg/mL
Table 4 Types and content of organic acids
化合物DC1XW8YG5安琪商业酵母BV818酒石酸ND33.76±0.03659.68±0.084.50±0.05苹果酸8.52±0.048.36±0.088.08±0.088.23±0.06富马酸NDNDNDND乳酸76.80±0.1637.12±0.1277.48±0.2055.32±0.22柠檬酸60.32±0.6459.88±0.4059.48±0.0857.12±0.04乙酸77.28±0.008.28±0.0077.48±0.2075.15±0.06琥珀酸3.76±0.003.76±0.004.08±0.043.80±0.03
注:“ND”表示此物质未检出。
2.4 挥发性化合物分析
采用GC-MS对XW8、DC1、YG5菠萝发酵酒样的挥发性化合物进行定性定量分析,并以聚类热图可视化挥发性化合物种类差异,不同颜色的变化表示挥发性化合物质量浓度的大小,如图5所示。XW8、DC1、YG5分别检出81、73、78种挥发性物质。其中己酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、3-甲硫基丙醇构成共同的菠萝香味基础,且仅有XW8菌株发酵的酒样检测出独有的3-甲硫基丙酸乙酯,拥有特有的热带水果甜感和花香。由图6可知,3种发酵酒样里共有相同挥发性成分17种,XW8与DC1共有26种,DC1与YG5共有32种,XW8与YG5共有21种,说明不同菌株发酵的菠萝果酒的挥发性成分存在较大的差异。由图7可知,3种发酵菠萝果酒的挥发性物质的组成和质量浓度存在一定差异。由图7-a可知,从种类组成来看,3种酒样检测出的种类均为酯类最多,XW8有20种、DC1有19种、YG5有17种。由图7-b可知,从挥发性物质的质量浓度来看,3种发酵酒样各自检测出质量浓度前3的种类均为醇类最高,酯类次之,醛类第3。这3种占据挥发性物质50%以上,确保酒体酒香浓郁。其中XW8在挥发性成分的种类个数和质量浓度上均表现最佳,酯类质量浓度总和约7 363 μg/L,高于DC1的5 145 μg/L 和YG5的4 569 μg/L。同时,XW8其他分类中的质量浓度也最高,包括芳香烃类、醚类和少量的糖苷类等。根据挥发性物质定性定量结果进一步推测分析,菌株XW8之所以在酯类物质的种类和质量浓度尤为突出,可能是其菌株本身含有较高活性的乙酰辅酶A合成酶和醇酰基转移酶,这些酶在酯类合成中起着至关重要的作用[27]。乙酰辅酶A作为酯类合成的关键前体,通过醇酰基转移酶的作用与乙醇反应生成乙酸乙酯,并可能进一步转化为更复杂的酯类化合物,跟上述菌株XW8含有最多酯类风味物质相对应,与WANG等[28]的研究结果相似。因此,XW8独有的优势不仅增加了菠萝果酒的挥发性化合物多样性,也提升了其感官品质。综上,XW8在保留与DC1、YG5共有水果香气的同时,通过提升化合物的种类和质量浓度,尤其是酯类物质,其引入的具有水果甜香和肉香的硫化酯,则可以抑制一定不良气味,实现了香气清新、菠萝真实感与香韵纯净度的叠加。
2.5 感官评价
口感、香气、色泽与典型性是评判菠萝果酒品质十分重要的指标,对4株菌株发酵的果酒经灭菌后进行感官评价[29],结果如图8所示。菌株BV818、XW8、DC1和YG5在色泽、香气和口感上综合评分分别为85、91、73、75分,菌株XW8发酵的果酒感官评价在色泽、香气、口感以及典型性中呈现全包围特点,综合得分最高,其中在香气方面得分最为突出,与GC-MS所测定挥发性香气物质结果相似,表明酵母菌XW8酿造的果酒在真实感官评价上具有较大优势。
a-YG5;b-XW8;c-DC1
图5 YG5、XW8和DC1菌株发酵菠萝酒的化合物聚类热图
Fig.5 Compound cluster heat map of pineapple wine fermented by YG5, XW8, and DC1 strains
图6 YG5、DC1、XW8菌株发酵菠萝酒的化合物韦恩图
Fig.6 Venn diagram of compound in pineapple wine fermented by YG5, DC1, and XW8 strains
3 结论
该研究从不同高渗原料中分离纯化得到108株菌株,经初筛和复筛获得XW8、YG5和DC1这3株能耐受pH值2.5、400 g/L的葡萄糖、300 mg/L的SO2和体积分数15%乙醇且低产H2S的菌株。其中,菌株XW8最高可耐受pH值为2.0、450 g/L的葡萄糖、300 mg/L的SO2和体积分数为18%的无水乙醇,综合耐受性优于菌株YG5和DC1。通过18S rDNA分子生物学鉴定,菌株XW8与YG5均为酿酒酵母,菌株DC1为卡利比克迈耶氏酵母。在相同菠萝果酒发酵规程下,以商业酵母为对照,对3株酵母菌进行发酵特性比较分析。结果表明,菌株XW8仅需要7 d完成发酵,在4种发酵酒样中的酒精度最高,达到11.7%vol,基础理化指标均符合果酒国家标准。GC-MS测定挥发性风味物质结果显示,XW8发酵酿造的菠萝果酒共检出81种挥发性物质,醇类和酯类分别为17种和20种,关键菠萝香气物质己酸乙酯浓度较高,且含有3-甲硫基丙酸乙酯,赋予成熟热带菠萝甜感,香韵纯净。感官评价表明菌株XW8发酵酒样酸甜协调、苦味涩味平衡最佳。综上,从高渗透原料中筛选出的3株酵母菌,酿酒酵母XW8更适合进行菠萝果酒的酿造发酵。该研究丰富了菠萝果酒发酵产业菌株的选择,对于热带水果的高值化利用和产业的实际发展具有重要的理论参考。
a-化合物个数;b-化合物各分类质量浓度
图7 YG5、DC1、XW8菌株发酵菠萝酒的化合物个数和质量浓度堆叠柱状图
Fig.7 Stacked histogram of compound number and mass concentration of pineapple wine fermented by YG5, DC1, and XW8 strains
图8 感官评价雷达图
Fig.8 Radar chart of sensory evaluation
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