鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)为三白草科蕺菜属多年生草本植物,其常见别名包括蕺菜、岑草、折耳根,广泛分布于中国长江流域及西南地区,如四川、湖北、浙江等。其作为国家卫生部认证的药食同源资源,全株富含黄酮类、挥发油及多糖等活性成分,具有清热解毒、抗菌消炎及抗氧化等功效,在传统医药和食品领域应用广泛[1-2]。近年来,大多数关于鱼腥草的研究都集中在其药理学特性或植物化学成分上[3-4]。然而,其关键活性物质(如甲基正壬酮、槲皮素)存在挥发性强、提取效率低等问题,制约其深加工潜力[5]。此外,鱼腥草特有的腥味主要来源于其挥发性成分中的2类物质:一是具有“青草气”和“脂肪醛气”的直链醛类(如癸醛、壬醛)等[6-7],它们阈值较低,贡献了类似鱼腥的醛类气息;二是一些含硫化合物,包括可能存在的二甲基三硫醚等硫醚类物质[8]。因此,通过生物转化或风味调配技术掩盖或转化这些腥味物质,对于开发其高附加值产品至关重要。
微生物发酵是提升食药同源植物品质的有效手段。研究表明,发酵过程中菌群的代谢活动可转化底物成分,增强生物活性。例如,鼠李糖乳酪杆菌发酵鱼腥草可将其固有成分转化为甲基正壬酮(含量≥24.6%)、4-萜品醇(含量≥13.4%)等抑炎酯类化合物,显著提高抗急性炎症效果[9];紫红曲霉MF02发酵则使槲皮素含量高达177.3 μg/mL,远超传统水提法[10]。这些发现证实,微生物发酵能定向富集鱼腥草的活性成分,突破其天然成分不稳定的局限。但现有鱼腥草发酵技术研究较少,且多聚焦单一菌种发酵终点产物,对多菌种协同下的成分动态转化机制鲜有报道。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有强大的酶系(如果胶酶、纤维素酶、糖苷酶)和安全性,被广泛应用于植物基质的发酵中,能有效降解细胞壁,释放结合态酚类物质。异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)则是一类具有较强酯合成能力的非酿酒酵母,能产生丰富的芳香酯和高级醇,显著改善食品风味。本研究选择枯草芽孢杆菌S0-2与异常威克汉姆酵母Y61进行共发酵,是基于二者在前期预实验中表现出良好的共生性与协同效应,枯草芽孢杆菌通过酶解作用释放底物,为酵母提供前体物质;酵母则通过代谢转化合成风味物质,并可能反馈促进细菌的酶活力表达;类似的复合体系在其他植物发酵中已显示出协同增效的潜力[11-12],但在鱼腥草中的应用尚未见系统报道。
本研究创新性地将枯草芽孢杆菌与异常威克汉姆酵母共接种于鱼腥草液态体系,通过系统分析0～4 d内活性成分与抗氧化活性的动态变化,并结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术重点解析0～48 h(0～2 d)挥发性代谢物的演变规律。旨在揭示复合微生物发酵对鱼腥草活性成分与风味的协同调控作用,为鱼腥草高附加值产品的开发提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
微生物菌种(枯草芽孢杆菌S0-2、异常威克汉姆酵母Y61),保存于四川省农业科学院农产品加工所功能食品研究中心;本研究所用菌种均为可用于食品的菌种,其安全性符合GB 31615.2—2025《食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序》相关规定。鱼腥草(茎),市售;绿原酸、芦丁、异槲皮素、山奈酚、槲皮苷、槲皮素等(均为分析纯),上海源叶生物科技有限公司;乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、DPPH(分析纯)、ABTS(分析纯),阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-1D超净工作台,苏州净化设备有限公司;LHS-250HC-I恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;LX-800多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;1290 Infinty Ⅱ高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、7890A-5975C气相-质谱联用仪,安捷伦科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 前处理
取新鲜鱼腥草(茎),洗净,切段,称取鱼腥草50 g,加入纯净水800 g,煮沸提取1 h,经4层纱布过滤后,加入80 g白砂糖,最后补水至1 000 g,高压灭菌(121 ℃,15 min),用于微生物发酵。
1.3.2 培养基
马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth, PDB)培养基:马铃薯200 g(切条),加入1 000 mL蒸馏水,煮沸30 min,滤液补水至1 000 mL,再加入葡萄糖20 g,用于酵母菌活化。溶菌肉汤(lysogeny broth, LB)培养基:酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g,溶解于1 000 mL蒸馏水,用于细菌活化。
1.3.3 接种发酵
使用无菌生理盐水将活化后的枯草芽孢杆菌S0-2、异常威克汉姆酵母Y61分别调整菌液浓度至107 CFU/mL。按体积比1∶1同时接种于鱼腥草提取液,30 ℃发酵4 d[13]。每间隔1 d取样。
1.3.4 鱼腥草发酵液多酚类化合物测定
取1 mL样液,7 500 r/min离心8 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜过滤至进样瓶,使用HPLC法进行测定。称取绿原酸、芦丁、异槲皮素、山奈酚、槲皮苷、槲皮素对照品各20 mg,经甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶,得到2 mg/mL标准储备液,通过梯度稀释制备系列质量浓度工作液(10～200 μg/mL)。色谱条件:色谱柱 Poroshell 120 PFP(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);二极管阵列检测器(diode array detector,DAD),检测波长254、320、350 nm;柱温35 ℃;进样量5 μL;流速0.8 mL/min;流动相:体积分数为0.1%的甲酸水溶液(A),乙腈(B)。梯度洗脱程序:0～10 min,5%～10% B;10～15 min,10%～20% B;15～20 min,20%～35% B;20～30 min,35%～75% B;30～32 min,75%～95% B[14-15]。
定性定量方法:目标化合物的定性依据为其与相应对照品保留时间的一致性。各目标化合物的定量分析采用外标法,以相应标准工作溶液的浓度-峰面积绘制标准曲线进行计算。
1.3.5 鱼腥草发酵液总多酚含量测定
参照李利华[16]的方法并稍作调整。发酵液经7 500 r/min离心8 min,取上清液备用(下同)。取20 μL样液和20 μL福林酚溶液(2 mol/L)静置反应5 min,加入160 μL质量分数5% Na2CO3溶液,轻轻振荡,静置反应1 h,于波长765 nm处测定吸光度值。样液中的总多酚含量以没食子酸当量(mg GAE/g)[没食子酸质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标,得到标准曲线为y=0.004 1x+0.428 2,R2=0.999 2]。
1.3.6 鱼腥草发酵液总黄酮含量测定
参照黄春花等[17]的方法并稍作调整。取20 μL样液和15 μL质量分数5% NaNO2溶液混合,避光反应6 min,加入15 μL质量分数10% AlCl3·6H2O溶液,轻轻振荡,反应5 min,迅速加入100 μL NaOH溶液(1 mol/L),于波长510 nm处测定吸光度值。样液中总黄酮含量以芦丁当量(mg RE/g)[以芦丁质量浓度(μg/mL)为横坐标,吸光度值为纵坐标,得到标准曲线为y=0.001 1x+0.047 9,R2=0.999 5]。
1.3.7 鱼腥草发酵液抗氧化活性测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定
参照罗棵濒等[18]的方法。稀释样液为不同质量浓度(0.75、1.5、3.75、7.5、10、15、20、30、37.5、45、50、75 μg/mL)的待测液,取100 μL待测液,加入100 μL DPPH溶液[128.50 μg/mL,使用体积分数80%甲醇溶液配制并调整波长517 nm处吸光度值为(0.70±0.02)],室温反应30 min后,于波长517 nm处测定吸光度值(As)。以上述甲醇溶液为空白组(A0),甲醇溶液替代DPPH溶液为对照组(Ae),Trolox为阳性组,并测定吸光度值。DPPH自由基清除率按公式(1)计算。
DPPH自由基清除率
(1)
式中:As,待测液或阳性组吸光度值;Ae,对照组吸光度值;A0,空白组吸光度值。
1.3.7.2 ABTS阳离子自由基清除能力测定
ABTS储备液:按照1∶1的体积比将ABTS溶液(7 mmol/L)和K2S2O8溶液(2.45 mmol/L)均匀混合,暗处反应16 h。ABTS工作液:使用体积分数80%甲醇溶液稀释ABTS储备液,使得此溶液波长734 nm处的吸光度值为(0.70±0.02)。将样液稀释为不同质量浓度(同1.3.7.1节)的待测液,取40 μL待测液,加入160 μL ABTS工作液,室温反应6 min,于波长734 nm处测定吸光度值(Ar)。以上述甲醇溶液为空白组(A1),甲醇溶液替代ABTS工作液为对照组(Ah),Trolox为阳性组,并测定吸光度值。ABTS阳离子自由基清除率按公式(2)计算。
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
式中:Ar,待测液或阳性组吸光度值;Ah,对照组吸光度值;A1,空白组吸光度值。
1.3.8 鱼腥草发酵液挥发性风味物质分析
参考RUAN等[19]的方法,稍作修改。利用HS-SPME-GC-MS检测发酵液的挥发性代谢物。取发酵液2 mL置于15 mL的顶空瓶中,加入20 μL正己烷(10 μg/mL)和1 g NaCl,将顶空瓶放于60 ℃水浴锅中恒温30 min,使用120 μm DVB/CWR/PDMS萃取头插入样品顶空瓶,保温萃取15 min,于250 ℃解析5 min,经GC-MS分离鉴定。
GC条件:DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm),以高纯He为载气(纯度≥99.999%),流速1.2 mL/min,进样口温度250 ℃。程序升温:40 ℃保持3.5 min,以10 ℃/min速度升至80 ℃,然后以5 ℃/min升至150 ℃,最后以25 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。MS条件:传输线温度280 ℃;离子源为电子轰击源(electron impact,EI);离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃;电子能量70 eV;扫描模式为全扫描;质量扫描范围(m/z)35～500。
定性/定量分析:将测得的未知化合物质谱图与NIST标准质谱库(NIST 20)进行比对,选择匹配度>80%的物质,并结合色谱保留时间进行初步鉴定。为校正样品前处理及仪器分析过程中的潜在误差,采用内标法进行半定量分析。目标挥发性化合物的相对含量以“μg/mL样品,以内标当量计”表示,相对含量按公式(3)计算。
目标化合物相对含量
(3)
式中:Bh,目标化合物的色谱峰面积;Bf,内标物的色谱峰面积;Cf,加入的内标物溶液质量浓度,μg/μL;Vf,加入的内标物体积,μL;Vi,样品量,mL。
基于挥发性物质含量,物质的气味活度值(odor activity value,OAV)和相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)的计算分别如公式(4)和公式(5)所示。
(4)
(5)
式中:Ci,物质在样本中的浓度;Ti,物质的嗅觉阈值;OAVmax,所有被分析物质中最大的物质OAV。
1.3.9 感官评价标准
参考吕艳春等[20]的方法并作修改。采用定量描述分析法(quantitative descriptive analysis,QDA)对未发酵鱼腥草提取液(CK)及发酵2 d的鱼腥草发酵液进行感官品评(如表1)。招募20名(男女各半)经过初步培训的感官评价员,年龄为20～35岁,无嗅觉和味觉缺陷,均对鱼腥草风味较为熟悉。
表1 鱼腥草发酵液感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of H. cordata fermentation broth
指标评分标准与分值0～3分4～6分7～10分色泽色泽灰暗,令人不悦颜色一般,无突出印象颜色鲜亮体态浑浊,有明显沉淀微浊,略有悬浮物澄清透明腥味强度几乎无腥味有明显腥味,但可接受腥味强烈,令人不悦青草香几乎无青草气有清新的青草香青草香浓郁、突出果香几乎无果香有淡淡的果香果香浓郁、愉悦花香几乎无花香有淡雅的花香花香浓郁、持久整体可接受度难以接受可以接受容易接受
1.4 数据处理
所有试验均独立重复3次,实验结果以“平均值±标准差”表示。使用Excel 2016进行数据整理和初步计算。采用SPSS Statistics 27软件进行单因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)和组间显著性检验,显著性水平设为P<0.05。使用Origin 2022和GraphPad Prism 10.1.2软件进行图形绘制。通过迈维云平台(https://cloud.metware.cn)对挥发性代谢物分析。为有效区分不同发酵处理组间挥发性代谢物的整体差异并筛选关键差异代谢物,进行了正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 鱼腥草发酵液多酚类化合物分析
如表2所示,鱼腥草提取液(CK)主要含有多酚类物质包括绿原酸(17.16 μg/mL)、槲皮苷(18.30 μg/mL)、芦丁(9.18 μg/mL)等。其中,绿原酸、槲皮苷含量与徐杰等[21]报道结果相近,验证了本研究中原料基础成分的可靠性。发酵处理极大地促进了多酚类物质的产生,从CK组的52.90 μg/mL经1 d发酵后显著增加至67.62 μg/mL(增幅27.8%),并在第2天达到峰值166.26 μg/mL,较CK组增幅高达214%。同时,6种被检测的多酚化合物均在发酵第2天达到其含量峰值。其中,绿原酸的增长量和增幅最大(从17.16 μg/mL增至72.36 μg/mL,增幅达321%),表明它可能是微生物酶解作用的主要目标之一。槲皮苷作为基础含量最高的物质,也实现了大幅增长(从18.30 μg/mL至46.20 μg/mL)。芦丁和异槲皮苷的含量也分别增长了约138%和179%;此阶段的增长主要归因于复合微生物产生的纤维素酶、果胶酶等细胞壁降解酶,破坏了鱼腥草的植物细胞结构,使胞内多酚大量释放。同时,糖苷酶等可能将结合型多酚(如槲皮苷、芦丁等)水解,不仅增加了其自身的含量,也可能为后续转化提供底物[11]。发酵至第3天,6种多酚类物质总含量从峰值显著下降至155.25 μg/mL,并在第4天进一步下降至119.57 μg/mL。尽管第4天的含量相比CK组仍然高出126%,但较第2天的峰值已下降了28.1%。这表明发酵过程存在最优时间(在本实验中为2 d),超过该时间点,多酚的降解速率开始超过其释放速率。复合微生物发酵能有效的提高鱼腥草中多酚类物质的提取率和总量,最高可使多酚含量提升3倍以上,验证了微生物发酵作为1项高效生物加工技术的潜力。
表2 鱼腥草发酵液中6种多酚化合物含量 单位:μg/mL
Table 2 Content of 6 polyphenol compounds in H. cordata fermentation broth
化合物CK1 d2 d3 d4 d绿原酸17.16±0.38e20.16±1.23d72.36±2.02a66.36±1.12b46.88±3.18c芦丁9.18±0.54d11.88±0.42c21.90±0.56a20.90±0.45a16.28±1.01b异槲皮苷7.62±0.61e11.52±0.22d21.24±0.20a18.88±0.31b14.88±0.12c槲皮苷18.30±1.02d22.92±0.56c46.20±0.41a45.76±0.12a38.89±0.25b槲皮素0.52±0.02c0.88±0.04c2.18±0.21a2.08±0.09a1.66±0.15b山奈酚0.42±0.01d0.56±0.02d1.38±0.11a1.27±0.12b0.98±0.15c总含量52.90±2.06e67.62±3.15d166.26±3.14a155.25±4.56b119.57±3.56c
注:同行不同小写字母代表具有显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.2 鱼腥草发酵液总多酚和总黄酮含量测定结果
如图1所示,该研究通过监测鱼腥草提取液在复合微生物发酵过程中的总多酚与总黄酮含量,发现二者变化趋势高度一致,均呈现先急速上升后缓慢下降的特征,且总黄酮的增幅更为显著。这清晰地揭示了微生物发酵对鱼腥草活性成分的强烈转化作用。
发酵前期(0～2 d),总多酚含量从29.02 μg/mL大幅增至62.55 μg/mL,增幅达115.54%。这表明微生物代谢产生的酶(如果胶酶、纤维素酶)高效破坏了植物细胞壁,促进了酚酸类物质的溶出和转化。总黄酮的变化更为显著,从75.00 μg/mL骤升至217.33 μg/mL,增幅达189.77%。增幅远超总多酚,说明复合微生物发酵不仅释放了游离黄酮,更可能通过生物转化(如将黄酮苷元水解为苷类)显著增加了黄酮类物质的总量[22]。发酵第2天是该发酵过程的最高点。此时,总多酚和总黄酮含量均达到峰值,表明微生物的酶解和转化作用效益在此刻最优。且发酵2 d所得总黄酮含量(217.33 μg/mL)远超陈佩瑶等[12]采用的单菌发酵结果(91.00 μg/mL),有力证明了复合微生物菌剂在协同酶解和生物转化方面可能具有更高效、更全面的优势。发酵中后期(2～4 d),2类物质含量降低。发酵至第4天,总多酚(46.53 μg/mL)和总黄酮(188.24 μg/mL)含量仍显著高于CK组(分别高出60%和151%),证明发酵的提升效果是持续性的。而含量的下降可能与微生物对营养物质(包括已释放出的多酚和黄酮)的持续消耗有关。随着碳源减少,微生物可能将这些活性物质作为次级代谢底物进行降解利用。
图1 鱼腥草发酵液总多酚和总黄酮含量
Fig.1 Total polyphenols and total flavonoids content in H. cordata fermentation broth
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3 鱼腥草发酵液抗氧化能力分析
通过DPPH和ABTS两种体外抗氧化模型评估发现(图2),复合微生物发酵显著增强了鱼腥草提取液的抗氧化能力,且该能力的变化与多酚、黄酮等活性成分的含量呈现高度一致的正相关关系。
在发酵前期,抗氧化活性随发酵时间急剧增强。DPPH自由基清除能力:半抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)值从CK组的9.364 mg/mL大幅降低至发酵2 d的3.298 mg/mL。(IC50值越低,自由基清除能力越强),清除效率提升了约2.84倍。ABTS阳离子自由基清除能力增幅更强,IC50值从25.880 mg/mL降至9.286 mg/mL,清除效率提升了约2.79倍。此阶段的抗氧化活性增强与之前分析的总多酚(增幅115.54%)和总黄酮(增幅189.77%)含量的增加趋势一致,也说明了多酚和黄酮类物质是鱼腥草发酵液的核心抗氧化组分[23]。发酵中后期(2～4 d),DPPH自由基IC50从2 d的3.298 mg/mL上升至3 d的3.568 mg/mL和4 d的4.125 mg/mL。ABTS阳离子自由基IC50从2 d的9.286 mg/mL上升至3 d的10.242 mg/mL和4 d的11.225 mg/mL。过度发酵会导致抗氧化活性不可逆转地下降。由此说明,发酵并非时间越长越好,鱼腥草提取液发酵时间超过2 d后,虽然活性仍高于未发酵组,但已呈现下降趋势。这一发现对工业化生产中的过程控制具有至关重要的指导意义,必须精确控制发酵终点以获得最佳产品。阳性对照组采用高效合成抗氧化剂(维生素E),其抗氧化活性显著高于鱼腥草发酵液样品,符合该类对照剂的预期效能。其中,2 d组DPPH自由基IC50为3.298 mg/mL,而阳性对照组仅需9.31 μg/mL(相差约354倍);2 d组ABTS阳离子自由基IC50为9.286 mg/mL,阳性对照组为19.20 μg/mL(相差约484倍),阳性对照为小分子强效抗氧化剂,可直接提供电子或氢原子快速中和自由基;而鱼腥草发酵液中的活性成分(如多糖、酚类)可能通过协同作用缓慢清除自由基,且受基质复杂性影响,故效率相对较低。
a-DPPH自由基清除率;b-ABTS阳离子自由基清除率
图2 鱼腥草发酵液抗氧化活性
Fig.2 Antioxidant activity in H. cordata fermentation broth
2.4 鱼腥草发酵液挥发性风味物质分析
基于上述研究结果,发酵至2 d,其活性成分及抗氧化活性最佳,因此采用HS-SPME-GC-MS技术对鱼腥草发酵前期(0～2 d)样品的挥发性风味物质分析。如电子版增强出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044558,下同),鱼腥草及其发酵液中主要挥发性物质包括萜类(17.04%～22.65%)、酮类(12.14%～17.96%)、醇类(11.52%～19.65%)等,并检测到如(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二醛、8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]-3-辛醇、(E)-2-己烯醛等具有产地和部位特异性的高含量物质[24-26]。复合微生物发酵显著促进了鱼腥草提取液中挥发性风味物质的积累。总挥发性物质含量由CK组的101.872 μg/mL显著增加至第2天的143.630 μg/mL,增幅达40.97%,其中醇类、醛类和酯类物质分别增长140.63%、96.23%和60.61%,表明发酵对风味物质的生成具有极显著的促进作用。
醇类总量从11.74 μg/mL显著增至28.23 μg/mL,其中苯乙醇含量从0.015 μg/mL急剧上升至14.833 μg/mL,成为醇类增长的主要贡献者,其具有典型的玫瑰花香[27],极大改善了整体香气;endo-葑醇也从0.001 μg/mL增至0.745 μg/mL,进一步增强了花香调性。醛类总量由8.766 μg/mL增至17.192 μg/mL,其中(E)-4-壬烯醛和3-(2-呋喃基)-2-丙烯醛从无到有,分别达到5.350 μg/mL和1.519 μg/mL,贡献了突出的青香和果香[28];而(E)-2-己烯醛等原有醛类保持稳定,共同构成复杂的风味背景。酯类总量从14.521 μg/mL上升至23.320 μg/mL,其中β-乙酸苯乙酯和苯甲酸-2-丙烯酯等物质在发酵后大量生成(分别从0.002 μg/mL增至4.554 μg/mL和从0.001 μg/mL增至0.520 μg/mL),显著增强了果香和花香气味[28]。酸类总量从3.760 μg/mL稳步增至4.940 μg/mL,新增的2-戊烯酸和4-戊烯酸(第2天分别为0.465、0.462 μg/mL)为酯类合成提供前体,有助于风味的协调与平衡。酮类总量略有下降(18.305 μg/mL→17.441 μg/mL),其中1,2,3,5,6,7-六氢-1,1,2,3,3-五甲基-4H-茚满-4-酮显著减少,但其他酮类成分相对稳定,对整体风味影响较小。萜类总量为23.082～24.474 μg/mL,变化不是非常明显,其中(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二醛等关键成分含量稳定,说明鱼腥草的特征风味背景得以保留。其他类别(包括烃类与杂环化合物)也从21.720 μg/mL增至28.041 μg/mL,进一步丰富了风味的层次。综上,复合微生物发酵通过显著提升苯乙醇、(E)-4-壬烯醛、β-乙酸苯乙酯等关键香气物质的含量,初步形成了以果香、花香和青香为主的协调“发酵香”特征。这一结果为鱼腥草风味调控提供了数据支持,后续可延长发酵时间的风味监测以揭示更完整的风味演化轨迹。
为进一步分析发酵过程中挥发性风味物质动态变化,利用OPLS-DA对鱼腥草样本组进行分析,结果显示各样本组间存在显著分离(模型累计解释率R2Y=73.52%),表明鱼腥草提取液及其不同发酵时间阶段(CK、1 d、2 d)的挥发性代谢物组成具有显著差异。基于此判别模型筛选出的差异变量,进一步利用火山图进行多组间差异挥发性代谢物的比对分析。分析显示(图3-a),鱼腥草提取液发酵前期(1 d vs CK)共检测到241个代谢物显著上调,76个代谢物显著下调,结合图4-a分析,显著上调物质以酯类(如乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、苯甲酸烯丙酯)和醇类(如苯乙醇、小茴香醇)为主。发酵至2 d(图3-b),148个代谢物显著上调,267个显著下调;除酯类和醇类持续上调外,醛类(如环辛烷甲醛)和酮类(如9-癸烯-2-酮)物质亦显著富集,而部分萜类及杂环类物质呈显著下调趋势。在发酵2 d与未发酵对照的比较(图3-c)中,累计282个代谢物显著上调,223个显著下调,乙酸苯乙酯、小茴香醇、苯乙醇等酯醇类物质仍为主要上调成分,而下调物质则包括1,3,5-三噻烷、2-辛烯酸等。由此进一步分析:发酵后期阶段(1～2 d),醛类和酮类物质的显著富集,提示微生物代谢进入阶段性转化期。醛酮类通常为脂质氧化或氨基酸代谢的中间产物,其积累可能与醇脱氢酶、酮体生成相关微生物群落的功能活化有关。这一富集现象不仅丰富了风味层次——醛类贡献青草香和果香,酮类常具奶香和果香,也反映出代谢逐渐由醇、酯合成向更复杂的风味体系延伸。与此同时,部分萜类及杂环类物质含量发生降低,可能源于微生物对其进行的生物转化或降解作用。萜类物质作为鱼腥草的特征本底风味成分,其减少有助于减轻原始草药中的刺激性或腥臭味;部分杂环类物质(如1,3,5-三噻烷)的下降,也可能与微生物硫代谢或环裂解活性相关,从而进一步优化整体风味轮廓,降低不良气息。综上,鱼腥草提取液在发酵前期(0～1 d)以酯类和醇类物质的快速积累为主;至发酵后期(1～2 d),醛类和酮类显著富集,部分萜类与杂环类则明显降解,显示出微生物发酵对风味物质组成的阶段性定向调控能力:前期构筑果香酯醇基础,中后期拓展醛酮复杂度,同时削减原有不良背景风味。
a-发酵1 d vs CK;b-发酵2 d vs发酵1 d;c-发酵2 d vs CK
图3 差异挥发性代谢物火山图
Fig.3 Volcano plot of differential volatile metabolites
a-发酵1 d vs CK;b-发酵2 d vs发酵1 d;c-发酵2 d vs CK
图4 差异代谢物条形图
Fig.4 Bar chart of differential metabolites
注:横坐标为差异代谢物的log2FC(差异倍数取以2为底的对数),纵坐标为差异代谢物。代谢物含量上调与下调分别用红色和绿色表示。
基于挥发性物质ROAV的动态分析(附表2),鱼腥草及其发酵体系中共检测出112个挥发性成分的ROAV>1,酮类、醛类等物质是鱼腥草主要贡献物质。复合发酵显著改变鱼腥草关键香气物质组成,ROAV分析表明:醛类和酮类风味变化显著,青草香标志物(E)-2-己烯醛ROAV提升97.7%(CK:678.98→2 d:1 343.13),黄瓜清香物质(E,Z)-2,6-壬二烯醛保持超高贡献(ROAV>4 000),而苦杏仁异味物4-甲氧基苯甲醛ROAV减小74.8%(492.24→124.00);焦糖甜香物质5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮较为稳定,清凉薄荷香物质D-香芹酮ROAV跃升(0.01→18.25);同时,醇酯协同的感官增效,花香物质2,6-壬二烯-1-醇的ROAV增长10.6%(813.89→899.79),木香物质二甲萘烷醇显著增长(0.23→15.77),霉味物质2-甲基-3-戊醇ROAV降低81.6%(4.14→0.76),酯类中柑橘香物质月桂酸甲酯ROAV提升79.3%(19.04→34.14),奶酪味3-甲基丁酸乙酯下降74.8%(153.83→38.75)。此外,需注意的是含硫杂环物质四氢-3a-甲基-1,3-二硫并[4,5-b]呋喃(阈值仅0.06 μg/mL)ROAV显著增加(2.90→6.28),该类物质的积累可能与某些不良风味属性相关[29]。为进一步改善整体风味品质,后续工艺可考虑对发酵条件(如温度、pH、溶氧等)进行系统优化,例如适当控制发酵温度(<28 ℃),以抑制含硫不良代谢物的过度生成。总体来看,微生物发酵在显著提升鱼腥草风味复杂度与掩盖缺陷物质方面表现出良好效果,为其风味导向型发酵提供了可行的技术路径。
综上,该研究进一步揭示了其掩盖腥味的潜在机制。苯乙醇(具典型玫瑰花香)和β-乙酸苯乙酯(具果香与蜂蜜香)等酯醇类物质的大量生成,该类物质愉悦的香气特征与高ROAV,能够在嗅觉层面直接与鱼腥味物质竞争受体,从而在感官上“遮蔽”原有的不良腥味。其次,(E)-4-壬烯醛等新增的醛类物质,虽然同为醛类,但其呈现出的是更为清新的“青香”和“果香”,而非令人不悦的“鱼腥气”,这类“正向”醛香的出现,可能改变了整体醛类物质的组成比例与风味轮廓,从而改变醛类对整体风味的贡献方向。这种通过微生物代谢定向增加愉悦香气强度、同时改变不良风味物质背景构成的协同作用,是实现鱼腥草风味品质显著提升的关键。
2.5 感官评价
如表3所示,复合微生物发酵对样品的感官特性产生了根本性改善。最为关键的是,发酵后样品的腥味强度得到极显著抑制(P<0.05),同时产生了浓郁愉悦的果香与花香,这与GC-MS检测到的苯乙醇、β-乙酸苯乙酯等关键风味物质的生成规律一致。此外,发酵液色泽更加鲜亮,但体态因代谢产物导致轻微浑浊。所有这些积极的风味转变,最终使发酵样品的整体可接受度得分实现了极显著提升(P<0.05),从“难以接受”范围进入“易接受”范围。该结果直接证实,复合发酵有效掩盖了鱼腥草的不良腥味,并通过构建以果香和花香为主导的新风味轮廓,极大地提升了其感官品质。
表3 鱼腥草发酵液感官评价
Table 3 Sensory evaluation of H. cordata fermentation broth
组别色泽体态腥味强度青草香果香花香整体可接受度CK5.12±0.83b6.85±0.75a7.52±0.85a5.88±0.76b2.35±0.61b0.95±0.52b2.45±0.76b发酵2 d6.98±0.69a5.45±0.92b2.95±0.74b7.21±0.69a6.88±0.82a7.05±0.88a7.65±0.72a
3 结论
该研究通过构建枯草芽孢杆菌与异常威克汉姆酵母复合发酵体系,系统阐明了微生物发酵对鱼腥草活性成分与风味特征的协同调控机制。结果表明,该复合菌剂通过分泌一定胞外酶(如果胶酶、纤维素酶)有效破解植物细胞壁,促进了多酚、黄酮等活性物质的释放与生物转化,显著增强了提取液的抗氧化能力。风味分析进一步揭示,发酵过程动态调控了挥发性物质的合成路径:前期以酯类、醇类物质的形成为主,奠定果香与花香基底;后期则富集醛类、酮类物质,通过显著提升苯乙醇、(E)-2-己烯醛、D-香芹酮等关键风味物的贡献度,有效遮蔽了鱼腥草原有的不良腥味。然而,发酵过程中部分含硫杂环物质的积累提示未来需通过菌种选育或工艺优化进一步规避潜在风险。综上所述,本研究开发的复合微生物发酵技术不仅实现了鱼腥草活性成分的功能性转化与风味改善,也为其他药食同源植物的高值化开发提供了理论依据和技术路径。
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