鱼油含有丰富的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA,C20∶5)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA,C22∶6),是ω-3多不饱和脂肪酸的重要膳食来源,具有调节血脂代谢、抑制炎症反应及神经保护作用等多种功效,被广泛应用于功能性食品、医药制剂及膳食营养补充剂的开发[1-2]。然而,由于鱼油中富含疏水性长链脂肪酸,其在胃肠道中吸收率较低,生物利用度较差;同时,鱼油分子内共轭双键的高不饱和特性使其在加工处理及长期贮藏过程中极易发生氧化劣变与水解酸败,不仅造成产品感官品质劣化,还可能引发食品安全隐患[3]。因此,构建高效递送与长期稳定的鱼油载体系统,已成为突破鱼油应用技术瓶颈、提升其营养价值转化效率的核心研究课题,对推动食品功能成分递送技术创新具有重要意义。
乳液是一种液体以微小液滴形式(通常为0.1～100 μm)均匀分散在另一种不相溶液体中形成的胶体分散体系[4-5],水包油乳液是一种将油脂高效引入食品基质的常用策略。将鱼油制备为乳液可通过增大消化表面积、延长肠道滞留、促进淋巴转运、保护活性成分及优化释放行为等多重机制,提升其吸收性和生物利用度[6]。乳化剂具有不同的亲水亲油平衡(hydrophilic and lipophilic balance, HLB)值,存在于乳化体系的油水界面处,通过影响水油界面性质(例如电荷、疏水性、乳化)防止油滴聚结,稳定新形成的油滴[7]。蛋白质类天然乳清蛋白是乳中的可溶性蛋白质组分,主要包括β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和牛血清白蛋白,它们分别占总蛋白质含量近50%、20%和6%[8]。乳清蛋白同时含有亲水基团和疏水基团,在均质过程中可以快速吸附并扩散到油水界面,降低表面张力,形成黏弹性界面膜,在食品乳液的制备中已得到广泛应用[9-10]。脂质类天然磷脂具有的双亲结构,能快速在油水界面形成定向排列的单分子层薄膜,从而降低油水界面张力,并赋予乳液高负净电荷,从而产生高排斥力,将油滴稳定悬浮在水中,形成稳定性良好的乳浊液[11]。化学合成的柠檬酸脂肪酸甘油酯由甘油、脂肪酸和柠檬酸通过酯化反应形成,分子结构中同时含有亲水基团(如柠檬酸中的羧基)和疏水基团(如脂肪酸链),HLB值通常在4～6,这一范围使其特别适合用于制备水包油(oil/water,O/W)型乳液[12]。可见不同乳化剂类型因分子结构与作用机制不同,影响乳液界面膜的强度、电荷分布及空间阻碍效果,进而影响乳液的稳定性[13]。
均质通过高压泵将预混乳液加速至高速或超高速,迫使其通过狭窄的均质阀或微通道,在此过程中,液体在很短时间内经历高速冲击、湍流、强烈剪切和空化,将大液滴破碎为微米级甚至纳米级小液滴,从而达到提高乳液稳定性的目的[14]。JUTTULAPA等[15]研究发现通过高甲氧基果胶-大豆蛋白稳定的乳液在经过高压均质机(100 MPa)处理后尺寸较小,并表现出良好的物理稳定性。SEMENOGLOU等[16]研究均质压力对鱼油包封效果的影响发现,压力从40 MPa增加到60 MPa导致乳液的平均粒径和多分散系数均显著降低,而超过一定的阈值,平均粒径则没有显著性差异。已有研究证实均质压力会通过影响乳化剂的乳化性能,从而对乳液稳定性产生影响[17-18]。
因此,本研究分别选择具备良好亲水亲油性、天然生物相容性以及高效乳化增稳特性的蛋白质类天然乳清蛋白、脂质类天然磷脂和化学合成的柠檬酸脂肪酸甘油酯乳化剂制备鱼油乳液,探究不同乳化剂类型和均质压力对鱼油乳液粒径、澄清指数、组织形态、zeta电位和贮藏稳定性的影响,为鱼油深加工产品开发、乳液稳定性研究和加工工艺参数选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
鱼油[甘油三酯型二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid in triglyceride form,TG-EPA)>85%],四川欣美加生物医药股份有限公司;乳清蛋白,美国Hilmar公司;磷脂,美国cargill公司;柠檬酸脂肪酸甘油酯,辽宁海科食品公司;实验用水均为蒸馏水。
PL203电子精密天平,上海梅特勤-托利多仪器有限公司;T25剪切机,广州艾卡仪器设备有限公司;HomoLab高压均质机,意大利FBF公司;LUMiSizer全功能粒子分散稳定性分析仪,德国LUM公司;S3500粒径分析仪,上海弗尔德仪器设备有限公司;zetaSizer Nano马尔文电位分析仪,英国Malvern公司;H.H.SS电热恒温水浴锅,上海医疗器械三厂;DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱,上海齐欣科学仪器有限公司;YXQ-LS30SII立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅医疗生物仪器;CKX41倒置式光学显微镜,日本OLYMPUS公司。
1.2 实验方法
1.2.1 鱼油乳液的制备
参考章莹[19]的方法并稍作修改制备鱼油乳液。称取油相组分富含TG型EPA的鱼油5%(质量分数),称取乳化剂溶于油相/水相,在剪切的过程中将油相组分缓慢加至水相组分中,8 000 r/min剪切5 min制备得到初乳,然后立即用高压均质机进行均质,均质压力60 MPa,均质2次,得到均一鱼油乳液,4 ℃保存备用。
1.2.2 不同乳化剂最适添加量确定
参考DAVE等[20]及预实验结果,设置不同乳化剂添加量,乳清蛋白添加量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%(质量分数,下同),磷脂添加量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%(质量分数,下同),柠檬酸脂肪酸甘油酯添加量分别为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%(质量分数,下同),按1.2.1节的步骤制备鱼油乳液。
1.2.3 均质压力研究
称取油相组分富含TG型EPA的鱼油5%(质量分数),按1.2.2节得到的最适乳化剂添加量称量乳化剂溶于水相/油相;在剪切的过程中将油相组分缓慢加至水相组分中,8 000 r/min剪切5 min制备得到初乳,然后立即用高压均质机进行均质,设置均质压力分别为20、60、100、140、180 MPa,均质2次,制得均一鱼油乳液,4 ℃保存备用。
1.2.4 鱼油乳液外观及微观形态观察
肉眼观察乳液状态并拍照记录,所制备的乳液应形成均一稳定的乳白色液体,无絮凝、酸败、析油、分层等现象。
参考SHI等[21]的方法并稍作修改,使用光学显微镜观察鱼油乳液微观结构,将10 μL乳液滴在载玻片上,在光学显微镜下放大40倍观察。
1.2.5 鱼油乳液澄清指数的测定
LUMiSizer全功能粒子分散稳定性分析仪通过STEP技术(空间和时间消光图谱),结合光学离心法,以澄清指数(不稳定性指数)为指标评估乳液稳定性。本实验将制备的鱼油乳液样品加入至专用离心管中,要求样品达到过标线,按照粒子分散稳定性分析仪的使用说明操作,将离心管置于设定的位置后设定参数开始测定,测定结束记录样品的澄清指数。本实验仪器测定参数为:轮廓线500条,时间间隔20 min,转速3 000 r/min,温度25 ℃,光因子1。
1.2.6 鱼油乳液平均粒径和粒径分布的测定
参考于迪[22]的方法使用激光粒径分析仪测定乳液粒径,并稍作修改。严格按照仪器的操作说明使用,将乳液样品小心地滴入分散剂(蒸馏水)中,保证样品量在仪器的可测区间内,随后测量,所有样品均平行测量3次。
1.2.7 鱼油乳液zeta电位的测定
参考YAN等[23]乳液zeta电位测定方法,将鱼油乳液原液用蒸馏水稀释20倍,用马尔文电位分析仪在25 ℃下测定电位值,所有样品均平行测定3次。
1.2.8 鱼油乳液加速贮藏期外观、澄清指数和粒径变化
参考田大志[24]的方法做乳液加速贮藏实验,将鱼油乳液样品在121 ℃条件下灭菌12 min后,放置于温度为(60±2) ℃、相对湿度(relative humidity,RH)(75±5)%的加速稳定性试验箱中避光贮藏,分别于0、7、14 d时取样,观察样品外观并拍照,测定样品澄清指数和粒径的变化。
1.3 数据处理
数据整理使用Excel 2010软件进行;采用GraphPad Prism 9软件作图。图中不同的英文大小写字母表示样品组间存在显著性差异(P<0.05)。所有实验均重复3次,实验结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 不同乳化剂最适添加量确定
乳液澄清指数和粒径是评估乳液稳定性的关键指标。澄清指数与稳定性之间存在负相关关系。乳液粒径则直接描述乳液中分散相(油滴或水滴)的平均大小或尺寸分布,与吸附在水油界面的乳化剂乳化能力密切相关[25-26]。如图1-A和图1-B所示,在乳清蛋白添加量0.2%～0.8%,随着乳清蛋白的添加量逐渐升高,鱼油乳液的澄清指数和平均粒径均逐渐降低,这是由于乳液中油滴表面逐渐形成紧密的蛋白吸附层,有效抑制了油滴的絮凝和聚集[27]。当乳清蛋白的添加量增加到1.0%时,鱼油乳液的澄清指数反而升高,说明鱼油乳液的稳定性降低,可能是因为乳清蛋白的添加量过高,过量的蛋白无法在油水界面吸附,导致界面膜过厚,过厚的界面膜因分子间作用力减弱而变得松散,从而加速乳液分层或破裂。因此选择乳清蛋白添加量0.8%作为最适乳化剂添加量。
A、B-乳清蛋白;C、D-磷脂;E、F-柠檬酸脂肪酸甘油酯
图1 不同乳化剂添加量鱼油乳液澄清指数、平均粒径和粒径分布变化
Fig.1 Changes in the clarity index, mean particle size, and particle size distribution of fish oil emulsions with varying amounts of different emulsifiers
注:不同英文字母表示不同样品组间存在显著性差异(P < 0.05)(下同)。
如图1-C和图1-D所示,在磷脂添加量0.2%～1.0%,随着磷脂的添加量逐渐升高,鱼油乳液的澄清指数和粒径均逐渐降低。当磷脂的添加量为0.8%时,与磷脂添加量0.6%和1.0%的澄清指数没有显著性差异(P>0.05),图1-D粒径分布结果显示磷脂添加量为0.6%、0.8%和1%时乳液液滴粒径分布峰差异不大,这与YIN等[28]研究的关于不同磷脂类型和浓度对鱼油乳液稳定性和体外消化行为的影响结果相似。因此综合制备成本选择磷脂添加量0.8%作为乳化剂最适添加量。
如图1-E和图1-F所示,在柠檬酸脂肪酸甘油酯添加量0.4%～1.2%,随着柠檬酸脂肪酸甘油酯的添加量逐渐升高,鱼油乳液的澄清指数先降低后基本保持不变,当柠檬酸脂肪酸甘油酯添加量为1%时,乳液已经达到最佳稳定性。
2.2 均质压力对不同乳化剂鱼油乳液外观及微观形态的影响结果
采用不同均质压力(20～180 MPa)分别制备乳清蛋白、磷脂、柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液,由图2可知,各组乳液均未呈现絮凝、聚结或分层现象,全部形成了均一的乳白色鱼油乳液。采用光学显微镜进行微观形态观察,在20 MPa条件下制备的鱼油乳液可以观察到大量密集的在做布朗运动的液滴;而在60～180 MPa条件下制备的鱼油乳液,均质压力越大可见的鱼油乳液液滴越少,可能是鱼油分散成了更小、更均匀的液滴,该结果与乳液粒径分布结果一致(图3-B、图3-D、图3-F)。
图2 乳液外观和微观结构(40×)
Fig.2 Appearance and microstructure of emulsion (40×)
2.3 均质压力对不同乳化剂鱼油乳液澄清指数和粒径的影响结果
如图3-A和图3-B所示,在均质压力20～100 MPa,随着均质压力增加,乳液的澄清指数和平均粒径逐渐降低,粒径分布峰逐渐左移,可能是因为较高的压力产生较高的湍流和剪切力,导致液滴尺寸减小[15]。而升高均质压力至140、180 MPa时,澄清指数和平均粒径均有升高,均质压力180 MPa处理的乳液在1 000 nm处有液滴分布,可能是因为过高的均质压力破坏了乳清蛋白的空间结构,部分蛋白质失去表面活性剂的作用,发生聚集反而降低了乳液的稳定性。
如图3-C和图3-D所示,在均质压力20～140 MPa,随着均质压力增加,乳液的澄清指数和平均粒径逐渐降低,粒径分布峰逐渐左移。当均质压力为180 MPa时,乳液的澄清指数升高,稳定性降低,对平均粒径的影响不显著(P>0.05),可见均质压力对磷脂鱼油乳液的稳定性和粒径均有显著影响。
如图3-E和图3-F所示,在均质压力为20～180 MPa,随着均质压力增加,乳液的澄清指数先降低后保持不变,平均粒径总体呈下降趋势,粒径分布峰逐渐左移,说明制备的均质压力越大,柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液稳定性越高,乳液液滴越小。
A、B-乳清蛋白;C、D-磷脂;E、F-柠檬酸脂肪酸甘油酯
图3 不同均质压力制备的鱼油乳液澄清指数、平均粒径和粒径分布变化
Fig.3 Changes in the clarity index, mean particle size, and particle size distribution of fish oil emulsions prepared under different homogenization pressures
A-乳清蛋白;B-磷脂;C-柠檬酸脂肪酸甘油酯
图4 不同乳化剂类型鱼油乳液zeta电位值随均质压力的变化
Fig.4 Changes in the zeta potential values of fish oil emulsions stabilized by different types of emulsifiers with varying homogenization pressures
2.4 均质压力对不同乳化剂鱼油乳液zeta电位的影响结果
Zeta电位反映颗粒表面双电层的静电斥力强度,其绝对值>20 mV,表明颗粒间排斥力较强,不容易团聚,体系越稳定[29]。如图4-A所示,在均质压力20～180 MPa,随着均质压力增加,乳清蛋白鱼油乳液的zeta电位绝对值先增大后减小,均质压力为60 MPa 时zeta电位值为(-40.4±0.2) mV,随着均质压力增大,zeta电位绝对值减小,说明均质压力越大,乳清蛋白鱼油乳液液滴间表面电荷越弱,静电斥力越弱,越容易发生絮凝或聚集从而降低稳定性。
如图4-B所示,所有乳液都呈现负电荷,均质压力为60 MPa时制得的磷脂鱼油乳液zeta电位绝对值最大,为(-44.2±0.5) mV,并且显著大于其他各均质压力下的鱼油乳液(P>0.05),与RIQUELME等[30]研究结果一致。
如图4-C所示,柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液zeta电位与均质压力并不是简单的正相关或者负相关,在均质压力为180 MPa时,柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液zeta电位绝对值最大,为(-32.8±0.4) mV,与其他均质压力下的柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液zeta电位值均有显著性差异(P>0.05)。
2.5 不同乳化剂类型鱼油乳液加速贮藏期外观、澄清指数和粒径的变化结果
依据前面的实验结果,采用100 MPa制备乳清蛋白鱼油乳液、140 MPa制备磷脂和柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液,并将乳液在(60±2) ℃的加速试验箱中开展加速破坏实验,分别于第0、7和14天对乳液的贮藏稳定性进行评估。
乳清蛋白鱼油乳液结果如图5-A所示,贮藏14 d后乳液没有明显分层和沉淀,颜色出现略微发黄现象,可能是因为乳清蛋白中的氨基酸(如赖氨酸)与鱼油氧化产生的羰基化合物(如醛、酮)发生美拉德反应,生成棕色或黄色聚合物[31]。随着贮藏时间延长,澄清指数逐渐增大,乳液稳定性降低,可能是因为高温灭菌导致乳清蛋白变性水解,在贮藏过程中破坏了乳液结构,导致乳液稳定性变化。
磷脂鱼油乳液结果如图5-B所示,乳液在贮藏过程中颜色出现略微发黄,但是没有明显分层和沉淀。随着贮藏时间延长,乳液澄清指数和液滴颗粒均不断增大,说明乳液的稳定性降低。可能是因为磷脂鱼油乳液在贮藏过程中液滴表面的磷脂膜因机械应力(如振动)或化学降解而破裂,使内部油相泄漏,与其他液滴融合,导致稳定性下降,且液滴粒径增大。
A-乳清蛋白;B-磷脂;C-柠檬酸脂肪酸甘油酯
图5 不同均质压力制备的鱼油乳液贮藏0、7、14 d的外观、澄清指数和平均粒径变化
Fig.5 Changes in appearance, clarity index, and mean particle size of fish oil emulsions prepared under different homogenization pressures during storage for 0, 7, and 14 days
柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液结果如图5-C所示,乳液外观稳定,没有明显分层和沉淀。随着贮藏时间延长,乳液澄清指数和平均粒径均明显上升(P<0.05),可能是因为灭菌后放置过程中柠檬酸脂肪酸甘油酯与鱼油中的某些成分发生相互作用,在体系中聚集使乳液液滴粒径变大,稳定性下降。
3 结论与讨论
本研究选择乳清蛋白、磷脂和柠檬酸脂肪酸甘油酯不同类型乳化剂制备鱼油乳液,探究乳化剂类型和均质压力对鱼油乳液稳定性的影响。结果表明,制备5%(质量分数)鱼油含量的乳液时,乳清蛋白、磷脂和柠檬酸脂肪酸甘油酯的最适添加量分别为0.8%、0.8%和1.0%。在不同的均质压力条件下制备的乳液虽然外观状态良好,都为均一乳白色乳液,但表现出了不同的澄清指数、粒径和表面电荷变化,说明存在稳定性差异。乳清蛋白鱼油乳液的稳定性随均质压力升高呈现先升高后下降的趋势,采用100 MPa制备的鱼油乳剂具有较低的澄清指数0.105±0.005和较小的平均粒径(329±0.577) nm;磷脂鱼油乳液的稳定性随均质压力升高呈现先降低后平稳的趋势,采用140 MPa制备的鱼油乳剂具有较低的澄清指数0.146±0.001和较小的平均粒径(371±1.528) nm;柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液的稳定性随均质压力升高而升高,采用140 MPa制备的鱼油乳剂具有较低的澄清指数0.052±0.001和较小的平均粒径(487±0.450) nm。Zeta电位方面,乳清蛋白鱼油乳液和磷脂鱼油乳液表现更佳。分别在100、140 MPa和140 MPa制备乳清蛋白鱼油乳液、磷脂鱼油乳液和柠檬酸脂肪酸甘油酯鱼油乳液,并在60 ℃条件下加速保藏,保藏过程中3种鱼油乳液的颜色略有加深,但仍保持了较好的体系稳定性。综上所述,采用不同类型的乳化剂均可制备稳定的鱼油乳液,但乳液的体系稳定性与乳化剂类型、添加量和均质压力有关。在构建鱼油乳液递送体系时,若需要高乳化稳定性及天然来源,磷脂是最佳选择;若需低成本及高均质压力工艺柠檬酸脂肪酸甘油酯更合适;若侧重营养强化与功能性,乳清蛋白更具优势。未来研究可聚焦于探究乳化剂协同对鱼油乳液界面性质的调控机理,深入理解乳化剂协同在油水界面的吸附行为,为更复杂乳液体系的研究提供参考。
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