大豆作为我国重要的粮油兼用经济作物[1],富含蛋白质、油脂以及钙、磷、铁等多种矿质元素,但其部分营养成分需经加工处理方能被人体有效利用。发酵工艺是提升大豆营养价值的关键技术手段,其中豆豉作为我国四大传统发酵大豆制品[2],因独特的风味特征而成为日常膳食中的重要调味品。豆豉的生产主要包括原料前处理、制曲和后发酵3个过程,前处理通过浸泡、蒸煮破坏大豆细胞壁结构,为后续微生物生长创造适宜环境。制曲借助微生物代谢降解大分子物质。后发酵通过微生物与酶协同作用将大分子产物转化为游离氨基酸、有机酸、醇类等风味物质与功能性成分[3]。
黄姚豆豉产自广西贺州市昭平县,是以当地特色黑豆为原料,经过精选、隔水干蒸、浸泡、复蒸、冷却、自然发酵、搓霉洗霉、压白、天然酿晒、陈仓发酵等10余道工序历时3个月酿制而成,工序更复杂且所需时间更久。黄姚豆豉的独特酿造工艺主要体现在其发酵与压白的环节。发酵过程中的独特之处在于对霉房温度与湿度的控制,能够更好地让黑豆在发酵阶段自然地长出青白色菌丝。而压白,也称为二次发酵,其独特之处则是将洗好的豆豉半成品放入垫着稻秆和荷叶或桐油树叶的大
中进行,不添加任何调料,这一过程大约持续7 d至足够火候。然而,黄姚豆豉的特殊工艺如何影响其营养成分与矿物质的变化尚不得而知。在豆豉的发酵过程中,蛋白质的转化过程是其品质形成的保证。蛋白质会被微生物产生的蛋白酶分解成较小的肽和氨基酸[4],而豆豉中的蛋白质、氨基酸、多肽等含氮物质组成了总氮含量。因此,总氮含量可以反映豆豉中蛋白质和氨基酸的总量。同时,总氨基酸是评估豆豉营养价值的一个重要指标,其能调节蛋白质、脂肪和糖的代谢,维持机体稳定。且氨基酸的总量是微生物吸收的主要营养源之一,显著影响发酵动力过程[5-6]。综上,通过系统研究黄姚豆豉总氮和总氨基酸的变化规律能够为优化豆豉营养和品质提供科学依据。
矿质营养是维持人体功能的关键组分,其参与机体的多种代谢过程,促进人体生长发育、维持中枢神经系统的完整性以及参与机体的免疫应答等重要生理功能[7-9]。大豆虽富含矿物质,但其矿物营养的生物可利用性受到多种限制。其中豆类中含有丰富的植酸类物质会干扰多种矿物质的吸收[10-11]。例如,大豆中的钙、铁与植酸结合形成不溶性复合物,导致约70%的钙无法被人体吸收以及铁吸收率仅为7%。豆豉作为发酵豆制品,可通过发酵工艺提升矿物质含量和利用率。然而,现有研究侧重于研究豆豉的理化指标[12-13]、风味物质[14]和微生物群落变化[15]等方面,如周芳等[16]在对永川豆豉固态发酵过程中抗氧化活性变化的研究中发现,经过固态发酵后永川毛霉型豆豉的抗氧化活性得到显著提高。而覃业优等[17]的研究证实晾曲96 h是浏阳豆豉传统曲霉型工艺的关键优化节点。以上研究表明发酵工艺对豆豉品质和风味有显著的提升作用。此外,目前对黄姚豆豉的研究不足,仅有李惠静等[18]比较了3种不同的菌种保藏方法对黄姚豆豉中枯草芽孢杆菌的影响,发现超低温磁珠保藏法在保持菌种活性、形态学和生化特性方面效果最佳。以及吴汇等[19]对阳江和黄姚黑豆豆豉的香气组分及感官进行差异分析,揭示了黄姚豆豉的关键香气组分及感官特征。但是,由于缺乏对黄姚豆豉酿造过程中的植酸与矿物质的相互关系的系统研究,制约其传统工艺的标准化提升。
本研究通过测定黄姚豆豉自然发酵关键时间节点的理化性质、营养成分、矿物质与植酸含量、总抗氧化能力的变化,揭示各指标的动态规律,探索矿物质与植酸的相互关系,以期为黄姚豆豉品质稳定提升与生产工艺优化提供数据支持和理论依据。
1.1.1 材料
本试验所有材料于2024年7月于广西壮族自治区贺州市昭平县黄姚镇杨晋记豆豉作坊(24°14′N,111°11′E)进行采集。
1.1.2 试剂
NaClO溶液、(NH4)2SO4,广州牌化学试剂;四水合钼酸铵、四水合酒石酸钾钠,国药集团化学试剂有限公司;钼酸铵,山东科源生化有限公司;亚硝基铁氰化钠,上海强顺化学试剂有限公司;2,4-二硝基酚,山东西亚化学科技有限公司;抗坏血酸,北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;总抗氧化能力试剂盒、氨基酸含量测定试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司。
HWS-12电热恒温水浴锅、DHG-9625A电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;1510酶标仪,美国Thermo Fisher公司;ME104E电子天平、FE20 Plus实验室pH计,瑞士Mettler-Toledo公司;5407低温离心机,德国Eppendorf公司;DW-86L726G超低温冰箱,海尔集团;XKL0211 PCR仪,广州欣凯莱生物技术有限公司;MK200-4干式恒温器,北京德耳斯仪器有限公司;7420030冻干机,美国LABCONCO公司。
1.3.1 样品采集
为了动态监测豆豉的矿物质及营养成分等指标的变化情况,分别在黑豆原料、第1次发酵第5天、第1次发酵第7天、压白第2天、压白第8天、陈仓发酵期、豆豉成品7个不同加工时期收集豆豉样品,每个处理取4个重复,真空冷冻干燥后将样品研磨成粉末,置于超低温冰箱-80 ℃保存备用。如图1所示。
1.3.2 理化指标测定
pH值的测定:取2 g粉碎后的样品加5 mL去离子水混匀后使用pH计直接测定。
图1 黄姚豆豉的加工工艺及采样点
Fig.1 Processing technology and sampling points of Huangyao Douchi
水分含量测定:采用直接干燥法,将粉碎后的样品包于烘干后的滤纸中,在110 ℃的烘箱中烘干4 h,称取烘干前后样品的质量,计算含水量。
1.3.3 氮磷含量测定
植物样品使用浓硫酸-过氧化氢消煮法进行消煮后,使用苯酚次氯酸盐法[20]测定全氮,钼锑抗比色法测定全磷[21]。
1.3.4 其他矿物质测定
称取0.05~0.2 g研磨后的样品,采用干灰化法处理样品,待样品灰化完全且冷却后加入4 mL 6 mol/L HCl溶液摇匀,待样品充分溶解后,将溶液移至50 mL容量瓶中,然后用二级水定容至刻度线,最后用原子吸收光谱仪测定消煮液中的钙、镁、铁等养分浓度。
称取0.1 g经研磨的样品于50 mL样品管中,少量水润湿后加入5 mL硝酸、3 mL盐酸和2 mL氢氟酸,旋紧瓶盖后放入超声波清洗仪中,在超声波功率400 W和水浴温度70 ℃条件下超声波浸提2 h。消解完成后,将样品管置于赶酸仪中加热至近干,加入5 mL 50 g/L硫脲溶液,再用0.8 mol/L稀硝酸溶液,定容至50 mL后进行原子荧光分析测定硒和硫的养分浓度。
1.3.5 植酸含量测定
使用微量化的铁沉淀法测定样品植酸含量,参考张倩雯[22]方法并进行适当调整。取0.05 g样品,加入1 mL 0.4 mol/L HCl溶液,打样,15 000 r/min离心5 min取500 μL上清液,重复15 000 r/min离心5 min,取200 μL上清液作为原始样品提取液,96孔pCR板中加入15 μL纯水和30 μL 0.2 mol/L HCl溶液再加15 μL原始样品提取液,离心后加入120 μL 0.2 g/L硫酸铁铵溶液,盖好盖子,99 ℃加热30 min,冰浴10 min,再离心。最后取80 μL至酶标板,加入120 μL 0.11 mol/L硫基乙酸显色剂放摇床10 min,用酶标仪在519 nm波长下读取吸光度,重复3次取平均值。植酸含量计算如公式(1)所示:
(1)
式中:R,植酸含量,mg/g;m,根据标准曲线计算得到的稀释6倍后提取液中植酸含量,μg/mL;V,提取液总体积,mL;M,样品质量,g。
1.3.6 总氨基酸含量、总抗氧化能力测定
按照试剂盒说明书测定总氨基酸含量、总抗氧化能力。总氨基酸:称取约0.1 g样品,加入1 mL试剂一进行室温匀浆,8 000×g,4 ℃离心10 min,取200 mL上清液转移到1.5 mL EP管中,加入200 μL试剂二盖紧后(防止水分散失)置于沸水浴15 min,冷却至室温后待测;总抗氧化能力:称取约0.1 g组织,加入1 mL提取液进行冰浴匀浆,然后10 000×g,4 ℃离心10 min,取上清液,置冰上待测。
数据采用软件Excel 2021进行整理,SPSS 26.0计算“平均值±标准差”,运用Duncan检验法检验数据在0.05水平上的显著性,采用Origin 2025绘图及主成分分析和相关性分析。
黄姚豆豉的原料为广西昭平县的黄姚小黑豆,整体呈椭圆形状,颜色乌黑发亮、籽料均匀饱满(图1)。其基本性质为单粒长度12.39 mm,宽度11.26 mm,蛋白质含量19.49%,百粒重13.89 g。
a-pH值;b-含水量
图2 黄姚豆豉制作过程中pH值和水分含量的变化
Fig.2 Changes in pH and moisture content during the different brewing steps of Huangyao Douchi
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
由图2-a可知,在豆豉酿造阶段,豆豉样品的pH值逐渐下降,由原料阶段的6.15降低至压白阶段的5.19,下降幅度达16%,之后保持平稳直至成品阶段。微生物代谢产生的有机酸、脂肪水解脂肪酸以及蛋白质在酶的作用下分解为游离氨基酸、小肽和核苷酸等物质都会导致pH值下降[23]。进一步试验结果表明,豆豉水分含量在不同酿造阶段发生显著变化。从原料阶段到压白阶段,豆豉水分含量从2.8%迅速增长至31%,增长了10倍。而从压白阶段到陈仓发酵阶段,水分含量骤降至3.4%,最后成品的含水量稳定在5.96%。一般豆豉在发酵过程中,水分会不断蒸发,加上微生物在生长和代谢过程中以及酶在催化大分子物质分解过程中都会消耗水分导致豆豉含水量不断下降[24];但黄姚豆豉在第1次发酵过程中含水量不断上升,在压白阶段(第2次发酵)含水量不断下降,其原因可能与发酵的温度、环境和工艺有关。
综上,黄姚豆豉的pH值和水分含量发生显著变化时期均为压白阶段,而pH值和水分含量对豆豉发酵过程中的微生物活性、品质和养分指标变化等均有不同程度影响。因此,合理管控压白阶段工序对豆豉酿造过程中的品质把控具有重要意义。
a-氮浓度;b-总氨基酸含量
图3 黄姚豆豉制作过程中营养成分的变化
Fig.3 Changes in nutritional components during the different brewing steps of Huangyao Douchi
如图3所示,氮浓度由黑豆原料阶段的37.04 mg/g上升到发酵阶段的48.09 mg/g,增幅约30%。但在压白阶段回落后骤升至成品阶段的44.23 mg/g,从原料阶段到成品阶段显著上升了19%。黄姚豆豉的总氨基酸含量则呈现先升后降的动态变化,氨基酸含量从黑豆原料的5.86 mg/g逐渐上升至压白8 d阶段的87.35 mg/g,涨幅约14倍,陈仓阶段小幅回落至豆豉成品的68.24 mg/g;豆豉成品比黑豆原料增长了约10倍。在第1次发酵过程中,总氨基酸含量的增加主要是由于微生物分泌的蛋白酶通过水解使蛋白质转变成多肽和氨基酸,加之水分蒸发,这些因素共同使得豆豉的总氨基酸含量在制曲阶段上升[25-26]。然而在后发酵时期,由于微生物代谢消耗氨基酸使氨基酸含量呈下降趋势。
由图4可知,黄姚豆豉酿造过程中磷浓度的变化由黑豆原料的4.89 mg/g上升至陈仓发酵阶段的8.99 mg/g,最后成品阶段回落至7.53 mg/g,豆豉成品比黑豆原料显著增加了54%。钾浓度从原料阶段的16.19 mg/g经过发酵迅速富集,在发酵5 d达到峰值20.44 mg/g,增幅约26%,随后逐步下降到成品阶段的15.04 mg/g,成品较原料降低了7%。钙浓度从黑豆原料的2.52 mg/g经发酵迅速上升并维持到压白前期,最大值出现在发酵5 d阶段的3.71 mg/g,压白阶段回落并维持至豆豉成品的3.03 mg/g,成品比原料上升约20%。镁浓度从原料阶段的2.29 mg/g在发酵5 d时期上升了约29%至最大值2.95 mg/g后缓慢回落,并稳定至豆豉成品的2.84 mg/g,豆豉成品比原料显著上升了约24%。硫的浓度在发酵过程中呈剧烈变化,由原料的2.88 mg/g上升至发酵5 d阶段的3.26 mg/g,后呈波动变化趋势,最终在豆豉成品阶段为3.36 mg/g,成品比原料增加17%。铁的浓度从黑豆原料的0.29 mg/g在发酵7 d阶段下降到最低值的0.27 mg/g,而压白阶段逐渐上升至陈仓发酵阶段的0.52 mg/g达到峰值,增幅在80%左右,之后回落至成品阶段的0.4 mg/g,成品比原料显著增加了38%。锰浓度的变化趋势与铁相似,成品和原料的锰浓度无显著差异。锌的浓度变化比较平稳,整个酿造过程中仅在发酵7 d阶段下降了17%左右,而压白阶段回升并一直维持至豆豉成品阶段的0.07 mg/g,与原料无显著差异。铜在酿制过程中,分别在发酵和压白阶段都经历了骤增骤降,先从黑豆原料的0.044 mg/g骤增1.3倍至发酵7 d阶段的0.1 mg/g;而后压白前期降至0.04 mg/g后在骤增至压白8 d的0.1 mg/g又迅速下降并维持至豆豉成品的0.048 mg/g,成品与原料无显著性差异。钠浓度则是从原料至成品呈小幅波动下降趋势,黑豆原料的0.22 mg/g分别在压白2 d和陈仓发酵阶段下降了27%左右至最低值0.16 mg/g,而豆豉成品又回升至与原料无显著差异。硒在发酵过程中快速从黑豆原料0.06 mg/g富集到0.12 mg/g,增长了约1倍,而压白阶段迅速下跌并维持至成品阶段的0.08 mg/g,豆豉成品比原料显著上升了33%左右。综上,从酿造工艺上分析,11个元素的变化规律各不相同,其中发酵阶段对钾、钙、镁、硫、钠、硒的富集有较大影响,而压白则对磷、铁、锰、铜的积累起到关键作用,因此推测黄姚豆豉特色的发酵和压白工艺对提高豆豉的矿物质的吸收效率有重要意义。
有研究指出,大豆在发酵前富含多种抗营养因子,如植酸盐、单宁和皂苷。这些物质不仅显著降低了钙、镁、铁、磷等矿物质及营养成分的生物利用率,还会抑制关键酶的活性。发酵过程中,植酸酶、多酚氧化酶和单宁酶等发酵微生物的活性发生变化,导致植酸盐和单宁酸含量下降[27]。与此同时,大豆中的可溶性矿物质含量增加2~3倍,其生物利用率提高了30%~50%[28]。从黄姚豆豉的矿质元素变化来看,豆豉发酵提高了磷、铁、钙、镁、硫、硒这6个元素的利用率,降低了钾元素的利用率;而锰、锌、铜、钠 4个元素的成品与原料无显著差异。这可能与植酸含量的变化以及元素之间的协同或拮抗关系有关,可通过相关性分析进行深入分析。
a-磷含量;b-钾含量;c-钙含量;d-镁含量;e-硫含量;f-铁含量;g-锰含量;h-锌含量;i-铜含量;j-钠含量;k-硒含量
图4 黄姚豆豉制作过程中矿物质的变化
Fig.4 Changes in minerals during the different brewing steps of Huangyao Douchi
由图5可知,黄姚豆豉在酿造过程中,植酸含量在黑豆原料通过发酵富集后逐渐下降,最高峰值出现在发酵5 d阶段的8.38 mg/g,而后压白阶段迅速下降直到维持在成品豆豉的4.02 mg/g左右,下降了约52%。植酸长期以来被认为会干扰矿物质吸收,植酸在蒸煮及烹饪加工过程中稳定,也不受挤压等物理作用影响,但发酵能降解植酸,天培发酵中微生物分泌的植酸酶能部分水解植酸。抗氧化能力和植酸呈现相反的趋势,黑豆原料7.88 μmol Trolox/g经发酵阶段不过下降至最低值5.01 μmol Trolox/g,压白阶段迅速上升后保持至成品阶段的10.98 μmol Trolox/g,比黑豆原料增长了39%左右。在发酵过程中,微生物代谢产生的酶(如蛋白酶、多酚氧化酶等)可分解大豆中的蛋白质和多酚类物质,生成具有抗氧化活性的小分子化合物,如多肽、酚酸等,因此发酵过程中,豆豉的抗氧化能力随发酵时间的延长而增大[29]。通过对豆豉植酸含量和抗氧化能力的变化特征进行详细分析,结合理化性质和矿质元素等,为传统豆豉发酵工艺的改进和科学化酿造工艺的发展提供了关键的数据支撑。
a-植酸含量;b-总抗氧化能力
图5 黄姚豆豉酿造过程中植酸含量和总抗氧化能力的变化
Fig.5 Changes in phytic acid content and total antioxidant capacity during the different brewing steps of Huangyao Douchi
图6-a展示的是在豆豉发酵过程中,矿物质的消长与抗营养因子植酸之间的相关性分析,解释了“营养可利用性提升”的潜在机制。植酸与磷呈现极显著的负相关,这表明在豆豉发酵过程中,植酸的分解直接释放了与它结合的磷,而植酸与锰、铁呈显著的负相关,说明植酸通过螯合铁和锰等,释放有机酸,促进矿物质溶解,从而提高了这些矿物质的可利用性。植酸与硒、镁、钙等矿物质间存在显著正相关,说明植酸可能与矿物质结合形成不溶性复合物,降低可利用率。此外,矿物质之间,如钙与镁、硫与铁、铜与硒存在较强的正相关关系,说明这些矿质元素间可能存在相互促进的协同作用;而磷与钾、硒、铁与铜、钠之间存在较强的负相关关系,说明这些元素在豆豉发酵的过程中存在竞争或拮抗作用。
a-相关性分析;b-主成分分析
图6 黄姚豆豉发酵过程中矿物质与植酸的互作网络
Fig.6 Interaction network of minerals and phytic acid during the different brewing steps of Huangyao Douchi
注:*P≤0.05 **P≤0.01 ***P≤0.001。
由图6-b可知,主成分分析的前两轴分别解释了豆豉理化性质、矿物质与植酸含量的39.6%、23.1%。驱动发酵阶段与其他阶段产生分异的主控因素是pH值、含水量、植酸、矿质元素钾和硒;而驱动压白与陈仓发酵阶段的主控因素是抗氧化能力以及矿质元素磷和锰。发酵过程中,微生物,如霉菌、细菌等分泌的植酸酶能够将植酸水解为肌醇和磷酸盐[28]。这一过程不仅降低了植酸的含量,还增加了可溶性矿物质的含量,提高了矿物质的生物利用率[30]。植酸的减少和可溶性矿物质的增加,为发酵豆制品提供了更好的营养基础。矿物质铁、铜、锌等是许多抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等的组成成分,这些酶在抗氧化过程中发挥重要作用[31]。发酵过程中产生的生物活性肽、异黄酮等物质也具有显著的抗氧化能力。这些物质通过清除自由基、螯合金属离子等机制,进一步增强了发酵豆制品的抗氧化活性[32]。了解矿质元素之间的相互关系以及它们与植酸和总抗氧化能力的关系,可以帮助优化豆豉的发酵工艺,以提高其营养价值和功能性。
本研究证实了黄姚豆豉在发酵过程中包括磷、钙、镁、硫、铁和硒等矿物质的生物利用率提升,同时植酸含量显著降低,这些变化与豆豉品质提升密切相关。此外,黄姚豆豉发酵过程中的理化性质变化,包括pH值的阶段性下降、水分蒸发、蛋白质水解与氨基酸富集以及矿物质的逐步释放等过程共同促进了豆豉的营养品质形成。
结合酿造工艺来说,黄姚豆豉的矿物质提升以及植酸的降解,并非由单一的环节所致,而是“发酵-压白-陈仓”三段工艺协同作用的成果。发酵阶段是钾、镁、硫、硒富集速率最快的时期,建议保留原工艺“隔水干蒸→自然冷却→不洗霉”操作,以维持菌丝完整性,减少矿物质流失;而压白阶段是水分骤降,矿物质浓缩的关键窗口,可优化工艺如堆高垫层,确保氧气供应,避免氧矿化受阻,有利于提高铁、铜的溶出率;最后陈仓阶段通过日晒-夜露循环促使水分进一步蒸发,抗氧化能力提升,若采用吸热更快的工具可使日间豆温升高,缩短陈仓周期而不损失矿物质。通过植酸降解和矿物质的变化规律制定工艺优化策略,可为黄姚豆豉工艺的现代化、标准化及高营养化提供可复制的技术路径。
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