红曲色素(Monascus pigments,MPs)因色泽鲜艳及生理活性丰富(抗肿瘤、抗癌、降血脂等)得到广泛应用。此外,MPs在医药和化妆品行业也展现出商业化应用潜力[1]。提高MPs产量的策略主要包括菌株筛选/改造、发酵工艺优化及外源添加物利用等[2]。如高浓度葡萄糖胁迫可能增加红曲菌细胞膜流动性及通透性,进而促进黄色MPs的生成[3]。然而,过高的渗透压会破坏细胞完整性,导致大分子结构(如蛋白质)受损,并干扰代谢网络等关键生理过程[4]。
通常,微生物通过提升K+水平、合成或吸收环境中的相容性溶质应对渗透胁迫[4]。丝状真菌通过积累甘油、多元醇等相容性溶质并激活高渗甘油途径维持渗透平衡,以防水分流失[5]。前期研究结果表明,培养基中甘油质量浓度为300 g/L时可显著提升MPs的产量。此外,当甘油质量浓度为160 g/L时,丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1的生长以及合成MPs的关键基因MpPKS5(聚酮合酶基因)、mppR1(MPs生物合成激活剂)、MpigI(转录因子基因)、MpFasA2(脂肪酸合酶基因)和MpFasB2(脂肪酸合酶基因)表达水平显著提升[6]。此外,转录组分析结果表明,甘油可通过加速糖酵解和碳代谢提升合成MPs的底物质量浓度,进而提升MPs的产量[7]。
本研究以NaCl作为阳性对照,分析了甘油渗透胁迫对红曲菌生长、细胞状态和代谢途径的影响,探究甘油在促进红曲菌合成MPs过程中作为碳源、渗透物和相容性溶质的多角色协同作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
丛毛红曲菌(Monascus pilosus)MS-1(CCTCC M2013295,中国典型培养物保藏中心),在市售红曲米样品中分离获取。此外,MS-1为专利菌株(ZL 2013103785894)。葡萄糖、琼脂、甘油、蔗糖、盐酸、谷氨酸钠、无水乙醇、NaOH、KCl、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO4、NaCl、基准NaCl(纯度≥99.8%)、乙酸(分析纯)、甲醇、甲酸(LC-MS级),梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;L-2-氯苯丙氨酸(纯度≥98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DNS(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;乙腈(LC-MS级),Merck公司;磷酸(色谱纯),国药集团化学试剂有限公司;甘油标准品,上海麦克林生化科技股份有限公司;MK标准品,Sigma公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260 HPLC、7890B高效气相色谱仪,安捷伦科技有限公司;UV-1900紫外分光光度计,日本岛津有限公司;Anke TJL-18G-C离心机,上海安亭有限公司;HZQ-F160振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;BCM-1300A生物洁净工作台,苏净集团安泰公司;LRH-80生化培养箱,武汉恒苏净科学仪器有限公司;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥机,武汉恒苏净科学仪器有限公司;Motic BA200显微镜,北京普瑞赛司仪器有限公司;Quanta520扫描电子显微镜,TESCAN公司;F-4500荧光分光光度仪,日立高新技术公司;DW-86L626超低温冰箱,青岛海尔生物医疗股份有限公司;Centrifuge 5427R冷冻离心机, eppendorf公司;Waters UPLC Acquity I-Class PLUS超高效液相色谱、Waters UPLC Xevo G2-XS QTOF高分辨质谱,百迈客生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 培养基的配制
PDA培养基(g/L):称取去皮土豆200 g切成1 cm×1 cm×1 cm小块加蒸馏水煮沸约20 min。纱布过滤,蒸馏水定容至1 000 mL。加入20 g葡萄糖和20 g琼脂粉溶解。pH自然,121 ℃灭菌20 min。
基础培养基(g/L):蔗糖60、谷氨酸钠10、MgSO4·7H2O 0.25、K2HPO4 1.0、KCl 0.5、FeSO4 0.05,调节pH值至5.5。
发酵培养基:在基础培养基的基础上,调整培养基中渗透物质量浓度分别为40 g/L甘油、12.69 g/L NaCl(与40 g/L甘油等渗)、160 g/L甘油和50.77 g/L NaCl(与160 g/L甘油等渗),基础培养基及上述4种培养基在代谢组学分析中分别被标记为1、2、3、4和5。渗透压的计算基于范特霍夫定律[8]。
1.3.2 甘油渗透胁迫对发酵液pH值、生物量和MPs产量的影响
孢子悬液的制备、接种和培养、发酵液pH、生物量、MPs的检测按照先前建立的方法进行[7]。分别在发酵的第3、6、9、12、15天取样分析并设置3个生物学重复。分离发酵液与菌丝体,将发酵液在25 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min,上清液用于胞外MPs的分析。准确称取0.3 g干燥并研磨后的菌丝体粉末,加入5 mL体积分数75%乙醇溶液。在室温下超声波处理1 h后,在25 ℃、8 000 r/min离心10 min,所得上清液用于胞内MPs的测定。采用紫外分光光度计分别在505、460、390 nm波长下测定吸光度。MPs色价的计算如公式(1)～公式(3)所示:
发酵液色价/(U/mL)=A×N
(1)
菌丝体色价/(U/g)=A×N×V1/m1
(2)
总色价/(U/g)=(发酵液色价×V2+菌丝体色价×m2)×1 000/V3
(3)
式中:A,吸光度;N,稀释倍数;V1,提取液体积;V2,发酵液体积;V3,培养基体积;m1,用于提取的菌丝体干质量;m2,菌丝体干质量。
1.3.3 MS-1发酵产物中蔗糖及甘油的监测
发酵液和菌丝体中蔗糖和甘油的测定样品同测定MPs的样品。蔗糖酸化形成还原糖后,采用DNS法测定还原糖。精确吸取5 mL样品,加入1 mL 6 mol/L的HCl溶液,在(80±2) ℃的恒温水浴中加热10 min。冷却至室温后,用6 mol/L的NaOH溶液中和该混合物,直至颜色变为浅橙色(以甲基红为指示剂)。然后,用水定容至100 mL并混匀。水解前后的差值乘以相应的系数即为蔗糖含量。甘油监测采用HPLC法,配有火焰离子化检测器,色谱柱为石英毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm)。进样量0.5 μL,柱流量1 mL/min(氮气/氢气各30 mL/min),分流比35∶1,进样口温度280 ℃,检测器温度300 ℃。初始阶段120 ℃恒温(持续5 min),随后以30 ℃/min的速率升温,直至达到290 ℃。
1.3.4 甘油渗透胁迫对MS-1细胞膜通透性及完整性的影响
采用已建立的方法对脂肪酸进行检测[9]。采用配有火焰离子化检测器和DB-Wax毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm)的HPLC分析脂肪酸。
采用紫外分光光度计测定发酵液中DNA和RNA的泄漏量评估细胞膜完整性。先用100 g/L NaOH溶液和体积分数1%乙酸溶液调节发酵液的pH值至7.0,检测波长为260 nm和280 nm[10]。由于不同组间干细胞量差异较大,采用单位质量菌丝体的吸光度评估细胞膜的损伤程度。
1.3.5 甘油对MS-1代谢组数据的影响
将红曲菌在1.3.1节中的5组培养基中培养6 d后,分离菌丝体与发酵液。用生理盐水(9 g/L NaCl,0.5 ℃)将菌丝体充分洗涤至流出液无色。将发酵液在4 ℃、8 000 r/min离心10 min,收集上清液。将上清液与菌丝体以液氮快速固定,置于-80 ℃保存[11]。发酵液和菌丝体样品分别标记为“W”和“N”。
称取50 mg菌丝体,加入1 000 μL含有内标(20 mg/L)的提取液(甲醇乙腈水体积比=2∶2∶1)中,涡旋振荡30 s,再进行研磨处理(45 Hz,10 min)和超声波处理(10 min,冰水浴)。吸取100 μL发酵液,与500 μL含相同内标的提取液(甲醇乙腈体积比=1∶1)混合,涡旋振荡30 s后,冰水浴超声处理10 min。
菌丝体与发酵液均在-20 ℃静置1 h,随后在4 ℃、12 000 r/min离心15 min。取500 μL上清液至离心管并冷冻干燥。干燥后的样品用160 μL提取液(乙腈水体积比=1∶1)复溶,涡旋振荡30 s,再于冰浴中超声波处理10 min。再在4 ℃、12 000 r/min离心15 min后,取120 μL上清液转移至2 mL进样瓶中。为实现质量控制(quality control,QC),从每个样品中各取10 μL混合,用于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析。
1.3.6 发酵液与菌丝体的LC-MS分析
该分析采用超高效液相色谱系统联用质谱仪。使用Acquity UPLC HSS T3色谱柱(1.8 μm×2.1 mm×100 mm),进样量为1 μL[12]。在正离子与负离子2种电离模式下,流动相均由A 0.1%(体积分数)甲酸水溶液和B 0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液组成。梯度洗脱程序设定如下(以下均为体积分数):98% A/2% B(0～10 min)、2% A/98% B(10～13.1 min)、98% A/2% B(13.1～15 min)。流动相流速为0.4 mL/min。采用双碰撞能量(2 V以及10～40 V梯度),扫描频率为0.2 s。毛细管电压在正离子模式下为2 500 V,在负离子模式下为-2 000 V,锥孔电压30 V。离子源温度100 ℃,脱溶剂气温度500 ℃,反吹气流速50 L/h,脱溶剂气流速800 L/h。质荷比的采集范围50～1 200。
1.3.7 代谢物的鉴定及多变量统计分析
使用MassLynx V4.2软件对采集的原始数据进行处理。先采用Progenesis QI v4.0软件进行峰提取与峰对齐。在Progenesis QI v4.0软件中,利用METLIN数据库、Npatlas数据库、YMDB数据库以及百迈客自建库,对处理后的数据进行物质鉴定。同时,进行理论碎片识别,母离子与碎片离子的质量数偏差分别控制在100和50的范围内[12]。再经过去冗余、过滤、补值、归一化等操作,得到从正负离子模式下获取的所有整合代谢物数据。利用KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/),对已鉴定的代谢物进行代谢通路富集分析。
在Origin 2022软件中,采用无监督多变量分析方法——主成分分析,对发酵液、菌丝体及QC样品进行全面代谢谱分析。通过组内与组间样品的离散程度,评估组内重复性、组间差异性及仪器稳定性。采用正交偏最小二乘判别分析多变量统计方法,分析各组间的整体代谢差异。结合正交偏最小二乘判别分析结果、t检验和FC值筛选差异代谢物,筛选标准为FC≥2或FC≤0.5、P<0.05且变量重要性投影值(variable importance in projection,VIP)≥1。通过层次聚类分析对筛选出的差异代谢物进行可视化呈现,并利用KEGG数据库分析预测其富集的代谢通路。
1.3.8 数据分析
本研究均设置3个生物学重复,结果以“平均值±标准差”表示。使用SPSS 26软件进行统计分析,先进行单因素方差分析,随后采用Tukey’s-b(K)法进行多重比较事后检验,统计学显著性设定为P<0.05。
2 结果与讨论
2.1 甘油渗透胁迫对发酵液pH值、生物量和MPs产量的影响
由甘油和NaCl诱导的渗透压胁迫可促使发酵液pH值降低,该pH值与甘油质量浓度呈负相关,且始终维持在6.0～7.0(图1-a)。甘油代谢产生的小分子酸降低了发酵液的pH值,这有利于MS-1的生长。随着NaCl质量浓度的增加,MS-1的生物量(图1-b)和MPs产量(图1-c)下降,这可能是渗透失衡和Na+的细胞毒性造成的[13]。然而,MS-1的生物量与甘油质量浓度呈正相关,其生物量随甘油质量浓度的增加而显著增加(P<0.05)(图1-b)。在甘油质量浓度为160 g/L时观察到MS-1出现二次生长现象。MPs产量在160 g/L甘油作用下显著提升(P<0.05),并在发酵至第6天达到1 921.14 U/L,较对照组提高1.02倍(图1-c)。推测是甘油作为碳源、相容性溶质和渗透物的协同作用[14]。有趣的是,MPs产量峰值提前且主要分布在胞内(数据未列出),这可能是MPs被用于抵御渗透胁迫且MPs更偏向存在pH偏高的环境造成的[6-7]。
2.2 MS-1发酵产物中蔗糖及甘油的监测
甘油与NaCl对红曲菌利用蔗糖的影响与生物量变化趋势基本一致(图2-a)。随着NaCl质量浓度的升高,蔗糖消耗量下降,而甘油提升了蔗糖的利用率。在与160 g/L甘油等渗的NaCl胁迫下,第3天检测到细胞内蔗糖积累现象,而甘油处理组中未见此现象(图2-b),这与甘油作为真菌常用相容性溶质的结论一致[4]。在发酵过程中,细胞外甘油逐渐被MS-1利用(图2-c)。在甘油质量浓度为160 g/L的处理中,胞内甘油质量浓度在第6天达到峰值,且发酵6 d后菌丝体内甘油积累浓度为(0.266±0.133)～(0.711±0.013) g/g(图2-d)。结合图2-a、图2-c的结果,推测红曲菌抵御渗透胁迫主要靠在胞内积累甘油而非蔗糖,并提升了能量利用效率[15]。这与甘油和蔗糖不仅可被微生物用作碳源,还是微生物常用的相容性溶质的结论一致[4]。
a-发酵液的pH值;b-生物量;c-总色价
图1 甘油渗透胁迫对MS-1的pH值、生物量和MPs产量的影响
Fig.1 Effects of glycerol osmotic stress on pH, biomass, and MPs production of MS-1
a-蔗糖利用情况;b-细胞内蔗糖含量;c-甘油分布;d-细胞内甘油含量
图2 发酵过程中MS-1对蔗糖和甘油的利用情况
Fig.2 Utilization of sucrose and glycerol by MS-1 during fermentation
2.3 甘油对 MS-1 膜通透性与完整性的影响
MS-1的膜脂质组成以饱和脂肪酸(C12∶0、C16∶0、C18∶0)和不饱和脂肪酸(C16∶1、C18∶1、C18∶2、C18∶3)为主要成分(图3-a),该结果与已有报道一致[16]。研究发现,渗透压尤其是NaCl诱导的渗透压对脂肪酸比例产生显著影响,但脂肪酸的种类基本不变(图3-a)。随着NaCl质量浓度的提升,不饱和脂肪酸和不饱和指数的比例显著上升(P<0.05)(图3-a和图3-b)。不饱和脂肪酸指数的升高,反映出细胞膜流动性与通透性的增强[3]。这与红曲菌属在高糖发酵和高糖协同高盐胁迫条件下不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例(不饱和/饱和)增加的情况一致[3,16]。部分细胞结构破坏有利于提高膜通透性及MPs向胞外分泌。甘油对MS-1细胞膜通透性的影响仅在发酵的第9～12天显现(图3-b)。甘油缓解了渗透压胁迫引起的膜损伤,从而提高生物量和MPs产量。
对照组发酵液中DNA与RNA含量在第12天出现显著升高(P<0.05)(图3-c和图3-d),这可能是菌丝自溶造成的。NaCl渗透胁迫加剧了细胞膜完整性的损伤,而添加甘油则维持了较高的细胞完整性,表明甘油具有渗透保护作用。
a-脂肪酸组成;b-不饱和脂肪酸指数;c-单位质量菌丝体细胞质内DNA泄漏量;d-单位质量菌丝体细胞质内RNA泄漏量
图3 甘油渗透胁迫对MS-1膜通透性和完整性的效应
Fig.3 Effects of glycerol osmotic stress on membrane permeability and integrity of MS-1
2.4 甘油渗透胁迫下MS-1的代谢谱分析
共检测到21 417个峰,成功注释出2 441种代谢物。主成分分析证实该仪器具有良好的稳定性,且样品呈现较好的重复性,并能清晰区分发酵液与菌丝体代谢物(图4-a)。代谢物类型的鉴定取决于渗透物的种类与质量浓度:渗透物类型主要影响发酵液代谢物,而渗透物质量浓度则主要影响菌丝体代谢物。MS-1在160 g/L甘油处理和与160 g/L甘油等渗NaCl处理下呈现不同的代谢谱(图4-b和图4-c)。
a-总主成分分析;b-发酵液的主成分分析;c-菌丝体的主成分分析
图4 发酵液、菌丝体和QC的主成分分析
Fig.4 Principal component analysis of fermentation broth, mycelia, and QC
注:1-对照组;2-40 g/L甘油组;3-与40 g/L甘油等渗的NaCl组;4-160 g/L甘油组;5-与160 g/L甘油等渗的NaCl组(下同)。
基于正交偏最小二乘判别分析模型的可靠性[如电子版增强出版(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044672,下同)附图1和附图2所示],遵循FC≥2或FC≤0.5、P<0.05且VIP≥1的标准筛选差异代谢物。组间显著差异表达的代谢物主要分布于氨基酸代谢、核苷酸代谢、脂质代谢、碳代谢、辅因子代谢、萜类与聚酮类代谢等路径。这些代谢差异在层级聚类图中呈现(图5及电子版增强出版附图3-A～附图3-E)。功能注释(KEGG模块map00230和map00240)揭示高质量浓度甘油处理组富集了与核糖核苷酸降解及DNA合成通路相关的代谢物。与此相反,NaCl质量浓度升高抑制了DNA合成/降解及RNA合成/降解通路(电子版增强出版附图3-A)。
高质量浓度甘油及NaCl可显著改变碳代谢。与对照相比,甘油组富集了糖酵解(葡萄糖-1-磷酸、β-D-葡萄糖-6-磷酸)、磷酸戊糖通路(D-葡糖酸-6P)及三羧酸循环(苹果酸、延胡索酸)的中间产物。160 g/L甘油处理组(N1 VS N4)对磷酸戊糖通路的促进作用最强(图5、图6)。该通路可抑制紫色红曲菌(Monascus purureus)CGMCC3.894中黄色MPs合成,提高橙色与红色MPs得率[17]。与甘油处理相反,NaCl抑制了MS-1中的三羧酸循环,导致苹果酸、延胡索酸和2-酮戊二酸水平降低(图5、图6)。苹果酸和延胡索酸是影响MPs合成的关键中间体。外源添加苹果酸和延胡索酸可显著提升红色MPs的产量,同时抑制黄色与橙色MPs的得率。三羧酸循环途径受抑制提示MPs合成过程中能量供应减少且氧化还原反应被扰乱[18]。甘油和NaCl提升了乙酰辅酶A-乙酸激酶途径中乙酰磷酸的丰度,该途径是乙酰辅酶A合成的关键代谢路径。
图5 MS-1发酵液和菌丝体中与碳代谢相关的差异代谢物的相对丰度
Fig.5 The relative abundance of differential metabolites related to carbon metabolism in fermentation broth and mycelia of MS-1
注:红色-上调;蓝色-下调;白色-无变化(下同)。
图6 渗透胁迫下碳代谢和氨基酸代谢影响MPs产生的关联性分析
Fig.6 The analysis of the correlation between carbon metabolism and amino acid metabolism under osmotic stress and their impact on MPs production
注:半圆-40 g/L甘油组;圆-160 g/L甘油组;三角-与40 g/L甘油等渗的NaCl组;菱形-与160 g/L甘油等渗的NaCl组。
KEGG分析(map00230/map00240)显示,高质量浓度甘油可富集核苷酸降解和DNA合成通路中的代谢物,并对核苷酸代谢产生剂量依赖性效应。然而,增加NaCl质量浓度则抑制了DNA和RNA的合成及降解通路(附图3-A)。甘油及其等渗NaCl对辅因子代谢的影响几乎相同。与对照组相比,2种处理均增加了核黄素代谢相关代谢物,但NaCl对代谢物多样性的调节作用更广泛(附图3-B)。在胁迫条件下,多种微生物都能产生核黄素,它是黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的前体[19]。KEGG通路分析(map00760)显示,W1与W2/W4/W5的比较始终增强了NAD+的合成。更高的渗透压(处理组4～5)泛酸盐和辅酶A生物合成途径有上调作用。泛酸/辅酶A通路通过辅酶A反应耦合生酮氨基酸的脱氨基与脱羧基作用生成乙酰辅酶A[20]。
高质量浓度NaCl或甘油改变了谷氨酸/精氨酸/脯氨酸代谢中的功能模块(如电子版增强出版附图3-C和图6所示)。推测160 g/L甘油通过增强组氨酸代谢中谷氨酸合成促进精氨酸和脯氨酸代谢。渗透胁迫降低了N-乙酰-L-谷氨酸-5-半醛丰度(精氨酸合成途径)并促进了脯氨酸向丙酮酸的转化(处理组4和5)。高质量浓度NaCl或甘油调节了赖氨酸合成/降解途径(附图3-C、图6)。赖氨酸代谢物参与乙酰辅酶A生成,除与40 g/L甘油等渗的NaCl处理组外,其他各组均观察到该途径的激活。增强的赖氨酸生物合成通过激活氧化还原代谢提高微生物胁迫耐受性,从而降低活性氧水平并增加氧化应激抗性[21]。值得注意的是,不同甘油质量浓度促进了酪氨酸降解为丙酮酸/富马酸(乙酰辅酶A生成)或多巴胺(激活cAMP信号)(附图3-C、图6)。160 g/L甘油通过多巴胺积累增强了cAMP通路转导(附图3-C、图6)。该通路与细胞壁完整性和菌丝自溶相关,其激活还提高了MPs,特别是黄色MPs的产量[22]。
渗透胁迫抑制了脂质代谢中不饱和脂肪酸(花生四烯酸、亚油酸、α-亚麻酸)的代谢,减少了乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的消耗。鉴于乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A是脂质和MPs合成的共同前体,这有利于MPs的生成[23]。较高的渗透质量浓度(处理1与4和1与5相比)对花生四烯酸和α-亚麻酸代谢的抑制作用更强(附图3-D)。甘油增强了类固醇和初级胆汁酸的生物合成,同时消耗了乙酰辅酶A和丙酮酸(附图3-D)。
大环内酯类化合物的合成需要丙二酰辅酶A和由缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸衍生的代谢物。在甘油作用下,只有(2S)-甲基丙二酰辅酶A水平升高,这直接与缬氨酸的降解相关,而其他消耗丙二酰辅酶A的代谢物则减少。甘油对12-/14-/16元大环内酯合成的抑制作用略强于等渗NaCl(附图3-E);同时,萜类骨架生物合成为类固醇生成提供了必需代谢物。不同质量浓度NaCl处理富集了甲羟戊酸与法尼基半胱氨酸(类固醇合成代谢物),同时降低了可用于MPs生物合成的乙酰辅酶A可用性(附图3-E)[24]。
3 结论
甘油可显著提升MPs的产量。本研究通过理化指标结合代谢组学分析,探究甘油在红曲菌合成MPs过程中的作用机制。结果表明,160 g/L甘油可显著提升红曲菌MS-1的MPs产量,影响过程包括以下3个方面:a)生物量提升与胞内甘油积累发挥渗透保护功能,维持膜完整性;b)通过渗透适应促进黄素腺嘌呤二核苷酸、NAD(P)H、乙酰辅酶A及丙二酰辅酶A的合成;c)经由上调碳代谢与氨基酸代谢增强前体供应。甘油同时发挥碳源、渗透调节剂和渗透保护剂作用,有望通过协同甘油多角色优化红曲菌次级代谢产物产生。后续研究中,可采用多组学技术明确甘油精确调控碳代谢流分配,特别是乙酰辅酶A向MPs合成等方面开展深入研究。
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