食源性疾病是食品安全与公共卫生领域面临的主要挑战之一。大肠杆菌作为典型的食源性致病菌,已成为世界第三大食源性致病因子[1],广泛存在多种食品中。由食源性病原体引发的食品安全问题会引起大量的经济与社会资源消耗,化学合成抑菌剂曾被广泛用于保障食品安全,然而其使用也带来了一系列潜在风险,例如化学残留的潜在毒性以及耐药菌株的不断增加。因此,适时开发具备无污染、安全性和高效性等优点的天然食品抑菌剂逐渐成为研究重点[2]。
植物多酚由于具有安全性高、无化学残留、抗氧化能力强以及显著的抑菌活性等优点而受到研究者的关注[3]。核桃雄花是核桃的主要副产物,富含多酚、黄酮等多种生物活性成分,具有极高的营养价值[4],其多酚具备清除自由基、抑菌、抑制癌细胞生长的作用[5-7]。HOSSEINI等[8]表明核桃雄花多酚能降低糖尿病大鼠的血糖。WANG等[9]的研究指出,亚麻籽多酚可增强细胞膜通透性,导致胞内蛋白质泄漏、ATP含量降低及膜电位升高,进而引起细胞死亡。CAO等[10]的研究表明,表没食子儿茶素没食子酸酯对大肠杆菌有显著的抑制作用,能通过增加大肠杆菌细胞膜通透性并引发膜去极化致细菌损伤或死亡。另有研究证实,百里香酚能通过干扰致病菌蛋白质的合成与表达,影响柠檬酸代谢,从而影响细菌的生命活动[11]。综上,植物多酚尤其是核桃雄花等天然来源的多酚,凭借其强抗氧化与抑菌能力,可通过破坏细胞膜结构、影响能量代谢及蛋白质合成等多种机制,有效抑制微生物生长并发挥多种生理调节功能。
目前已有研究证实核桃雄花多酚(walnut male flower polyphenols,WMFPs)对大肠杆菌具有抑菌作用[5-6],但尚不清楚其具体的抑菌机制。为此,本研究以大肠杆菌为指示菌,从多角度系统解析WMFPs的抑菌机制。通过测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)与杀菌曲线评估其抑菌效果;采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色分析、胞内物质泄漏检测、胞外碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP/AKP)活性、电导率与zeta电位测定,以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)与丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化等多项指标,综合评价WMFPs对菌体细胞结构、细胞壁与细胞膜完整性、膜通透性及氧化应激水平的影响。本研究旨在探究WMFPs对大肠杆菌的抑菌机制,为推进核桃雄花的资源化利用及其在食品保鲜与天然抑菌剂开发中的应用提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究中选用的香玲、绿岭、辽核、豫丰品种的核桃雄花样品采摘于河南省三门峡市,幸福、三三、土核桃、185和新2品种的核桃雄花样品采摘于新疆维吾尔自治区阿克苏市。
本研究所使用的菌株材料为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)标准参考菌株,编号为ATCC 25922,由河南农业大学实验室提供。
营养琼脂、PI、电镜固定液,上海麦克林生化科技股份有限公司;ATP试剂盒、ALP/AKP试剂盒、MDA试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA),北京索莱宝科技有限公司;PBS、无水乙醇,LB培养基,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-6100紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;Synergy H1多功能酶标仪,美国赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Zetasizer Pro纳米粒度分析仪,马尔文帕纳科(中国)仪器有限公司;CJ-2DF超净工作台,天津市泰斯特仪器有限公司;S-3000N扫描电子显微镜,日本日立公司;SX-500全自动蒸汽灭菌锅,上海新朴仪器设备有限公司;振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 WMFPs的提取与测定
称取10 g核桃雄花,按1∶25(g∶mL)的液料比加入体积分数60%乙醇溶液,超声波提取30 min(45 ℃,200 W),然后抽滤取上清液。提取液经真空冷冻干燥,得到WMFPs存放于-20 ℃保存。后续使用时以体积分数50%乙醇溶液溶解WMFPs,涡旋混匀后用0.45 μm的滤头过滤除菌,得到WMFPs提取液备用。采用福林酚法测多酚含量。
1.3.2 细菌菌株和菌种活化
参照HU等[12]的方法并稍作修改,菌株首先在LB培养基中(37 ℃,200 r/min)传代培养12～14 h,然后将大肠杆菌以1∶100的体积比例接种到新的LB肉汤中,在相同条件下培养至OD600为0.25～0.30(菌株浓度为107 CFU/mL)。将培养好的菌悬液在4 ℃离心(8 000 r/min,10 min)后取沉淀,然后再加入2倍体积的LB溶解沉淀,涡旋混匀后备用。
1.3.3 抑菌活性的测定
1.3.3.1 抑菌活性验证
参照HE等[13]的方法并稍作修改,将灭菌牛津杯置于培养皿上,在培养皿中倒入含有测试菌的琼脂,待培养基凝固后取出牛津杯,向每个孔中分别加入50 mg/mL的WMFPs溶液(100 μL)。最后置于37 ℃孵育,16 h后观察并测量抑菌圈的直径。卡那霉素为阳性对照,体积分数50%乙醇溶液为阴性对照,灭菌水组为空白对照。
1.3.3.2 MIC的测定
参考HE等[13]的研究,将1.3.1节和1.3.2节处理好的WMFPs提取液与菌液按照1∶1的体积比混合,配成100 mg/mL的WMFPs母液,然后进行二倍稀释。以灭菌水作空白对照,体积分数50%乙醇溶液作阴性对照。置于37 ℃培养箱中培养12 h后取菌液,用生理盐水适度稀释后在琼脂平板上涂布,在37 ℃恒温培养箱中倒置培养16 h后进行菌落计数。以肉眼不见菌生长的WMFPs的浓度为MIC。
1.3.3.3 抑菌曲线的测定
将处理好的WMFPs提取液与菌液按照1∶1的体积比混合至终浓度分别为1/2 MIC、1 MIC及2 MIC的混合液,以灭菌水作空白对照,分别在37 ℃培养箱中培养2、4、6、8、10和12 h后取出混合液,用1.3.3.2节方法计算菌落数。
1.3.4 细胞壁完整性的测定
操作同1.3.3.3节,以灭菌水作空白对照,将混合液在振荡培养箱内培养2 h时后(37 ℃,200 r/min),将混合液按照AKP试剂盒说明书处理样品,然后用ALP/AKP试剂盒进行测定。
1.3.5 细胞膜通透性的测定
1.3.5.1 核酸、蛋白、β-半乳糖苷酶泄露率的测定
按照1.3.4节的方法,将培养好的混合液在4 ℃离心(8 000 r/min,10 min)后取上清液,同时以灭菌水作空白对照。用酶标仪测定OD260和OD405,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。
1.3.5.2 电导率、zeta电位、胞外ATP含量的测定
样品处理同1.3.4节,同时以灭菌水作空白对照。用纳米粒度仪进行电导率和zeta电位的测定。ATP含量使用ATP试剂盒进行测定。
1.3.6 ROS和MDA含量的测定
参照HU等[12]的方法并稍有修改,取1 mL培养2 h后的大肠杆菌悬浮液,以灭菌水作空白对照,4 ℃、8 000 r/min离心10 min取沉淀,后用PBS洗脱3次,在沉淀中加入10 μmol/L的DCFH-DA(1 mL),37 ℃孵育30 min。培养结束后,用PBS洗去荧光探针的影响,取100 μL重悬液加入避光的96孔板中,在488 nm激发波长,525 nm发射波长下测荧光强度。MDA含量使用MDA试剂盒测定。
1.3.7 PI染色观察
样品处理同1.3.4节,将培养好的混合液离心后用PBS洗脱3次,然后往其加入1 μL的PI染料,混匀后,在37 ℃振荡培养30 min,用PBS离心洗脱3次。取100 μL处理好的样品于避光的96孔板中,每个样品设置3个平行,在激发波长493 nm、发射波长636 nm下测荧光强度,剩余样品通过荧光显微镜观察PI染色情况,以灭菌水作空白对照。
1.3.8 细胞形态观察
参照HE等[13]的方法,用SEM观察细胞形态,电压10 kV、放大倍数10 000。同时以灭菌水代替WMFPs作空白对照。
1.4 数据处理
用SPSS 19进行显著性分析(P<0.05);Origin 2024软件用于绘图、用Adobe Illustrator 2020组图。每组实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 抑菌活性评价
抑菌圈直径可用于评价抑菌效果,抑菌圈直径越大,抑菌效果越好[14]。如图1-a所示,三三品种处理组的抑菌圈直径显著大于其他品种,达到(13.2±0.2) mm,抑菌圈直径在8～14 mm范围内表示细菌的敏感度为敏感[15],表明该品种的WMFPs对大肠杆菌有较强抑制效果。因此选用三三品种进行后续的抑菌活性及抑菌机制研究。三三品种对大肠杆菌的抑制效果最强,但其多酚含量在不同品种核桃雄花中并非最高(图1-b)。该现象可能因为抑菌效果并非单纯由多酚含量决定,更关键的是依赖于多酚的具体种类组成及不同细菌的敏感性[16]。
a-抑菌圈;b-多酚含量;c-抑菌曲线
图1 不同品种核桃雄花多酚的抑菌活性
Fig.1 Antibacterial activity of different walnut male flower varieties
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.2 MIC的测定
MIC可评价物质的抑菌能力[17]。WMFPs对大肠杆菌的抑制效果见表1,当WMFPs质量浓度为12.5 mg/mL时,无肉眼可见的菌落生长。且体积分数50%乙醇溶液对大肠杆菌无抑制效果。因此,三三品种的WMFPs对大肠杆菌的MIC为12.5 mg/mL。
表1 WMFPs对大肠杆菌抗菌活性
Table 1 Antibactrial activity of WMFPs against E. coli
对照组WMFPs溶液质量浓度/(mg/mL)生理盐水体积分数50%乙醇溶液1.562 53.1256.2512.52550100++++++++++++----
2.3 抑菌曲线
生长曲线可直观反映在抗菌物质作用下细菌数量随时间的变化动态。如图1-c所示,在12 h培养期间,与对照组相比,添加WMFPs的各实验组对大肠杆菌生长均表现出显著抑制作用。与对照组相比,经1/2 MIC浓度处理后的菌落数虽显著下降,但该浓度下的抑菌曲线整体仍呈上升趋势,且其增长趋势与对照组相似,推测此WMFPs浓度尚不足以持续抑制菌落生长。在1 MIC和2 MIC浓度下,菌落数随培养时间延长受到明显抑制,生长曲线呈下降趋势。综上,WMFPs能有效抑制大肠杆菌的增殖。
2.4 细胞壁完整性
细胞壁是微生物应对外界环境的第一道防线,其结构的完整性是保证菌体正常生命活动的关键[18],因此,AKP活性常被用于评价细菌细胞壁完整性。由图2可知,与对照组相比,经不同浓度的WMFPs处理后,大肠杆菌的胞外AKP活性增强。上述结果表明,WMFPs处理可使AKP外泄,提示WMFPs可通过增大细胞膜通透性,破坏细胞壁完整性,从而导致AKP泄漏。
图2 大肠杆菌的胞外AKP活性
Fig.2 Extracellular AKP activity of E. coli
2.5 细胞膜通透性
2.5.1 蛋白、核酸、β-半乳糖苷酶泄露
核酸与蛋白质的外泄常被视为膜结构损伤的直接反映,并作为评估膜通透性的重要指标[19]。由图3-a、图3-b可知,经不同浓度的WMFPs处理后,胞外蛋白质泄漏量分别为(9.66±0.91)、(15.33±0.90)、(27.08±0.32) mg/mL,分别是对照组的2.7倍、4.3倍和7.6倍,OD260也呈浓度依懒性上升。上述结果表明,WMFPs处理可能通过增强细胞膜通透性促使胞内蛋白质与核酸泄漏。
如图3-c所示,经WMFPs处理后,该波长下的吸光度值较对照组显著上升(P<0.05),且随着WMFPs浓度的升高,β-半乳糖苷酶活性相应增强,进一步证明WMFPs能增加细胞膜的通透性。
2.5.2 胞内ATP含量变化
ATP能参与能量储存与供给以及多种化学反应,在细胞受损或凋亡后,ATP含量会迅速下降,因此ATP水平从某种程度上反映了细胞的生理状况[20]。如图3-d所示,未经WMFPs处理的大肠杆菌的胞内ATP含量为(0.66±0.05) μmol/106 cell,而经不同浓度的WMFPs处理后,胞内ATP含量显著降低(P<0.05),分别为(0.39±0.05)、(0.20±0.03)、(0.10±0.01) μmol/106 cell。上述结果表明,WMFPs可能通过破坏大肠杆菌细胞膜的完整性,导致ATP泄漏至胞外,从而导致胞内ATP含量下降。此外有研究指出,细胞膜通透性增加会引起胞内电解质流失,进而改变ATP合成与水解之间的动态平衡,最终导致ATP含量降低[21];另有研究表明,抑菌剂处理可能影响大肠杆菌细胞膜的结构与功能,使膜电位下降和细胞去极化,从而抑制ATP的合成过程[22],这与本研究结果基本一致。
a-胞外蛋白质;b-核酸;c-β-半乳糖苷酶;d-ATP;e-电导率;f-zeta电位
图3 大肠杆菌的细胞膜通透性
Fig.3 Cell membrane permeability of E. coli
2.5.3 电导率变化
通过测定菌悬液电导率,可评估细胞膜通透性的改变。如图3-e所示,经不同浓度的WMFPs处理后,菌悬液电导率较对照组分别显著升高了7.26%、19.01%和22.69%(P<0.05)。综上,WMFPs破坏了细胞膜的完整性,增大了其通透性,使胞内大量电解质泄漏至胞外,从而引起电导率上升。
2.5.4 zeta电位变化
Zeta电位是电荷的一种体现形式,其变化与机体生理状态密切相关,可用来衡量细菌表面电荷变化情况。如图3-f所示。在1/2 MIC、1 MIC和2 MIC浓度WMFPs处理下,zeta电位绝对值分别为21.08、19.65和13.49,显著低于对照组(P<0.05)。zeta电位绝对值的降低,可能是因为多酚含有酚羟基等极性基团,这些酚羟基结构既能与细菌的脂多糖和蛋白质上的负电基团(如磷酸基与羧基)构成氢键,中和其表面负电荷,也能通过阳离子桥接改变细胞壁的电荷分布,从而导致zeta电位绝对值降低[15]。这能有效削弱细菌表面的静电排斥力,为后续膜结构破坏和物质泄漏创造条件。
2.6 细胞膜完整性
PI是一种评估细胞膜完整性的荧光染料,其只能进入受损或死亡细胞内,结合双链DNA而产生红色荧光[23]。本研究通过测定PI对大肠杆菌的染色情况,以评估细胞损伤和凋亡的情况。如图4-a～图4-d所示,未经WMFPs处理的电镜图中仅有少数菌体出现红色荧光,可能是一些自然死亡的细菌;而经1/2 MIC、1 MIC及2 MIC浓度的WMFPs处理后,样品中红色荧光强度随处理浓度的升高而显著增强(P<0.05)。进一步定量分析显示(图4-e),细胞荧光强度随WMFPs浓度增加而升高,表明菌体细胞膜去极化加剧,细胞膜损伤程度加重。
a-对照组形态;b-1/2 MIC组形态;c-1 MIC组形态;d-2 MIC组形态;e-荧光强度
图4 WMFPs对大肠杆菌细胞膜完整性的影响
Fig.4 Effect of WMFPs on the cell membrane integrity of E.coli
2.7 胞内ROS水平和MDA含量的变化
DCFH-DA探针可对细胞内ROS水平进行检测[24]。适量ROS对维持细胞正常生命活动至关重要。但当细胞受到外界胁迫时,ROS水平会异常升高,引发氧化应激[25]。如图5-a、图5-b所示,未添加WMFPs的组,ROS荧光强度与ROS相对荧光强度分别为219.67±4.51和25.43±0.52。经不同浓度的WMFPs处理后,ROS的荧光强度和ROS相对荧光强度分别较对照组增加。在2 MIC处理条件下,相对荧光强度显著高于其他组,推测与该浓度下细菌几乎完全灭活、菌落数急剧下降有关(相对荧光强度=荧光强度/菌落数)。综上,WMFPs处理可诱导大肠杆菌发生氧化应激反应,进而引起细胞不可逆损伤乃至死亡。
a-荧光强度;b-相对荧光强度;c-MDA含量
图5 大肠杆菌的ROS荧光强度、ROS相对荧光强度、MDA含量
Fig.5 ROS fluorescence intensity, relative ROS fluorescence intensity, and MDA content of E. coli
MDA是评价氧化应激水平的重要指标,当细菌因外界刺激而产生过量ROS时,细胞膜脂质双分子层中的不饱和脂肪酸会发生脂质过氧化而产生MDA,因此MDA含量可间接反映细胞膜的氧化损伤程度。由图5-c可知,对照组MDA含量为(0.43±0.19) nmol/107 cell,而经1/2 MIC、1 MIC和2 MIC浓度WMFPs处理后,MDA含量分别增至(1.51±0.19)、(2.72±0.50)、(4.95±0.28) nmol/107 cell。结果显示,随着WMFPs浓度升高,ROS与MDA含量也随之升高,表明ROS所引发的氧化应激已作用于细胞膜结构,引起膜脂过氧化损伤,进一步证实氧化应激现象的发生。细胞膜因氧化应激引起的膜质过氧化而受到损伤,从而加剧物质泄漏现象的发生。
2.8 SEM观察细胞微观结构
a-对照组;b-1/2 MIC组;c-1 MIC组;d-2 MIC组
图6 大肠杆菌的扫描电镜图
Fig.6 SEM of E. coli
SEM结果如图6所示,对照组的菌体呈完整杆状,无明显褶皱和畸变。经1/2 MIC浓度WMFPs处理后,菌体表面变得粗糙,部分细胞塌陷、萎缩及内容物外泄,细胞界限不清,并伴有细胞扭曲变形、聚集黏连等现象。当处理浓度升高至1 MIC时,细胞损伤进一步加剧,聚集程度增加,胞外糊状物质增多,多数细胞严重畸变,并出现严重的细胞破裂和融合现象。2 MIC浓度时,细胞变形与破裂融合现象更为严重,糊状物质占据主导地位,细菌几乎失去了原来的形态。结果表明,WMFPs对大肠杆菌具有显著抑制作用,且该作用呈浓度依赖性。推测其作用机制与WMFPs破坏细胞膜结构,导致内容物外泄及细胞形态改变,进而抑制细菌生长有关。
3 结论
本研究表明,WMFPs对大肠杆菌具有浓度依赖性抑菌作用。其抑菌机制主要通过双重途径实现:在物理结构上,WMFPs可破坏细胞壁与细胞膜的完整性,增加膜通透性,导致胞内蛋白质和核酸泄漏,并引起zeta电位降低与AKP活性升高;在生理功能上,WMFPs能诱导胞内ROS积累,引发氧化应激与脂质过氧化,进而加剧代谢紊乱。SEM结果进一步证实菌体出现严重破裂与内容物泄漏。综上所述,WMFPs通过破坏细胞结构与诱导氧化应激的双重作用导致细菌死亡,为其作为新型抑菌剂的开发提供了理论依据。
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