罗非鱼是全球重要的水产养殖品种,中国的罗非鱼养殖产量和出口量均居世界前列。罗非鱼是一种热带淡水鱼,因此其主要养殖区分布在气候宜人、淡水资源丰富的华南地区,这些地区的罗非鱼产量约占中国罗非鱼总量的90%[1]。罗非鱼体型较扁,鱼片占全鱼质量不到46%,因此加工过程中会产生大量下脚料,如鱼头、鱼骨、鱼皮等,这些加工副产物的处理方式主要是直接丢弃或简单加工成动物饲料,对副产物的利用率极低[2]。鱼骨中含有丰富的胶原蛋白、氨基酸和矿物质,且钙磷比例合理,利于人体吸收,可用于防止骨质疏松[3]。从鱼骨中提取羟基磷灰石、明胶和生物活性钙等食用物质已成为一个重要的研究方向[4]。
酱油作为亚洲传统发酵食品,具有悠久的历史和广泛的消费群体,市场对健康营养的需求推动了酱油向功能性方向发展[5]。米曲霉是现代酱油酿造的关键起始菌株,产生酱油发酵所需要的各种酶类[6],其中蛋白酶的酶活力高低决定了酱油的氨基酸态氮含量,从而确定了酱油的风味、口感和色泽。纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的亚种,可以将动物骨中的胶原蛋白分解为多肽,有利于动物骨中钙质的析出和溶解[7]。
因此,本研究以罗非鱼骨与大豆作为原料,采用纳豆芽孢杆菌和米曲霉顺序发酵制备钙强化酱油曲,以成曲中的可溶性钙和中性蛋白酶活力为指标,探究其最佳工艺条件,对比鱼骨曲与传统曲的差异,以期为罗非鱼骨的高附加值开发利用提供理论依据,并为钙强化功能产品原料选择提供了参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
罗非鱼骨,收集于广东海洋大学水产加工实验室;黄豆粉、面粉,市售;纳豆芽孢杆菌,乐活乐佳北京科贸有限公司;米曲霉,广东省菌种保藏中心;甲醛溶液,西陇科学股份有限公司;Na2S、KOH、钙羧酸指示剂、干酪素、Na2CO3、EDTA溶液,上海麦克林生化科技股份有限公司;Sorensen磷酸缓冲溶液、DNS、Na2C6O6缓冲溶液、羧甲基纤维素钠、NaOH标准溶液、丙三醇、无水葡萄糖(分析纯),上海源叶生物科技有限公司;福林酚试剂、BCA蛋白定量试剂盒,上海雷根生物科技有限公司;HCl、HNO3、HClO4、La2O3、乙酸、乙酸钠、三氯乙酸,均为分析纯,哈尔滨医药化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
800C多功能粉碎机,永康市红太阳机电有限公司;Varioskan Flash多功能酶标仪、ThermoLynx6000高速落地离心机,赛默飞世尔科技有限公司;BS-1F恒温培养箱,常州金坛精达仪器制造公司;HX204快速水分测定仪,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;SW-CJ-1FB超净工作台,苏州净化设备有限公司;PHS-3E型pH计,上海雷磁仪器厂、LDZX-50KBS型立式蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;HH-8CJ恒温磁力搅拌水浴锅,常州市金坛友联仪器研究所;FlavourSpec®风味分析仪,德国GAS公司。
1.3 实验方法
1.3.1 鱼骨粉的制备
将罗非鱼骨洗净后,于65 ℃烘箱中烘干后超微粉碎,过80目筛得到鱼骨粉。
1.3.2 制曲方法
参考张心愿等[8]的制曲方法略作修改。传统成曲:将熟黄豆粉加水浸泡10 min,加入20%(质量分数)的面粉进行混合,于121 ℃下高温高压灭菌15 min,冷却后将曲料摇散,接入一定量的纳豆芽孢杆菌悬液(浓度为108 CFU/L),发酵完成后,再接入一定量的米曲霉孢子悬液(浓度为108CFU/L)继续发酵,发酵过程中每隔12 h摇瓶翻曲,以防止曲料结块,直至制曲结束。
1.3.3 纳豆芽孢杆菌发酵阶段单因素试验
鱼骨粉占比(20%、25%、30%、35%、40%,质量分数)、发酵温度(35、37、39、43、45 ℃)、发酵时间(24、30、36、42、48 h)、纳豆芽孢杆菌接种量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对鱼骨成曲可溶性钙含量的影响。
1.3.4 纳豆芽孢杆菌发酵阶段响应面试验
结合纳豆芽孢杆菌发酵阶段单因素试验的结果,根据Box-Behnken的试验设计原理,以鱼骨粉占比(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)、接种量(D) 4个因素为自变量,以可溶性钙(Y)作为响应值,按照表1进行试验。
表1 纳豆芽孢杆菌发酵阶段Box-Behnken试验设计因素水平表
Table 1 Factors and levels of response surface design in Bacillus subtilis var natto fermentation
水平因素A(鱼骨粉占比)/%B(发酵时间)/hC(发酵温度)/℃D(接种量)/%-12548371.003060391.513572412.0
1.3.5 米曲霉发酵阶段单因素试验
分析面粉添加量(10%、15%、20%、25%、30%,质量分数,下同)、发酵温度(26、28、30、32、34 ℃)、发酵时间(24、30、36、42、48 h)、米曲霉接种量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对鱼骨成曲中性蛋白酶活力的影响。
1.3.6 米曲霉发酵阶段响应面试验
结合米曲霉发酵阶段单因素试验的结果,以发酵温度、接种量、面粉添加量3个因素为自变量,以中性蛋白酶活力(Y)作为响应值,按照表2进行试验。
表2 米曲霉发酵阶段Box-Behnken试验设计因素水平表
Table 2 Factors and levels of response surface design in Aspergillus oryzae fermentation
水平因素A(面粉添加量)/%B(发酵时间)/hC(发酵温度)/℃D(接种量)/%-11524281.002036301.512548322.0
1.3.7 可溶性钙含量的测定
取发酵完成后的曲料,置于研钵捣碎,加入等质量的去离子水,振荡混匀,以8 000 r/min、4 ℃离心15 min,收集上清液,用于可溶性钙的测定,参照GB 5009.92—2016 《食品安全国家标准 食品中钙的测定》EDTA滴定法。
1.3.8 理化指标的测定
水分与固形物含量采用快速水分测定法、总酸含量参照GB 12456—2021 《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》的电位滴定法进行测定、可溶性蛋白采用BCA蛋白定量试剂盒测定、pH值使用pH计进行测定。
1.3.9 相关酶系活力的测定
糖化酶活力测定参考LI等[9]的方法、中性蛋白酶活力测定参照YI等[10]的方法、纤维素酶的测定参考文献[11]的方法、淀粉酶的测定参考CHUTMANOP等[12]的方法。
1.3.10 孢子数的测定
孢子总数参考SB/T 10315—1999《孢子数测定法》规定的方法进行测定。
1.3.11 还原糖含量的测定
还原糖含量通过DNS法进行测定[13]。
1.3.12 氨基酸态氮的测定
氨基酸态氮含量的测定参照GB 5009.235—2016 《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》采用甲醛滴定法。
1.3.13 挥发性风味的测定
样品处理:将制曲结束后的鱼骨成曲和传统成曲于研钵中捣碎,各称取2.0 g样品置于20 mL进样瓶中,密封后放入顶空自动进样器,设置孵育时间为15 min、孵育温度为60 ℃,自动进样加热方式为振荡加热,注射针温度85 ℃,孵化转速500 r/min,进样体积500 μL,每个样品平行测3次。
1.3.14 数据处理
所有试验均重复3次,用SPSS 27、Origin 2022、Vocal_0.4.03、Design-Expert 13对数据进行处理和图表的绘制,气相色谱-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)Library Search(内置NIST、IMS数据库)对样品的挥发性物质进行定性分析,通过Gallery Plot插件进行GC-IMS指纹图对比。
2 结果与分析
2.1 纳豆芽孢杆菌发酵阶段单因素试验
2.1.1 鱼骨粉占比对曲料中可溶性钙的影响
如图1-a所示,不同鱼骨粉占比对曲料中可溶性钙含量的影响有显著差异,随着鱼骨粉占比的增大,可溶性钙含量呈现先增长后下降的趋势。鱼骨占比为20%～30%时,可溶性钙含量迅速增长,并在鱼骨占比为30%时可溶性钙含量最大(2 235.71±106.98) mg/L;当鱼骨占比超过30%后,可溶性钙含量下降。其原因可能是鱼骨中富含钙、镁、磷等矿物质,会使发酵环境的pH值偏离了菌种发酵的最适pH值[14],且鱼骨粉加入的量过大,会影响菌丝与底物的接触,从而导致可溶性钙的释放。因此,鱼骨粉占比控制在30%左右最佳。
a-鱼骨粉占比;b-发酵时间;c-发酵温度;d-接种量
图1 不同因素对鱼骨曲料中可溶性钙含量的影响
Fig.1 Effects of different factors on the soluble calcium content in the fermented fish bone substrate
注:不同小写字母表示组间存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
2.1.2 发酵时间对曲料中可溶性钙的影响
如图1-b所示,不同发酵时间对曲料中可溶性钙含量的影响存在显著差异。发酵时间在24～48 h时,可溶性钙含量迅速增长,并在第48小时可溶性钙含量最大(2 124.77±99.21) mg/L;当发酵时间超过48 h后,可溶性钙含量逐渐下降。其原因可能是发酵0～48 h时,菌丝代谢活性高,产酸能力强,有助于可溶性钙的溶出[15];随着发酵时间的延长,曲料中的营养物质逐渐耗尽,导致曲料中pH值有所回升,部分可溶性钙离子可能与发酵产生的其他阴离子结合,重新形成微溶或不可溶的钙盐沉淀[16-17],从而导致可溶性钙含量测定的降低。因此,纳豆芽孢杆菌发酵时间控制在48 h左右最佳。
2.1.3 发酵温度对曲料中可溶性钙的影响
如图1-c所示,不同发酵温度对曲料中可溶性钙含量的影响较为显著。发酵温度在35～39 ℃时,可溶性钙含量迅速增长,并在39 ℃时可溶性钙含量最大(2 158.42±97.70) mg/L;当发酵温度超过39 ℃后,可溶性钙含量缓慢下降。其原因可能是39 ℃最接近纳豆芽孢杆菌最适生长温度,有利于纳豆芽孢杆菌促进鱼骨粉可溶性钙的释放。因此,纳豆芽孢杆菌发酵温度控制在39 ℃左右最佳。
2.1.4 接种量对曲料中可溶性钙的影响
如图1-d所示,不同纳豆芽孢杆菌接种量对曲料中可溶性钙含量的影响有显著差异,随着接种量的增大,可溶性钙含量的呈先增长后缓慢下降的趋势。接种量在0.5%～1.5%时,可溶性钙含量迅速增长,并在接种量为1.5%时可溶性钙含量最大(1 995.62±78.92) mg/L;当接种量超过1.5%后,可溶性钙含量逐渐下降。其原因可能是接种量过多会导致菌丝在发酵前期快速生长,过早地耗尽营养物质,导致部分菌丝无法生长,从而影响可溶性钙的释放。因此,纳豆芽孢杆菌接种量为1.5%左右最佳。
2.2 纳豆芽孢杆菌发酵阶段响应面试验
2.2.1 响应面试验设计及结果
以鱼骨粉占比、发酵时间、发酵温度、接种量为因素,可溶性钙含量(Y)为响应值,运用Box-Behnken的中心组合试验进行研究,试验结果见电子版增强出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044648,下同),回归模型与方差分析见附表2。
对附表1的试验数据进行多元回归拟合,得到二次多元回归方程为:Y=2 175.88+19.92A-49.53B-84.97C+5.34D+3.93AB-0.525 0AC+3.95AD+50.23BC-7.08BD-0.700 0CD-17.40 A2-60.54B2-62.22C2-14.44D2。
由附表2可知,失拟项的P值为0.812 2,大于0.05,未达到显著水平;模型F<0.001,达到极显著水平,表明拟合获得的该模型方程极显著;模型决定系数R2=0.948 5,调整系数R2=0.898 2,说明该模型可以准确反映各因素对可溶性钙含量的影响,且预测值与实测值之间的相关性良好,可用于对本试验中鱼骨制曲的纳豆芽孢杆菌发酵阶段进行条件优化。在该模型中,一次B和C,交互项BC,二次项B2和C2均表现出极显著影响(P<0.001),一次项A具有显著影响(P<0.01),二次项A2有差异(P<0.05),其他项对结果不显著(P>0.05)。由F值可知,4个因素对可溶性钙含量的影响顺序依次为:发酵温度>发酵时间>鱼骨粉占比>接种量。
2.2.2 模型验证
根据响应面试验结果,得到最佳发酵条件:发酵时间50.518 h、鱼骨粉占比33.48%、发酵温度36.96 ℃、接种量1.365%,此条件下可溶性钙含量为2 191.028 mg/L。考虑实际操作,修改为发酵时间50.5 h、鱼骨粉占比33.5%、发酵温度37 ℃、接种量1.4%,在此条件下可溶性钙含量为2 253.2 mg/L,与模型预测值接近,证明该模型能良好预测实际情况。初始发酵条件(鱼骨粉占比30%、发酵时间48 h、发酵温度37 ℃、接种量1.5%)经响应面优化后,罗非鱼骨曲中的可溶性钙含量由2 014.2 mg/L升至2 253.2 mg/L,显著提高了11.87%。
2.3 米曲霉发酵阶段单因素试验
2.3.1 面粉添加量对曲料中性蛋白酶活力的影响
如图2-a所示,不同面粉添加量对曲料中性蛋白酶活力的影响较显著。面粉添加量在10%～20%时,中性蛋白酶活力迅速增长,并在面粉添加量为20%中性蛋白酶活力最大[2 001.08±80.25 (U/g 干基)];当面粉添加量超过20%后,中性蛋白酶活力缓慢下降,其原因可能添加了过高的面粉,使得发酵培养基中的碳氮比显著升高,导致米曲霉合成蛋白酶的效率下降[18]。因此,面粉添加量控制在20%左右最佳。
2.3.2 发酵时间对曲料中性蛋白酶活力的影响
如图2-b所示,不同发酵时间对曲料中性蛋白酶活力的影响存在显著差异。发酵时间在24～36 h时,中性蛋白酶活力增长迅速,并在第36小时其中性蛋白酶活力最高[(1 523.718±59.64) U/g 干基];当发酵时间超过36 h后,中性蛋白酶活力逐渐下降,其原因可能是在第36小时,米曲霉达到稳定期初期,此后部分细胞开始进入衰亡期,米曲霉合成次级代谢产物的能力显著降低[19],因此中性蛋白酶活力也逐渐下降。因此,米曲霉发酵时间控制在36 h左右最佳。
2.3.3 发酵温度对曲料中性蛋白酶活力的影响
如图2-c所示,不同发酵温度对曲料中性蛋白酶活力的影响存在显著差异。发酵温度为26～30 ℃时,中性蛋白酶活力增长迅速,并在30 ℃时中性蛋白酶活力最高[(1 895.87±41.42) U/g 干基];发酵温度高于30 ℃后,中性蛋白酶活力下降并逐渐趋于平缓。其原因可能是因为26～30 ℃时,有利于米曲霉的生长,促进了米曲霉的生长代谢和蛋白酶合成速度,而超过30 ℃后,酶失活速率大于反应速率,导致中性蛋白酶活力下降。酱油酿造中的常用到的米曲霉As 3.042的最佳发酵温度也常为30 ℃左右[20-21]。因此,米曲霉发酵温度控制在20 ℃左右最佳。
2.3.4 接种量对曲料中性蛋白酶活力的影响
如图2-d所示,不同米曲霉接种量对曲料中性蛋白酶活力的影响较显著。接种量为0.5%～1.5%时,中性蛋白酶活力增长迅速,并在接种量为1.5%时中性蛋白酶活力最高[(2 177.12±114.67) U/g 干基];接种量高于1.5%后,中性蛋白酶活力下降并逐渐趋于平缓,其原因可能是接种量过多,导致菌丝在发酵前期快速生长,过快地消耗了曲料中的营养物质,从而使米曲霉提前进入衰亡期,导致蛋白酶合成效率下降。
a-面粉添加量;b- 发酵时间;c-发酵温度;d-接种量
图2 不同因素对鱼骨曲料中中性蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effects of different factors on the neutral protease activity in the fermented fish bone substrate
2.4 米曲霉发酵阶段响应面试验
2.4.1 响应面试验设计及结果
以面粉添加量、发酵时间、发酵温度、接种量为因素,中性蛋白酶活力(Y)为响应值,运用Box-Behnken的中心组合试验进行研究,试验结果见附表3,回归模型与方差分析见附表4。
对附表3的试验数据进行多元回归拟合,得到二次多元回归方程为:Y=1 991.86+29.10A+20.11B+27.91C+91.06D+4.90AB-4.35AC+36.61AD+8.19BC+12.90BD+19.14CD-32.39A2-14.46B2+0.120 2C2-36.16D2。
由附表4可知,失拟项的P值为0.292 5,大于0.05,未达到显著水平;模型F<0.001,达到显著水平,表明拟合获得的该模型方程显著;模型决定系数R2=0.914 1,调整系数R2=0.784 9,说明该模型可以准确反映各因素对中性蛋白酶活力的影响,且预测值与实测值之间的相关性良好。在该模型中,一次项A、C、D,二次项D2表现出极显著影响(P<0.001),一次项B、交互项AD、二次项A2具有显著影响(P<0.01),其他项对结果不显著(P>0.05)。由F值可知,4个因素对可溶性钙含量的影响顺序依次为:接种量>面粉添加量>发酵温度>发酵时间。
2.4.2 模型验证
根据响应面试验结果,得到最佳发酵条件:面粉添加量23.455%、发酵时间36.455 h、发酵温度31.888 ℃、接种量1.307%,此条件下中性蛋白酶活力为2 090.56 (U/g 干基)。考虑实际操作,修改为面粉添加量23.5%、发酵时间36.5 h、发酵温度32 ℃、接种量1.3%,在此条件下中性蛋白酶活力为2 077.64 (U/g 干基),与模型预测值接近,证明该模型能良好预测实际情况。初始发酵条件(面粉添加量20%、发酵时间48 h、发酵温度30 ℃、接种量1.00%)经响应面优化后,罗非鱼骨曲中的中性蛋白酶活力由1 858.24 U/g干基升至2 077.64 U/g干基,显著提高了11.81%。
2.5 相关酶系活力的测定
不同成曲原料会影响微生物的的产酶效率,从而影响曲料中营养物质的降解,如蛋白质和碳水化合物[22-23]。如表3所示,鱼骨成曲中的中性蛋白酶活力高于传统成曲;纤维素酶、淀粉酶与糖化酶活力皆低于传统成曲。
表3 鱼骨成曲与传统成曲相关酶系活力的测定 单位:U/g干基
Table 3 Determination of enzyme activities related to koji formation and traditional koji formation of fish bone
酶系活力中性蛋白酶纤维素酶淀粉酶糖化酶鱼骨成曲2 077.64±94.10836.24±46.8861.64±11.331 702.78±82.62传统成曲1 624.22±93.301 054.32±82.8067.04±8.201 784.00±133.10
鱼骨中含有丰富的蛋白质,因此鱼骨成曲与传统成曲的碳氮比存在差异,菌株将鱼骨中的大分子蛋白水解成氨基酸和肽,从而产生了大量的蛋白酶;而传统成曲的碳氮比相对较高,菌体利用碳源合成了淀粉酶与糖化酶,并对蛋白酶的生产形成阻遏作用[24];大豆中的纤维成分可以作为激发曲霉产生纤维素酶的诱导物[25],而鱼骨曲中的大豆占比量较低,影响了曲料中的纤维素酶活力。因此鱼骨成曲中的中性蛋白酶活力较传统成曲高,而纤维素酶、淀粉酶与糖化酶较传统成曲低。
2.6 理化品质的测定
由表4可知,鱼骨成曲的可溶性钙含量为2 253.21 mg/L,约为传统成曲含量24.41 mg/L的94倍。鱼骨成曲的固形物含量、pH值、可溶性蛋白含量略高于传统成曲;水分含量略低于传统成曲;总酸含量无明显差异。
表4 鱼骨成曲与传统成曲理化指标的测定
Table 4 Determination of physical and chemical indexes of fish bone koji and traditional koji
理化品质水分/%总酸/(g/100 g)固形物含量/%pH值可溶性蛋白/(mg/g)可溶性钙含量/(mg/L)鱼骨成曲35.8±1.50.99±0.777.7±3.26.8±0.545.6 ±2.12 253.21±64.7传统成曲38.5±1.71.03±1.1 67.1±4.26.1±0.440.2 ±1.824.41±2.73
a-孢子数;b-还原糖含量;c-氨基酸态氮含量
图3 发酵过程中孢子数、还原糖含量与氨基酸态氮含量的变化
Fig.3 Changes in spore count, reducing sugar content, and amino acid nitrogen content during fermentation
大豆粉与面粉中含有丰富的碳水化合物和蛋白质,拥有良好的持水能力,因此在相同的发酵条件下,鱼骨成曲的水分含量较传统成曲更低,从而影响了成曲中的总固形物含量。曲料在发酵过程中会产生有机酸,鱼骨中的钙经有机酸溶解为离子形式后,可能会形成有机酸盐沉淀[26],影响鱼骨成曲中的游离酸含量,因此鱼骨成曲与传统成曲的总酸含量无明显差异,但鱼骨成曲的pH值较高于传统成曲。纳豆芽孢杆菌与米曲霉分泌的蛋白酶,可以分解蛋白质产生可溶性肽和氨基酸[27-28]。鱼骨成曲中pH环境更接近中性蛋白酶的最适pH值[29],蛋白质降解更充分,因此鱼骨成曲中的可溶性蛋白较传统成曲高。鱼骨中的钙主要是以结晶羟基磷灰石的形式存在[30]。曲料发酵过程中产生的有机酸可以将鱼骨中不溶性的钙盐溶解,从而提高曲料可溶性钙的含量;大豆中的钙含量低,因此鱼骨成曲中的钙含量显著高于传统成曲。
2.7 发酵过程中孢子数、还原糖含量与氨基酸态氮含量的变化
图3-a可知,鱼骨成曲与传统成曲孢子数均呈上升趋势。在发酵24～56 h时,鱼骨成曲与传统成曲间的孢子数无显著差异(P>0.05);在第72小时后(米曲霉发酵16 h后),两者孢子数出现明显增长,且鱼骨成曲孢子数均高于传统成曲(P<0.05),表明鱼骨成曲产酶效率高于传统成曲。
图3-b可知,在发酵24～56 h,鱼骨成曲与传统成曲间的还原糖含量均稳定下降,且鱼骨成曲还原糖含量显著高于传统成曲(P<0.05);在第72小时后(米曲霉发酵16 h后),两者还原糖含量小幅度增长后稳定下降,且鱼骨成曲还原糖含量均高于传统成曲(P<0.05)。
图3-c可知,鱼骨成曲与传统成曲的氨基酸态氮含量呈稳定上升趋势,且鱼骨成曲氨基酸态氮含量均高于传统成曲(P<0.05)。氨基酸态氮含量可以反映酱油品质的好坏,氨基酸态氮含量越高代表酱油品质越高[31]。
2.8 钙含量的评价
GB 28050—2011 《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》中规定钙的营养素参考值(nutrition reference values,NRV)为800 mg,“高钙”标注的要求为每100 mL中≥15% NRV(液体)。测定出鱼骨成曲可溶性钙含量最低为2 188.51 mg/L,达到“高钙”标准,约为传统成曲可溶性钙含量的94倍,可用于后续高钙酱油的制备。
2.9 挥发性风味的测定
采用GC-IMS技术对鱼骨成曲和传统成曲的挥发性风味化合物进行鉴定分析,分别测定最佳条件下制得的鱼骨成曲和传统成曲,如图4所示,以传统成曲为对照,扣除与鱼骨成曲中相同的信号得到差异对比图,红色区域说明这些挥发性物质在鱼骨成曲中较传统成曲高,蓝色区域说明这些挥发性物质在鱼骨成曲中较传统成曲低。
图4 成曲的GC-IMS谱图(差异图)
Fig.4 GC-IMS spectrum of koji formation (difference diagram)
采用Gallery Plot插件生成的指纹图谱(图5)对比鱼骨成曲与传统成曲间挥发性成分的差异。鱼骨成曲与传统成曲分别测定3组平行,共6组样品,图中每一列代表各样品中同一种挥发性成分的信号峰,每一行则代表各样品中所含全部挥发性成分的信号峰,颜色深浅反映各成分的浓度。由图5结合表5可知,鱼骨成曲和传统成曲共识别出39种信号峰包括10种酯类、8种酮类、5种醇类、4种醛类、4种酸类、3种硫化物类、5种其他类。从图4中可以看出鱼骨成曲与传统成曲有相似的挥发性香气物质,其中鱼骨成曲的特征风味物质有环戊酮、2-甲基-4-丙基-1,3-氧硫杂环己烷、2-呋喃甲基二硫醚、(-)-紫苏醛等。鱼骨成曲中的部分大豆发酵风味物质[32]较低,如苯乙醇、丁酸等。
图5 成曲的GC-IMS指纹谱图
Fig.5 GC-IMS fingerprint of koji
醛类和酮类通常来源于多不饱和脂肪酸的氧化,是水产品清新或脂肪香气的重要贡献者。李金林等[33]认为2-辛酮和壬醛是鱼肉特征风味的组成部分,赋予脂肪香、青草香。而壬醛在多种水产原料(如南美白对虾、罗非鱼等)中被确定为关键性风味物质[34]。鱼骨成曲挥发性有机物比传统酱油成曲种类多、浓度高。
表5 罗非鱼骨成曲与传统成曲挥发性组分的定性分析结果
Table 5 Qualitative analysis results of volatile components of tilapia bone koji and traditional koji
类别中文名称CAS#保留时间/s保留指数(retention index,RI)迁移时间酮类2-辛酮C1111379.965369,4121.748 514-壬酮 C448509010.353423,9921.354 89环戊酮C1209237.980213,2291.328 612-乙酰基吡咯C107283910.606463,4471.479 942-乙酰基-2-噻唑啉;C2992641810.981529,2771.147 323-甲基-2-环戊烯-1-酮C27581819.688340,1571.415 721-羟基-2-丙酮C1160966.550152,4291.241 24葫芦巴内酯C2866435910.973528,3571.604 38醛类(-)-紫苏醛C180314081.148 0631,4871.607 92正壬醛C1241961.097 5528,0890.146 282-甲酰基-5-甲基噻吩C136797041.121 7575,3231.156 063-甲基-2-丁烯醛;C1078687.701198,881.361 71醇类苯甲醇C10051610.493445,321.489 632-苯乙醇C6012810.995531,7661.284 31反-2-壬烯-1-醇C3150214411.751696,6231.242 023-甲基-1-戊醇C5893558.632251,8461.608 711-丁醇C713636.700157,1011.386 87酸类己酸C14262110.029377,8391.299 35(E)-2-丁烯酸C1079378.813263,4741.319 65丁酸C1079268.207225,7661.180 312-甲基丁酸C1165308.531244,9741.474 19酯类3-甲基丙酸丁酯C1056809.553326,5441.354 29丙酸异丁酯C5404218.576247,7881.281 74硫乙酸乙酯C6256057.604194,1691.429 84辛酸甲酯C11111511.271587,4641.425 233-甲基丁基-2-甲基丁酸酯C2762535011.099552,6461.410 84异戊酸3-甲基丁酯C65970111.031539,4711.456 88异丁酸异丁酯C978589.004277,4881.314 15丙酸异戊酯C1056809.614332,7681.354 563-羟基丁酸乙酯C54054149.411313,2451.159 42庚酸乙酯C10630910.969527,6591.411 15δ-己内酯C82322311.524642,6711.161 45含硫化物类2-呋喃甲基二硫醚C5750000212.053773,4121.213 732-甲基-4-丙基-1,3-氧硫杂环己烷C6771580411.312595,0021.246 492-异丙基-4-甲基噻唑C1567913710.221404,5011.626 21其他类2-丁腈C1097516.560152,41.239 75乙烯基苯C1004258.926271,0771.521 52对伞花烃C9987610.284413,7681.742 79
3 结论
本研究通过单因素试验与响应面试验对鱼骨制曲条件进行优化,最佳工艺条件为:鱼骨粉占比33.5%、面粉添加量23.5%,接入1.4%的纳豆芽孢杆菌在37 ℃发酵50.5 h后,再接入1.3%的米曲霉32 ℃发酵36.5 h,以上均为质量分数。在此条件下酸性蛋白酶活力为2 077.64 U/g干基,可溶性钙含量为2 253.2 mg/L。鱼骨成曲与传统成曲的理化品质与酶系活力存在差异,其中鱼骨成曲中的可溶性钙含量与中性蛋白酶活力显著高于传统成曲。鱼骨成曲与传统成曲的挥发性成分存在差异,其中酯类、酮类与醇类的风味贡献较大,为以罗非鱼作为基料的调味品开发提供参考。
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