后发酵茶渥堆过程优势微生物酶活性对茶叶不同形态氟的影响

氟是人体必需的微量营养元素,适量摄入有助于预防龋齿、维护牙齿健康[1]。然而,过量摄入可能导致氟中毒,主要表现为牙釉质和骨骼的病理性能改变[2],严重时可能与高血压[3]、神经系统损伤[4]以及智力发育迟缓[5]等健康问题相关。因此,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)建议饮用水中氟浓度应维持在0.5～1.0 mg/L,最高不超过1.5 mg/L[6]。

茶树具有显著的氟富集特性,在相同生长条件下,茶叶中的氟含量可达其他植物的10～20倍[7]。氟含量与茶叶嫩度呈负相关,即随着叶片成熟度增加,氟含量逐渐升高[8]。由于采摘标准和加工工艺的差异,不同茶类的氟含量存在显著区别,绿茶一般为5～350 mg/kg,红茶为24～457 mg/kg,而黑茶(属后发酵茶)则高达113～637 mg/kg,为各类茶中氟含量最高者[9]。黑茶因其独特的风味品质广受消费者喜爱,但长期大量饮用可能带来氟摄入过量的风险,进而引发慢性氟中毒。

后发酵茶是以较为粗老鲜叶(一芽五、六叶)为原料,经杀青、揉捻、渥堆及干燥等工序制成的一类特殊茶品[10]。在渥堆过程中,微生物群落结构复杂且动态演变,核心菌群包括曲霉、酵母、芽孢杆菌和冠突散囊菌等,不同阶段由特定微生物主导,协同调控茶叶生化代谢过程,促进品质形成[11]。

已有研究表明,通过纯种发花实验,冠突散囊菌的出发菌株与诱变菌株可使黑毛茶中游离氟含量分别提高7.94%和10.47%,同时证实其菌丝体具备吸附游离态氟的能力[12]。微生物分泌多种胞外酶,催化茶叶内含成分发生酶促反应[13],主要包括纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶和多酚氧化酶等,这些酶的活性随发酵过程中的温湿度变化而动态调整[14]。多酚氧化酶可通过Cu2+与多酚底物中特定官能团的相互作用,促进电子转移,导致酚环结构的特定化学键断裂,从而引发底物的氧化反应[15]。张雨萱等[16]发现,复合酶浸提可改善红茶品质,并提高速溶红茶中硒的含量。王东等[17]在茶园土壤中施用酶制剂后,显著降低了茶叶中Pb、Cd和Hg等重金属的积累。利用共振拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱等技术,已证实茶叶过氧化物酶血红素活性中心存在Fe3+与Fe2+之间的价态转化[18]。课题组前期研究显示,渥堆过程中微生物群落与氟形态之间存在显著相关性[11],但优势微生物如何调控氟形态转化机制尚不明确。

本研究以湖北青砖茶(后发酵茶代表性产品)为原料,选取实验室前期分离筛选出的优势微生物进行接种发酵试验,将其接种至晒青毛茶进行人工渥堆,并与自然渥堆样品对比,系统分析优势微生物发酵过程中各形态氟含量的动态变化,结合微生物产酶能力,揭示优势微生物对后发酵茶中氟形态转化的影响机制,旨在通过调控氟的存在形式降低其生物可利用性,从而减少人体氟摄入风险,为后发酵茶的安全生产提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用茶叶原料为福鼎大白茶的一芽五叶至六叶嫩梢,经杀青、揉捻及晒干工艺制成的晒青毛茶,由湖北洞庄茶叶有限公司提供;HCl、HNO3、高氯酸,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PF-202-L氟离子复合电极,上海仪电科学仪器股份有限公司;TGL-16台式高速冷冻离心机,浙江明德仪器有限公司;HH-6智能数显恒温水浴锅,上海越众仪器设备有限公司;YMMD-65立式压力蒸汽灭菌锅,上海三申医疗仪器有限公司;CHA-S恒温振荡器,常州金坛良友仪器有限公司;UV-480紫外可见分光光度计,尤尼克上海仪器有限公司;DHG-903385电热恒温干燥机、SPX-80B5H生化培养箱,上海新苗医疗器械制造有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;Nicolet iS5 傅里叶变换红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 实验方法

以晒青毛茶为原料,添加适宜的水分,置于室温下渥堆发酵,发酵时长为49 d,不同渥堆阶段茶样取自湖北洞庄茶叶有限公司开展的渥堆大生产的不同阶段。每7 d取样1次,共取样7次,分别记作W-7、W-14、W-21、W-28、W-35、W-42、W-49,其中原料记作W-0,取样后置于-20 ℃冷冻保存用于后续分析。

1.3.2 后发酵茶渥堆过程中不同形态氟含量分析

参照文献[19]对茶粉进行连续分级提取,依次获得水溶性氟(Ws-F)、可交换态氟(Ex-F)、铁锰结合态氟(Fe/Mn-F)、有机束缚态氟(Or-F)和残渣态氟(Res-F),取不同渥堆阶段的茶粉2 g,按序加入相应提取剂进行处理,总氟(T-F)的提取操作与残渣态氟的提取方法相同。

氟含量测定:分阶段所得上清液溶液,测量其体积后,准确移取25 mL提取液,等体积添加25 mL总离子强度调节缓冲剂(total ionic strength adjustment buffer,TISAB),充分混合均匀,以氟离子复合电极读数,计算如公式(1)所示:

式中:X,样品中氟含量,mg/kg;A,测定液中的氟含量,mg/L);A0,空白液中的氟含量,mg/L;V,测试液总体积,mL;M,样品质量,g。

1.3.3 渥堆茶样及优势微生物酶活性分析

优势微生物酶活性初筛:试验所用菌种分离自后发酵茶的渥堆阶段,由本课题组前期研究[20]通过16S rRNA和ITS序列扩增鉴定,并保藏于本实验室,分别编号为X-1(登录号:KP340123)、X-101(X60637)、X-104(MG986217)、X-105(KM853034)、HQ(FJ810502)、QM(EU301633)、JM(EF426246)和JH(JQ743649)。蛋白酶与淀粉酶的初筛培养基参照宋曦等[21]的方法制备;纤维素酶培养基依据毛晓霞等[22]的方法配制;果胶酶培养基采用姜立春等[23]的方法制备;多酚氧化酶培养基根据王洁等[24]的方法配制;过氧化物酶使用愈创木酚培养基[25]筛选。

渥堆茶样及优势微生物酶活性复筛:参照罗燕[20]、潘雪莉等[26]的方法进行酶活性检测。

1.3.4 优势微生物对不同形态氟含量分析

不同氟形态提取:方法参考1.3.2节,对未渥堆茶粉(原料)进行分阶段提取,提取液浓缩至一定体积后,冷冻干燥,-20 ℃保存。

优势微生物复合酶对氟形态运用:细菌(LB液体培养基)和真菌(PDB培养基)各1 L,分别添加冷冻干燥后的不同氟形态于液体培养基中,分装相同体积,灭菌冷却后,接种活化后的优势微生物于含氟培养基中,以未接菌组记为CK,28 ℃、180 r/min摇床培养3 d,离心取上清液检测氟含量。

1.3.5 优势微生物对茶叶氟形态影响

优势微生物菌悬液的制备:在无菌条件下,将优势微生物接种在相对应的液体培养基中,28 ℃ 180 r/min摇床培养,离心取沉淀,收集菌体,用无菌水稀释为1×105CFU/mL菌悬液,备用。

优势微生物渥堆样品制备:称取相同体积晒青毛茶为原料,加入已经制备好的微生物菌悬液,使其发酵含水量达到65%左右,于室温条件下渥堆49 d,每7 d取样1次,分别以X-1、X-101、X-104、X-105、HQ、QM、JM、JH系列进行编号,如接种细菌X-1的渥堆茶样第7天取样时,编号为X-1-7,其余依此类推,取样置于-20 ℃条件下保存,用于后续分析茶叶中不同氟形态变化情况。

1.4 统计分析

使用Graphad Prism 9.5.1及Origin 2024绘制。利用t检验对数据进行统计分析,定量结果均为“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 后发酵茶渥堆过程中不同形态氟含量分析

采用不同的溶剂对茶叶中不同氟形态分阶段依次提取,分别为水溶性氟、可交换性氟、铁锰结合态氟、有机束缚态氟、残渣态氟5种不同形态的氟,结果如图1所示,水溶性氟W-0阶段含量最低,随着渥堆过程的持续推进氟含量逐渐的增高,在W-14阶段时,水溶性氟含量最高,为(44.65±1.00) mg/kg,增长43.02%,随后水溶性氟含量呈现下降趋势,在后期逐渐趋于稳定;可交换态氟含量在W-0阶段含量最高,为(9.22±0.72) mg/kg,随着渥堆过程的推进含量逐渐降低;铁锰结合态氟在渥堆的前期(W-0～W-21)含量变化较少,到W-21后含量逐渐升高,在W-35含量达到最高,为(7.96±0.30) mg/kg,增幅可达到110%,随后逐渐下降并趋于稳定,与水溶性氟含量变化相似;有机束缚态氟含量在渥堆过程中含量整体波动变化,从W-0的(15.21±0.21) mg/kg降至W-14的(9.32±0.32) mg/kg,降幅为38.73%,后续含量略微上升,残渣态氟含量较少,在W-21时含量最高,为(2.18±0.08) mg/kg;此外,水溶性氟在5种形态氟中比重最高,占比为总氟含量的51.52%～69.09%,其次是有机束缚态氟(14.42%～25.10%)和可交换态氟(9.11%～15.21%),残渣态氟比重最少,仅为1%左右。不同渥堆阶段氟形态整体上表现为此消彼长的情况,推测在渥堆过程中氟形态在微生物作用下发生一定程度的变化,促使其形态发生一定程度的变化[27]。

2.2 后发酵茶渥堆过程中酶活性分析

如图2所示,蛋白酶,淀粉酶随着渥堆的持续推进酶活性逐渐升高,在渥堆的第35天(W-35)时达到最高,分别为(183.80±3.31)、(69.43±1.49) U/mL;果胶酶和多酚氧化酶在渥堆初始阶段W-7含量最高,随后酶活性显著降低,呈现波动式的变化,其中果胶酶活性最高为(334.60±8.22) U/mL,增幅达到868.45%;纤维素酶活性在渥堆阶段的W-7～W-21酶活性处于一个相对较高的水平,酶活性可达到(1 524.00±72.52) U/mL左右,W-21～W-49酶活性较前期显著下降过氧化物酶活性在W-14～W-28渥堆阶段时无明显显著变化,渥堆中期的W-35时,酶活性显著升高,增幅为72.18%。

2.3 后发酵茶渥堆过程中不同氟形态与酶活性相关性分析

为进一步了解茶叶渥堆过程中酶活性与不同氟形态之间的关系,对两者进行相关性分析,结果如图3所示,果胶酶,纤维素酶和多酚氧化酶与总氟和水溶性氟呈正相关,其中总氟与水溶性氟和纤维素酶的相关系数分别为0.82、0.86,铁锰结合态氟与蛋白酶,淀粉酶,过氧化物酶呈正相关,相关系数分别为0.86、0.72、0.72,推测茶叶渥堆过程中酶活性的增加,可能会促进茶叶中氟的释放与转化,从而使得茶叶中总氟含量增加,进一步对其他形态氟产生影响。可交换态氟与6种酶均呈负相关,且与蛋白酶,淀粉酶的相关系数为-0.52、-0.80,表明随着酶活性升高,对应的氟含量会相应的减少;同样,不同形态氟之间也存在一定的相关性,如水溶性氟与总氟呈正相关,相关系数为0.71,与可交换态氟,有机束缚态氟呈负相关,相关系数为-0.75、-0.68。

2.4 优势微生物酶活性初筛

蛋白酶、淀粉酶、果胶酶以及纤维素酶接种在相应的培养基中根据其产酶能力产生透明水解圈,透明圈直径与产酶能力呈正相关[21-23],多酚氧化酶和过氧化物酶产酶能力具体表现在培养基中出现褐色,颜色越深说明其产酶能力强[24-25]。如表1所示,细菌X-101在蛋白酶和淀粉酶培养基中的透明圈最大,分别为(2.80±0.40)cm(图4-a)和(2.60±0.25)cm(图4-b);真菌HQ在筛选纤维素酶和果胶酶培养基中最优,分别为(3.00±0.35)cm和(3.10±0.30)cm(图4-d);细菌X-104在筛选多酚氧化酶和过氧化物酶培养基中生产颜色不一的褐色,表明该菌株有产两者酶的能力。

2.5 优势微生物酶活性复筛

进一步对优势微生物中酶活性进行定量分析,分别检测8株微生物中6种酶活性含量,结果如图5所示,蛋白酶以细菌X-105和X-104显著高于其他菌株,细菌X-105的蛋白酶酶活性最高,为(194.70±4.21) U/mL,真菌HQ酶活性最低,仅为(16.07±0.93) U/mL;细菌X-101产淀粉酶能力显著高于其他菌株,酶活性可达到(639.70±35.24) U/mL,细菌X-1、真菌HQ和JM 3株微生物产淀粉酶能力类似,酶活性在(150.00±20.21) U/mL浮动范围内,真菌QM、HQ的果胶酶和纤维素酶活性显著高于其他菌株,其中真菌QM发酵液中果胶酶可达到(1 313.01±110.80) U/mL,细菌X-105酶活性最少,仅为(44.62±10.01) U/mL;纤维素酶中真菌HQ的酶活性最高,为(898.42±28.54)U/mL。细菌X-104的多酚氧化酶和过氧化物酶酶活性最高,分别为(35.12±3.05)、(19.62±1.25)U/mL,其次为X-105,酶活性分别为(13.66±1.16)、(13.30±0.81)U/mL。通过对8株微生物的不同酶活性进行复筛,酶活性与微生物培养基平板初筛结果类似。

2.6 优势微生物复合酶对不同形态氟含量分析

先前研究中发现不同氟形态与微生物之间存在一定的相关性,如总氟与芽孢杆菌属细菌呈负相关,铁锰结合态氟与酵母属真菌呈正相关[11]。为验证微生物复合酶对不同氟形态产生的影响,在添加相应氟形态的液体培养基中接种相同量的优势微生物菌体,分别检测液体培养基中氟含量情况,结果如图6所示,微生物复合酶对总氟的影响中,细菌X-104总氟含量显著低于CK中氟含量(P<0.01),其降幅为13.15%;真菌QM复合酶处理后总氟含量显著低于CK中氟含量(P<0.01),降幅为10.67%。含有水溶性氟和可交换态氟液体培养基中,添加优势微生物细菌对氟含量影响较大,其中在水溶性氟培养基中,细菌X-104复合酶处理后氟含量为极显著低于CK氟含量(P<0.001),最大降幅为19.61%;细菌X-1、X-105复合酶对可交换性氟处理后含量显著低于CK(P<0.01),细菌X-104极显著低于CK(P<0.001),两者的绝对降幅为(15.48±3.42) mg/kg,相对降幅为53.39%;真菌相较细菌来说,其氟含量变化差异甚微。铁锰结合态氟液体培养基中,真菌复合酶处理后氟含量均呈现下降趋势,显著低于CK(P<0.01),细菌X-1 与X-104复合酶处理后氟含量显著低于CK(P<0.01),其中X-1降幅可达到 50.70%;含有机束缚态氟和残渣态氟液体培养基中,优势微生物复合酶对有机束缚态氟含量变化较残渣态氟含量变化较大。

2.7 优势微生物发酵对茶叶氟存在形态的影响

将分离出来的优势微生物接种晒青毛茶,使其成为渥堆过程中占主导的优势微生物。由图7-a可知,整个渥堆进程中,细菌X-1和真菌HQ为主要渥堆菌株的茶样中,氟含量变化差异较大,而真菌JH处理后的总氟含量较稳定;对照茶样中总氟含量最高,为(130.62±9.82)mg/kg,由真菌HQ处理后的茶样总氟含量最低,为(71.28±4.23)mg/kg,细菌X-104次之;水溶性氟中,当细菌X-1为主要渥堆菌种时,氟含量的变化差异大且值不稳定,细菌X-104水溶性氟具体表现在氟含量处于一个相对于稳定的状态(图7-b),乌兰图亚等[28]将从土壤中分离出来的2株细菌再次运用到灭菌土壤中时,发现微生物对土壤氟形态的影响主要集中在水溶态氟含量上,且菌种间存在较大差异;从图7-c中可以直观发现部分优势微生物参与到渥堆过程中可交换性存在明显的差异,如QM、JM、X-104菌种为主要优势微生物的整体氟含量较高,且存在极值,最大值为(17.81±1.32)mg/kg(QM),最小值为(2.19±0.31)mg/kg(X-104);经过细菌X-104、真菌HQ和QM处理的渥堆茶样铁锰结合态氟的整体含量较其他样本波动较大,而细菌X-101、X-105以及真菌JM处理后的茶叶样本氟含量均处于较高且相对稳定(图7-d);图7-e中自然渥堆茶样CK的有机束缚态氟在渥堆过程中氟含量变化较大且存在最大值,为(24.57±1.77)mg/kg,细菌X-104, 真菌HQ、QM、JH整体含量均呈现为略低于均值;不同优势微生物处理后的渥堆茶样氟形态之间存在显著的变化,不同氟形态之间的变化趋势也不相同,推测在渥堆过程中占据主导渥堆的微生物酶促作用能够使氟形态发生一定的转化。

3 讨论与结论

本研究从3个维度探究后发酵茶渥堆过程中氟形态的变化规律:一是渥堆阶段氟形态与酶活性的动态关系;二是优势微生物的酶活性与氟形态之间的关联;三是将优势微生物接种至茶叶中并成为主导菌种后,茶叶中不同氟形态的演变特征。旨在阐明优势微生物及其产酶能力对后发酵茶中氟形态转化的影响机制。

饮茶是人体摄入氟的主要途径之一。研究表明,茶叶在冲泡过程中有24%～83%的氟能溶出至茶汤[29],在后发酵茶中,水溶性氟为5种氟形态中占比最高者,为总氟含量的51.52%～69.09%,其次依次为有机束缚态氟、可交换态氟、铁锰结合态氟和残渣态氟,该分布模式与土壤中氟形态的典型顺序存在显著差异,土壤中通常以残渣态为主,其后依次为水溶态、有机态、铁锰结合态和可交换态[30],这一差异可能源于茶叶与土壤在化学组成及理化性质上的本质不同。

后发酵茶在渥堆过程中,多种酶活性呈现动态变化趋势。蛋白酶和淀粉酶活性在渥堆第35天达到峰值;纤维素酶活性在渥堆中期维持较高的水平,最高可达(1 524.00±72.52) U/mL。刘婷婷等[31]研究发现,黑茶渥堆过程中纤维素酶活性较初期提升3.71倍,始终处于较高水平,与本研究结果一致。微生物所分泌的酶与茶叶内源酶共同参与代谢调控。分析表明,细菌普遍具有较强的蛋白酶、淀粉酶、过氧化物酶和多酚氧化酶分泌能力,而真菌在果胶酶和淀粉酶的产生方面优于细菌。朱雯等[32]从青砖茶渥堆样品中分离出的细菌具备产淀粉酶(259.28 U/mL)和纤维素酶(215.69 U/mL)的能力,与本研究中分离的细菌菌株产酶特性相符。

细胞壁是茶叶氟富集的主要部位,主要由纤维素、半纤维素和果胶构成,其中的蛋白质、多糖和果胶等生物大分子含有羧基、氨基、醛基及磷酸基团等功能基团,可通过离子配位、氢键等作用为金属离子提供结合位点[33]。相关性分析显示,果胶酶,纤维素酶与总氟及水溶性氟呈显著正相关,其中总氟与纤维素酶的相关系数达0.82,水溶性氟与纤维素酶的相关系数为0.86;而可交换态氟与过氧化物酶等6种酶均呈负相关。细胞壁修饰研究进一步表明,氟可与果胶中的氨基和羧基结合,并与部分金属元素存在显著相关性,提示果胶酶和纤维素酶可能通过降解细胞壁结构,促进茶叶水浸出物如水溶性氟等的释放[34]。

优势微生物(X-104、X-105)产生的酶处理后,水溶性氟和可交换态氟极显著低于对照组(P<0.001), WARE等[35]利用粗提植物过氧化物酶处理单氟和多氟酚类化合物,结果显示其对单氟和多氟酚类化合物均具有降解能力,并证实过氧化物酶活性与氟化物的存在形态密切相关。当优势微生物在渥堆过程中占据主导地位时,不同菌种间相同氟形态含量表现出显著差异。部分菌种(如X-101、X-104、HQ等)作为优势微生物种群时,水溶性氟含量显著低于对照组(CK,P<0.001)。朱晓静[19]研究发现,在原料品种和嫩度相同的情况下,经微生物发酵所得茶多糖及透析多糖中的氟含量低于常规发酵产品。赵增锋[36]研究认为,微生物可通过分泌胞外聚合物等方式参与氟的形态转化,影响水体中氟的形态和迁移路径。

本研究初步揭示了后发酵茶渥堆过程中,优势微生物通过分泌胞外酶参与并调控茶叶中氟形态的转化过程,为降低茶叶中氟的生物可利用性提供了理论依据,对推动后发酵茶的安全化生产具有现实意义。

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