客家黄酒作为岭南地区重要的传统发酵食品,其独特风味与营养品质的形成依赖于酒药中复杂的微生物区系及其代谢酶系的协同作用[1]。乳酸菌作为客家黄酒发酵微生物体系的重要成员之一,在整个酿造过程中持续存在并发挥重要功能[2]。近年来,研究发现乳酸菌在提升黄酒品质方面具有显著贡献。例如,通过外源添加副干酪乳酪杆菌(Lactobacillus paracasei)FMES22可以将黄酒中γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的含量显著提高至超过60 mg/L,接近对照组的2倍,有效增强了黄酒的营养保健价值[3]。再者,采用融合魏斯氏菌(Weissella confusa)AR1038的延迟接种策略可显著促进黄酒中脂肪酸乙酯的积累,特别是中长链脂肪酸乙酯类物质的合成,从而有效增强酒体的花果香特征[4]。此外,在黄酒循环浸米过程中,以植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)L-53、短促生乳杆菌(Levilactobacillus brevis)L-9和弯曲广泛乳杆菌(Latilactobacillus curvatus)MG-28为主导的微生物群落有效抑制了产胺微生物的入侵,提高了黄酒的酿造安全性[5]。
当前,针对黄酒酿造中乳酸菌功能的研究多聚焦于其对产品营养、风味及安全性的提升,而对其在淀粉质原料糖化这一更为基础、关键环节中的生态功能却鲜有报道。糯米作为客家黄酒的主要原料,其中富含淀粉等多糖类物质,酿造启动的关键就在于将这些大分子糖类高效水解为可发酵糖[6-7]。因此,深入揭示功能乳酸菌在淀粉质原料水解中的代谢潜能,对全面阐释其在客家黄酒发酵体系中的生态功能及酿造机制具有重要意义。近年来,得益于高通量测序技术的快速发展,全基因组分析方法为系统阐释微生物的代谢特征与生态潜能提供了有效手段。例如,基于全基因组信息揭示了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)QH-1对地黄根腐病的拮抗机制[8];马赛菌(Massilia puerhi)SJY3T的基因功能注释为其有机物降解潜能提供了理论依据[9]。
本研究从客家黄酒酒药中分离出1株高产GABA的乳酸菌,将其作为目标功能菌株,经鉴定后命名为L.paracasei L-2318。为深入解析该菌株在客家黄酒淀粉质原料水解中潜在的生态作用,对其进行了全基因组测序,并基于GO、COG、KEGG以及CAZy等数据库进行编码基因的注释分析。旨在系统解析功能乳酸菌L.paracasei L-2318在客家黄酒淀粉质原料糖化阶段的潜在贡献,为利用该菌株开发黄酒专用功能强化发酵剂提供理论支持,同时为进一步优化黄酒酿造工艺及推动微生物资源的应用提供数据参考与科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株来源
本研究所用乳酸菌均分离自客家黄酒酒药。
1.1.2 主要试剂
GABA标准品(色谱级)、异硫氰酸苯酯(>98%)、三乙胺、冰乙酸、无水醋酸钠、L-谷氨酸钠(均为分析纯),上海麦克林生化科技有限公司;甲醇、乙腈(均为色谱级),美国Sigma-Aldrich公司;细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、2× SanTaq PCR Mix预混液,生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基(g/L):蛋白陈10,牛肉浸粉10,酵母浸粉5,葡萄糖20,柠檬酸三铵2,K2HPO4·7H2O 2,CH3COONa·3H2O 5,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·4H2O 0.05,吐温-80 1 mL/L,pH 6.0。固体培养基在此基础上添加琼脂粉15 g/L。
谷氨酸钠(monosodium glutamate,MSG)发酵培养基:在MRS培养基的基础上添加20.0 g/L L-谷氨酸钠。
淀粉培养基(g/L):牛肉膏5,NaCl 5,蛋白胨10,可溶性淀粉2。
以上培养基均121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
1260 II系统HPLC,美国安捷伦科技有限公司;HZQ-F160振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;SPX-250生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司;HANNA-2210型酸度计,北京信立方科技发展股份有限公司;DM500生物显微镜,上海徕卡显微系统有限公司;3K-15台式高速冷冻离心机,SIGMR离心机(扬州)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种分离
采用市售传统客家黄酒酒药,经研磨处理后,称取一定量的酒药粉作为菌种分离源。取10 g酒药粉浸没于90 mL无菌水中,于37 ℃,160 r/min条件下振荡30 min使微生物充分洗脱。将所得菌悬液稀释涂布至MRS培养基,于37 ℃培养48 h后根据菌落形态[10]分离纯化乳酸菌单菌落。将纯化后的菌株采用甘油保藏法于-80 ℃保存。
1.3.2 高效液相色谱法筛选高产GABA乳酸菌
将保藏的乳酸菌菌株经MRS平板划线活化后,挑取单菌落至MRS液体培养基中,于37 ℃,160 r/min培养24 h进行二代活化,再以1%接种量于相同条件下培养12 h,制得发酵种子液。将发酵种子液以4%接种量,接种于50 mL MSG发酵培养基中,37 ℃静置培养24 h。发酵液经12 000 r/min离心3 min后取上清液待测。采用HPLC进行分析,配置C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),参考王清清等[11]的方法测定乳酸菌发酵液中的GABA含量。
1.3.3 生理生化试验
参照《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)[12]和《常见细菌系统鉴定手册》[13]中菌种鉴定方法对乳酸菌菌株进行部分生理生化特征的鉴定。
1.3.4 目标菌株16S rDNA测序
挑取单菌落于50 mL MRS培养基中,37 ℃、160 r/min摇床过夜培养。按照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书流程进行乳酸菌菌株基因的提取。采用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和反向引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),参考2× SanTaq PCR Mix预混液的使用说明书进行菌株基因组DNA的PCR扩增。PCR扩增产物经1.7%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测合格后,委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将序列结果在NCBI数据库中进行BLAST同源性比对,并选取同源性较高的模式菌株序列,采用MEGA软件与邻位相接法构建系统发育树,以确定菌株的分类学地位。
1.3.5 目标菌株的全基因组测序
1.3.5.1 基因组提取
将甘油保藏管中的菌株接种于MRS培养基中,37 ℃恒温160 r/min摇床培养2～3 d,培养结束后离心收集菌体。采用Invitrogen PureLink基因组DNA提取试剂盒完成菌株基因组DNA的初提取,经分光光度计检测DNA浓度与纯度,并进一步通过Quick-DNA Miniprep Plus试剂盒进行纯化。
1.3.5.2 基因组测序及组装
以纯化后的高质量基因组DNA为模板,使用SMRT bell Express Template Prep Kit 2.0试剂盒,按照制造商的操作流程,将≥3 μg的基因组DNA构建为用于PacBio测序的SMRT bell文库。随后,利用PacBio Sequel II平台进行全基因组测序。对原始双端测序reads使用Trimmomatic进行质控与修剪,获得的clean data用于后续分析。使用SPAdes在默认参数下完成基因组组装,并获得最优组装结果。
1.3.5.3 基因功能注释
首先运用GeneMarkS软件进行基因结构预测,继而通过blastp模块将全部预测基因模型比对至不同功能类型数据库以完成功能注释,所用数据库包括:GO、COG、KEGG和CAZy等专项数据库。此外,tRNA通过tRNAscan-SE进行识别,rRNA则利用RNAmmer进行鉴定。
1.3.6 产淀粉酶验证实验
将菌株接种于MRS培养基中活化24 h后,以2%接种量接种于淀粉培养基中,于37 ℃,160 r/min条件下振荡培养24 h后,测定培养液在600 nm处的吸光值(OD600 nm)。
1.4 数据处理
使用SPSS Statistics 26对试验数据进行单因素方差分析,Origin 2021用于数据可视化处理,系统发育树的构建使用MEGA 11完成。所有实验均设置3次重复,结果以“平均值±标准差”表示,P<0.05表示数据在统计学意义上存在显著差异。
2 结果与分析
2.1 高产GABA乳酸菌的筛选
采用HPLC测定GABA含量,其线性回归方程为y=13.624x-10.902(R2=0.999 2),表明线性关系良好。根据乳酸菌菌落形态[10]从客家黄酒酒药中分离出10株乳酸菌,对其发酵液中的GABA含量进行测定。如图1所示,发酵液中不同的GABA含量体现了菌株之间的代谢差异。10个菌株发酵液的GABA质量浓度均在20 mg/L以上,质量浓度最低的L-2306发酵液仅为(23.25±0.02) mg/L。L-2318在同等的条件下表现出优秀的GABA合成能力,其发酵液的GABA质量浓度达到(35.42±0.50) mg/L,高于L-2306的1.5倍并显著高于其余8个菌株。因此确定L-2318作为高产GABA的目标功能乳酸菌。
图1 不同乳酸菌菌株的产GABA能力
Fig.1 GABA production capacity of different lactic acid bacterial strains
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.2 菌株的生理生化试验结果
功能菌株L-2318的生理生化特征如表1所示。该菌株对不同的碳水化合物展现出广泛的利用能力,能够利用葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖等多种糖类以及山梨醇、甘露醇等糖醇作为生长的碳源物质。值得注意的是,该菌株不能利用阿拉伯糖和木糖作为生长碳源,这一特征可作为物种分类的重要依据。在其他生理生化项目中,革兰氏染色的阳性结果符合乳酸菌的普遍特征,接触酶试验、硫化氢产生试验及明胶液化试验结果均为阴性。综上,通过系统检索《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)[12]和《常见细菌系统鉴定手册》[13],结合ZHENG等[14]提出的乳酸菌新分类学框架,初步将菌株L-2318归为乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)。
表1 菌株L-2318的生理生化试验结果
Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain L-2318
检测项目结果检测项目结果葡萄糖+麦芽糖+果糖+山梨醇+半乳糖+甘露醇+阿拉伯糖-革兰氏染色试验+木糖-接触酶试验-乳糖+硫化氢试验-蔗糖+明胶液化试验-
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。
2.3 16S rDNA序列分析
为进一步明确功能菌株L-2318的分类学地位,对其16S rDNA序列进行扩增测序,得到总长为1 473 bp的基因序列。将所得序列提交至NCBI数据库与模式菌株进行同源性比对分析,结果表明该序列与多株乳酪杆菌属成员具有高度相似性。从中选取了7株代表性菌株构建系统发育树。如图2所示,菌株L-2318 与NR_025880.1 L.paracasei汇聚于同一分支,两者之间的相似度达到99.79%。综合菌落形态和生理生化特征确定菌株L-2318为L.paracasei,并将其命名为L.paracasei L-2318。
图2 菌株L-2318的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain L-2318
2.4 全基因组解析
2.4.1 基因组基本特征
全基因组测序结果如表2所示,L.paracasei L-2318的基因组总长度为3 144 600 bp,包含1个染色体序列和1个质粒序列,N50长度达3 077 805 bp,表明基因组组装完整性和连续性极高。此外,L-2318基因组的GC含量为46.27%,这与该菌种已报道的基因组特征相符[15]。基因分析结果显示,L-2318共含有3 341个基因,其中编码基因3 265个,占基因总数的97.73%。同时,编码基因的总长度为2 708 082 bp,占基因组全长的86.12%,其平均长度为829 bp。在非编码RNA的注释方面,该菌株含有61个tRNA基因和15个rRNA基因。
表2 L.paracasei L-2318的基因组基本特征
Table 2 General genomic features of L.paracasei L-2318
样品名称L-2318基因组总长度/bp3 144 600序列数目/个2N50长度/bp3 077 805GC含量/%46.27基因总数/个3 341编码基因总数/个3 265编码基因总长度/bp2 708 082编码基因平均长度/bp829tRNA基因数/个61rRNA基因数/个15
基因组圈图通过多层次信息整合,为L.paracasei L-2318的基因组特征提供更全面、更直观的可视化呈现。采用R语言的circlize包绘制L-2318的染色体(L-2318.Chr)和质粒(L-2318.P)基因组圈图。图3自外向内共包含6个信息层:最外圈为基因组大小的标识;第2、3圈分别展示正、负链上的编码基因,并以不同的颜色区分不同的COG功能分类;第4圈标注rRNA与tRNA的基因注释分布;第5圈以径向柱状图显示GC含量波动,其中向外的红色部分表示GC含量高于基因组平均值,向内的蓝色部分则对应表示低于基因组平均GC含量,柱高则反映了GC含量偏离平均值的程度;最内圈显示GC skew值,具体算法为G-C/G+C,在生物学意义上该值为正值时正链更倾向于转录编码基因,为负值时负链更倾向于转录编码基因。
2.4.2 COG功能注释
COG数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)的构建基于完整的蛋白质序列比对,该数据库通过对预测蛋白进行直系同源归类,实现功能注释与进化分析,其理论基础为直系同源基因通常具有相似的功能[16-17]。COG数据库共注释到L.paracasei L-2318基因组中的2 434个编码基因(占编码基因总数的74.55%)并划分为25个功能类别(图4),其中有459个基因功能未知,其功能的阐明有待进一步研究。除了功能未知的基因外,注释数量较多的功能类别主要为:碳水化合物转运与代谢,306个;转录,245个;复制、重组与修复,232个;氨基酸转运与代谢,210个。在碳水化合物转运与代谢的类别中,进一步探究L.paracasei L-2318的淀粉水解潜力。重点关注与淀粉酶相关的重要基因,在功能描述中发现了与编码α-淀粉酶(COG0366)相关的9个重要基因。可见,COG注释结果预示着L.paracasei L-2318在客家黄酒发酵过程中水解利用淀粉质原料的潜力。
2.4.3 GO功能注释
GO数据库(http://www.geneontology.org/)可以对不同物种的基因和蛋白功能进行限定和描述[18-19]。基于GO数据库进行功能注释结果如图5所示,共有652个编码基因获得GO功能注释,占总编码基因数量的19.97%。根据GO分类系统的3大基础分类,生物过程、细胞组分和分子功能的基因数量分别为1 302、901、704个。在level 2功能层面,所有注释基因被进一步划分为32个功能亚类。在生物过程大类中注释到细胞过程、代谢过程和刺激反应等18种功能分类,其中与细胞过程相关的基因数468个,代谢过程相关的基因402个,刺激反应相关的基因111个,这3类功能富集到了最多的编码基因。而细胞组成进一步分为细胞内组分、蛋白质复合物和细胞解剖实体这3种功能分类,基因数量分别为327、108、466个。此外,分子功能涉及催化活性、结构分子活性、转运蛋白活性和结合活性等11个功能分类,其中催化活性(52.76%)和结合活性(32.51%)占比最高,分别富集了344和212个相关基因。
图3 L.paracasei L-2318的基因组圈图
Fig.3 Genomic circle map of L.paracasei L-2318
图4 L.paracasei L-2318编码基因的COG功能注释统计
Fig.4 COG functional annotation statistics of coding genes in L.paracasei L-2318
值得注意的是,在level 4功能层级,与淀粉水解相关的碳水化合物代谢过程(GO:0005975)富集到了53个相关基因,同时糖基转移酶(GO:0016757)、多糖结合(GO:0030247)和糖苷水解酶(GO:0016798)也分别注释到了19、10和4个编码基因。其中,糖苷水解酶可催化切断糖苷键,将淀粉、纤维素等多糖分解成更小的糖单元[20]。这一结果揭示了L.paracasei L-2318在水解和利用如淀粉、纤维素、半纤维素等各种复杂碳水化合物作为碳源方面的分子遗传基础。
图5 L.paracasei L-2318编码基因的GO功能分类
Fig.5 GO functional classification of coding genes in L.paracasei L-2318
2.4.4 KEGG通路富集
KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)涵盖基因组序列、生物学通路以及生化分子与反应等多层次信息,是一个系统分析基因功能、整合基因组与功能信息的公共知识库[21]。使用KEGG自带的kofamscan软件在L.paracasei L-2318的基因组中共注释到1 526个编码基因,这些基因一共参与了125个不同的代谢通路。图6根据注释信息将代谢通路分为代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程和生物系统5个大类,共涵盖24个次级通路类别。在这些代谢通路中,全局和总览图富集的编码基因数量最多,达到了1 033个。此外,碳水化合物代谢、膜转运和氨基酸代谢相关的功能基因数量次之,分别为293、187和133个。这些代谢通路中大量的编码基因富集预示着L.paracasei L-2318具有较强的氨基酸代谢能力和碳水化合物代谢潜力。
在氨基酸代谢方面,L.paracasei L-2318的高产GABA表型与KEGG基因注释结果高度吻合。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路(ko00250)及精氨酸和脯氨酸代谢通路(ko00650)中,发现了2个编码谷氨酸脱羧酶(EC:4.1.1.15)的功能基因(L-2318001572、L-2318001617)。已有研究指出,在GABA的生物合成过程中,L-谷氨酸依赖于谷氨酸脱羧酶的催化脱羧直接生成GABA[22]。该酶编码基因的存在,为菌株L-2318合成GABA提供了关键的分子基础。在碳水化合物代谢方面,淀粉和蔗糖代谢通路(ko00500)富集了42个编码基因,构成了仅次于磷酸戊糖途径(ko00030,47个基因)的第二大代谢单元。这一结果表明L.paracasei L-2318在实际客家黄酒酿造中可能不仅限于利用简单糖类,而是具备直接参与底物糖化的代谢潜能,能够辅助将糯米中的大分子淀粉高效水解为微生物可利用的葡萄糖。
2.4.5 碳水化合物活性酶分析
CAZy数据库(http://www.cazy.org/)是专注于复杂碳水化合物及糖复合物代谢相关酶类的1个数据库资源[23]。利用该资源对编码蛋白进行进一步分析,重点挖掘L.paracasei L-2318所携带的淀粉水解酶系组成。CAZy数据库注释结果显示L.paracasei L-2318的基因组包含109个编码碳水化合物活性酶的基因(图7-a),其中包括糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)47个、糖基转移酶(glycosyl transferases, GTs)32个、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)13个、碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules, CBMs)8个、辅助氧化还原酶(auxiliary activities, AAs)7个以及多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PLs)2个。
图6 L.paracasei L-2318编码基因的KEGG通路富集
Fig.6 KEGG pathway enrichment of coding genes in L.paracasei L-2318
在碳水化合物活性酶的6大分类中,糖苷水解酶是催化裂解淀粉分子中葡萄糖苷键最主要的酶类[24],在碳水化合物活性酶相关基因注释中占比最高(43.12%)。糖苷水解酶被进一步划分为包括GH4、GH13和GH31等在内的19个亚家族(图7-b)。值得注意的是,GH31与GH4、GH13家族共涉及12个编码基因(表3),占糖苷水解酶相关编码基因的25.53%,这些基因与α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)和α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)的编码相关。据此推测,L.paracasei L-2318的淀粉水解酶系理论上主要由上述3类酶构成。研究表明,α-淀粉酶、普鲁兰酶与α-葡萄糖苷酶在淀粉与糊精的逐级分解中发挥着关键作用[25]。α-淀粉酶专一性切割淀粉分子内部的α-1,4-糖苷键,可将直链与支链淀粉断裂为寡糖片段[26];普鲁兰酶能特异性水解支链淀粉和糖原中的α-1,6-糖苷键,为外切酶创造更多作用位点[27];α-葡萄糖苷酶则作用于麦芽糖等二糖以及糖链非还原末端的α-1,4-糖苷键,释放出葡萄糖[28]。在客家黄酒酿造中,淀粉质原料的水解依赖上述多种淀粉水解酶的特异性催化与协同作用。
a-6类蛋白质家族注释基因数量;b-GHs亚家族注释基因占比
图7 L.paracasei L-2318编码基因的CAZy数据库注释统计
Fig.7 CAZy database annotation statistics of coding genes in L.paracasei L-2318
实际上,在黄酒酿造的糖化阶段,核心淀粉水解酶系中通常包括葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)作为确保淀粉彻底转化为可发酵糖的主力外切酶,其相关基因的缺失揭示了L.paracasei L-2318淀粉水解酶系的缺陷。然而,在实际的黄酒酿造中,葡萄糖淀粉酶主要依赖酒曲中的霉菌或酵母提供。因此,葡萄糖淀粉酶的缺陷并不直接影响L.paracasei L-2318作为功能菌株协同促进高效糖化的潜能。综上,L.paracasei L-2318在客家黄酒酿造过程中具备合成丰富淀粉水解酶系的潜能,有助于淀粉质原料的高效水解与转化。
表3 基于CAZy数据库注释的L.paracasei L-2318淀粉水解酶相关基因
Table 3 Starch hydrolase-related genes in L.paracasei L-2318 based on CAZy annotation
基因编号GHs亚家族相关淀粉酶L-2318001238GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318002311GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318002316GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318002401GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318002402GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318002978GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318000572GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318000787GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318001233GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318001234GH13α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)、α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318000570GH31α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)L-2318003006GH4α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)
2.5 L.paracasei L-2318产淀粉酶功能的验证
为验证L.paracasei L-2318是否具备水解淀粉的生理功能,在以淀粉为唯一碳源的培养基中进行初步验证。结果如图8所示,与空白对照相比,接种L-2318菌株后培养液的OD600nm值极显著升高(P<0.001)。这表明L.paracasei L-2318的淀粉酶相关基因得以表达,使其具备利用淀粉作为生长碳源的能力。区别于乳酸菌偏好利用简单糖类的普遍认知[29-30],L.paracasei L-2318作为高产GABA的功能菌株,其兼具的产淀粉酶特性构成了其在发酵微生态中的独特竞争优势,有望在黄酒酿造的糖化阶段参与淀粉质原料的协同水解。
图8 L.paracasei L-2318在淀粉培养基中的生长情况
Fig.8 Growth of L.paracasei L-2318 in starch medium
注:***表示差异极显著(P<0.001)。
3 结论
本研究对从传统客家黄酒酒药中分离筛选出的高产GABA功能乳酸菌L.paracasei L-2318进行全基因组功能注释,系统解析了其在淀粉质原料代谢方面的遗传特征。结果显示,该菌株基因组中富含参与淀粉水解过程的关键基因。通过CAZy数据库注释,共发现了12个与淀粉水解酶相关的功能基因,并由此推测L.paracasei L-2318可能具备包含α-淀粉酶、普鲁兰酶和α-葡萄糖苷酶在内的淀粉水解酶系。该遗传特征揭示了其作为功能菌株在客家黄酒发酵过程中辅助促进淀粉高效水解的潜能,初步生理实验也验证了其水解利用淀粉的能力。后续研究将基于基因组信息的预测,重点开展L.paracasei L-2318淀粉酶系的解构,并在模拟黄酒发酵体系中验证其代谢功能。同时,拟结合转录组学技术,系统揭示该菌株在不同发酵阶段的代谢活动规律,进一步明确其在客家黄酒淀粉质原料糖化过程中的具体贡献。综上所述,本研究通过对L.paracasei L-2318基因组的系统分析,初步阐明了其在客家黄酒淀粉质原料水解方面的遗传基础,为利用该菌株进行黄酒功能发酵剂的开发与应用提供了理论依据,并为优化酿造工艺及推动微生物资源高值化利用提供科学支撑。
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