鸡肉因脂肪含量相对较低、营养价值高、风味独特而受到消费者的青睐,近年来产量和消费量逐渐增加[1]。然而,鸡肉水分含量高且富含蛋白质,在生产、处理和贮存过程中极易发生变质[2]。鸡肉的腐败是由环境条件、微生物增殖及微生物间相互作用共同导致的[3]。因此,微生物腐败仍然是鸡肉安全的主要威胁[4]。研究发现,在冷藏鸡肉的腐败中,隆德假单胞菌(Pseudomonas lundensis)为优势腐败菌之一[5-6]。P.lundensis是一种杆状革兰氏阴性菌,其具备极强的蛋白水解和脂质水解能力,导致产生关键的挥发性有机化合物,进而生成刺激性气味[7]。因此,为了抑制这种细菌引起的鸡肉变质,许多研究人员正在研究新的抑菌方法。
随着人们对食品中化学防腐剂潜在健康风险的关注度不断提升,利用益生菌来源的天然生物防腐剂成为研究热点[8]。乳酸菌产生的细菌素是一类由细菌核糖体合成的肽类或蛋白质,具有抑菌作用[9]。乳酸乳球菌产生的乳链球菌素(Nisin)是目前唯一实现大规模商业化生产的细菌素,主要针对革兰氏阳性菌,对多种重要食源性致病菌及耐热芽孢形成菌均有抑制作用[10]。从传统酸面团中分离的L.plantarum SH1a产生的细菌素,对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌有强效抑菌作用,对对数期细菌抑制效果显著,对稳定期细菌无影响,证实为抑菌性物质[11]。从市售腐乳中分离的L.plantarum M4L1所产生的无细胞上清液,对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性食源性细菌均具有抑菌活性[12]。MA等[13]研究发现,L.plantarum P10所产生的无细胞上清液可以通过多靶点作用抗黑曲霉,并且可以延迟馒头表面霉斑的出现时间,证实L.plantarum P10可有效延长馒头保质期。因此,L.plantarum在食品工业中具有很高的应用潜力。然而,关于L.plantarum所产细菌素对P.lundensis的抑菌作用,尤其是其作用机制的研究仍较为匮乏。
本研究从发酵辣椒酱中分离获得一株L.plantarum F44,研究发现该菌株产生的细菌素粗提物对P.lundensis具有显著的生长抑制作用。本研究通过测定该细菌素粗提物的热稳定性、pH值稳定性及蛋白酶敏感性,探究了 L.plantarum F44 代谢物对P.lundensis的抑菌机制,并进一步评估了其在鸡肉保鲜中的应用潜力,旨在为天然新型生物抑菌剂的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
LB肉汤、平板计数琼脂(plate count agar, PCA)培养基,南京翼飞雪生物科技有限公司;MRS肉汤、假单胞菌选择性培养基,青岛海博生物科技有限公司;蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、CaCO3、乙酸乙酯,上海麦克林生化科技股份有限公司;BCA蛋白浓度检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 仪器与设备
Gen5全波长酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;QHZ-98A恒温摇床,江苏省太仓市华美生化仪器厂;SPX-250B-Z生化培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Centrifuge5810R离心机、Centrifuge5424R离心机,德国Eppendorf公司;SW-CJ-1FD无菌操作台,苏州净化设备有限公司;PHS-3C精密pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MF31-M光学显微镜,广州市明美光电技术有限公司;RRE-2000B旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 产细菌素乳酸菌株的筛选
1.3.1.1 产细菌素乳酸菌菌株的筛选与鉴定
取发酵辣椒酱1 g加入到9 mL的0.9%(体积分数)无菌生理盐水中,在101～105范围内连续稀释,取各稀释液100 μL涂布于含有CaCO3的MRS固体培养基,37 ℃培养48 h。挑取平板上产生溶钙圈的单菌落,划线纯化涂布于MRS液体培养基,37 ℃培养24 h后收集菌液,于4 ℃,10 000 r/min离心10 min,上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤,获得乳酸菌无细胞发酵上清液(cell free supernatants,CFS)。用1 mol/L的NaOH溶液将CFS的pH值调至6.0,排除有机酸的干扰,并加入过氧化氢酶,排除过氧化氢的干扰。P.lundensis用作指示菌,参考XU等[14]牛津杯琼脂扩散法进行抑菌活性的测定:将牛津杯置于固化的琼脂(20 g/L)上,调整LB固体培养基中的指示菌浓度为106 CFU/mL并倒入平板中,凝固后取走牛津杯。然后,向每个孔中加入200 μL的CFS,37 ℃培养12 h,用游标卡尺测量抑菌圈直径。每个菌株设置3次平行重复,结果取平均值。
对其进行革兰氏染色,观察菌株的颜色,判断菌株是否为革兰氏阳性菌。使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组的提取。用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5 ′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。PCR扩增结束后将产物回收,之后送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,经NCBI数据库同源性比对后,构建系统发育树。
1.3.1.2 平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)的计算
采用FastANI软件对L.plantarum F44基因组成对ANI值进行计算。
1.3.1.3 产细菌素乳酸菌菌株的生长曲线
将L.plantarum F44以2%(体积分数)的接种量接种至5 mL的MRS液体培养基中,37 ℃活化24 h,传代2次后以2%(体积分数)的接种量接种于300 mL的MRS液体培养基中37 ℃培养36 h。每隔2 h取样,测量OD600值和pH值。取5 mL菌液在10 000 r/min,4 ℃下离心10 min,取CFS用无菌过滤器过滤后备用。以P.lundensis为指示菌,采用牛津杯琼脂扩散法测定CFS的抑菌圈大小。
1.3.2 L.plantarum F44全基因组测序、功能注释及基因簇预测
将L.plantarum F44按2%(体积分数)接种至MRS肉汤中,37 ℃培养至对数期,在4 ℃离心以去除CFS,然后将沉淀物送至上海美吉生物公司。采用CGview软件绘制单样本基因组圈图;基于eggNOG数据库,通过Diamond软件完成COG注释及分类统计;依托Gene Ontology(GO)数据库,利用Blast2GO软件开展GO注释及分类统计;以KEGG数据库为参考,通过Diamond软件实现KEGG注释分析;使用MEGA 11软件构建系统进化树;使用在线软件 antiSMASH和BAGEL4进行细菌素基因簇挖掘。
1.3.3 产细菌素乳酸菌的抑菌特性
1.3.3.1 细菌素的初步纯化
参考李梦洋等[15]的方法进行乙酸乙酯萃取。将CFS与乙酸乙酯按体积比1∶1充分混合并静置2 h。收集上层有机相,40 ℃、80 r/min旋转蒸发除去乙酸乙酯,用pH值为4.0的PBS复溶至CFS原体积的2%(体积分数),冷冻干燥后用适量无菌PBS悬浮,即得细菌素粗提物。
1.3.3.2 抑菌谱和最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定
将制备的细菌素粗提物用于抑菌谱的测定,使用的指示菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。采用1.3.1.1节的牛津杯琼脂扩散法对细菌素粗提物的抑菌谱进行测定。每组试验重复3次。参照PENG等[16]的二倍稀释法进行测定。将细菌素粗提物连续与无菌的PBS按体积比1∶1稀释,并将培养到对数期的P.lundensis稀释至浓度为106 CFU/mL,指示菌与不同浓度的细菌素粗提物按体积比1∶1混合后,取200 μL置于96孔板37 ℃培养24 h后,未变浑浊的最小浓度即为MIC,并通过试剂盒来评估它们的蛋白浓度。
1.3.3.3 细菌素的稳定性分析
参考WANG等[17]的方法测定细菌素的稳定性。对于耐热性测定,将细菌素粗提物分别在40、50、60、70、80、90、100 ℃下处理30 min、121 ℃下处理15 min后,冷却至室温。pH耐受性测定,使用2 mol/L 的NaOH和HCl将细菌素粗提物的pH值调整为2、3、4、5、6、7、8、9、10,37 ℃孵育4 h后,pH值调回6.0,以排除酸碱的影响。酶消化试验采用蛋白酶K(5 mg/mL,pH 7.5,37 ℃)、木瓜蛋白酶(5 mg/mL,pH 7.5,37 ℃)、胃蛋白酶(5 mg/mL,pH 2.0,37 ℃)、胰蛋白酶(5 mg/mL,pH 7.5,37 ℃)、碱性蛋白酶(5 mg/mL,pH 9.5,55 ℃)和淀粉酶(5 mg/mL,pH 6.8,37 ℃)处理6 h,100 ℃灭酶10 min,然后将pH值回调至6.0。对照组为未用酶、酸碱、热处理。通过牛津杯琼脂孔扩散测定法测量残留抗菌活性。每次试验重复3次。
1.3.4 L.plantarum F44细菌素粗提物在鸡肉保鲜中的应用
1.3.4.1 鸡肉样品的处理
将从盒马鲜生购买的经过处理的鸡胸肉分成10 g每份,使用不同浓度的细菌素粗提物浸泡30 min,溶液浓度为1MIC、2MIC,在室温下风干,对照组不做处理[18]。将指示菌注射入处理好的样品中,接种浓度为105 CFU/g,用无菌保鲜膜包好置于4 ℃冰箱冷藏,每隔3 d取样测定[19]。
1.3.4.2 微生物指标测定
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》,样品每隔3 d取样,梯度稀释后进行涂布,于37 ℃培养48 h后计数。
1.3.4.3 理化指标测定
参照GB 5009.228—2016 《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》测定不同处理组鸡肉的挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)含量。参照GB 5009.181—2016 《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》测定鸡肉样品中硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)含量。采用色差仪测定肉色L*、a*、b*值,每组测定3个不同点。鸡肉样品与无菌水按1∶10(g∶mL)比例匀浆,用pH计测量上清液的pH值,每组测量3次。
1.4 数据分析
所有试验重复3次,结果表示为“平均值±标准差”,采用Origin 2021作图,采用SPSS 26软件中的单因素方差分析(ANOVA)和邓肯检验进行数据分析,P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 产细菌素乳酸菌株的筛选
2.1.1 产细菌素乳酸菌株的筛选与鉴定
从发酵辣椒酱样品中分离得到44株乳酸菌,以P.lundensis为指示菌测定各菌株CFS的抑菌活性,结果显示14株乳酸菌的CFS对指示菌具有不同程度的抑菌作用。经除酸和H2O2处理后,得到1株抑菌活性最佳的菌株F44作为后续研究对象。如图1所示,结合16S rDNA序列结合系统发育分析,鉴定F44为L.plantarum;菌株F44在MRS琼脂平板上形成乳白色、边缘整齐、表面光滑湿润的菌落,并带有微酸气味,革兰氏染色结果显示为阳性,呈直或弯的杆状。
2.1.2 ANI
为验证菌株之间的亲缘关系,选择5株菌进行ANI的计算。L.plantarum F44与Lactiplantibacillus plantarum strain AHQ-14、Lactiplantibacillus plantarum strain HOM2217、Lactiplantibacillus plantarum strain YH001、Lactiplantibacillus plantarum strain K4、Lactiplantibacillus plantarum strain MTY101的ANI值分别为99.137 8%、98.237 4%、97.201 3%、97.082 1%、96.318 2%,均高于96%。
2.1.3 L.plantarum F44的生长曲线及抑菌物质产生曲线
如图2所示,OD600值显示F44在4～16 h进入对数生长期,16 h左右进入稳定期。pH值在培养4 h开始发生变化,4～12 h迅速下降,从5.34降至3.94,14～28 h缓慢下降,28 h后趋于平稳并维持在3.8左右。抑菌实验结果显示8 h出现抑菌圈,在稳定期(30 h)达到最大值,即(19.77±0.06) mm,表明抑菌圈直径的变化反映了细菌素的抑菌活性,由此说明细菌素从F44生长开始分泌至稳定期达到最大产量,与F44的生长规律相符合。
a-菌株F44的系统发育树;b-菌落形态;c-显微形态图
图1 菌株F44的鉴定
Fig.1 Identification of strain F44
a-F44的生长曲线;b-F44的抑菌圈实物图
图2 植物乳植杆菌F44的生长曲线及抑菌圈实物图
Fig.2 Growth curve and inhibition zone image of L. plantarum F44
2.2 L.plantarum F44全基因组测序与功能注释
如图3-a所示,整理组装F44的序列,获得基因组圈图。对测序结果进行分析可知基因组全长为3 746 814 bp,GC含量为41.33%,基因组预测获得3 360个编码基因,基因总长度为3 014 319 bp,平均长度为897.12 bp,预测到含有66个tRNA、16个rRNA、40个sRNA等非编码基因。
基因组COG注释结果如图3-b所示,共2 602个基因获得COG基因注释,占所有基因的77.44%,其中,碳水化合物运输和代谢(G)、转录(E)、氨基酸转运和代谢(K)是最大的三大类,分别注释了310个、245个、284个基因,意味着菌株F44具有较好的利用碳水化合物和氨基酸的能力[20]。
基因组KEGG注释结果如图3-c所示,共有2 332个基因得到KEGG注释,占据总基因的69.4%,参与了40条KEGG通路。在环境信息处理中膜运输(192个)得到注释的基因数最多,其次是信号转导(110个),在膜运输中ABC转运蛋白占据主要地位,这对细菌素的合成非常重要。含基因最多的是新陈代谢中的全局和概览图(701个),其中次级代谢物的生物合成(33个)与氨基酸代谢与细菌素的合成密切相关。在遗传信息处理中,翻译(82个)是被注释最多的,并且细菌素的合成是在核糖体中完成的。在细胞过程、人类疾病和生物系统中得到注释最多的分别是细胞群落-原核生物(93个)、耐药性-抗菌药(54个)和内分泌系统(24个)。KEGG注释结果也表明,F44具有较强的组分运输和能量代谢的能力。
基因组GO注释结果如图3-d所示,一共有1 707个基因参与了GO功能注释,占所有基因的50.8%,主要分为三大类,与细胞组成(cellular component)相关的基因数量有877个,与分子功能(molecular function)相关的基因数量有1 355个,与生物过程(biological process)相关的基因数量有844个。
a-F44基因组圈图;b-F44基因组COG功能注释;c-F44基因组KEGG功能注释;d-F44基因组GO功能注释
图3 F44基因组功能预测图
Fig.3 Functional prediction of the F44 genome
2.3 L.plantarum F44次级代谢基因簇预测
结合antiSMASH与BAGEL 4的预测结果,二者在L.plantarum F44基因组的394 424～418 974区间存在重复预测:该区域被antiSMASH鉴定为I型羊毛硫肽(lanthipeptide-class-i)型基因簇(对应已知簇mutacin B-Ny266),同时被BAGEL 4注释为Mutacin1140(同属lanthipeptide家族),二者功能一致,合并记为“mutacin类lanthipeptide细菌素基因簇”(表1)。
表1 植物乳植杆菌F44细菌素的预测结果
Table 1 Predicted results of bacteriocins from L.plantarum F44
预测工具区域位置基因簇类型/注释antiSMASH+BAGEL 4(重复区域)394 424～418 974mutacin 类 lanthipep-tide 细菌素基因簇antiSMASH(独有)1 658 703～1 679 629terpene-precursorantiSMASH(独有)2 087 585～2 128 754T3PKSBAGEL 4(独有)3 316 004～3 336 295Pediocin(159.2 aa)BAGEL 4(独有)453 497～473 590Plantaricin A(167.2 aa)
此外,antiSMASH还预测到萜类前体(terpene-precursor)和III型聚酮合酶(T3PKS)等多个次级代谢产物生物合成基因簇,这些发现为该菌株在食品发酵工业中的应用提供了重要的理论支撑和实践依据。
利用BAGEL4数据库检索F44的全基因序列,如图4所示,在F44菌株中存在3个潜在目标区域(areas of interest, AOI),包含3个编码核心肽的基因,分别为Pediocin(159.2 aa)、PlantaricinA(167.2 aa)和Mutacin1140(72.1 aa),氨基酸序列为VLNILETGLS-KVKHNQQTPERQARVVYDQIASQVFVDKLQFTVDEN-KVLTAINELAHSQKGWASSTC,MQKIVGGKSSTYSLQ-MGSVVRTATKIFKKLKW,MLENNETNTQTLDLNDAL-FDLDVTENEVSAVKDEDDPDSRFKSWSLCTFGCAHT-GSFNSFCC。PlantaricinA(PlnA)属于Class Ⅱ细菌素,其中orf00025、orf00031、orf00049分别与PlnD、PlnC、PlnY具有同源性(图4-b),均属于Pln操纵子,参与细菌素的产生[21]。在图4-c中,存在3种编码ABC转运蛋白的基因,ABC转运蛋白是细菌素合成的核心蛋白[22]。
a-AOI-01;b-AOI-02;c-AOI-03
图4 植物乳植杆菌F44基因组BAGEL 4对比结果
Fig.4 Comparative results of the L. plantarum F44 genome using BAGEL 4
2.4 L.plantarum F44细菌素粗提物的抑菌特性
2.4.1 抑菌谱和MIC
采用乙酸乙酯对CFS进行萃取,获得细菌素粗提物,抑菌谱测定结果如表2所示,该粗提物对8株革兰氏阴性菌和7株革兰氏阳性菌均表现出不同的抑菌效果, 表明 L.plantarum F44 产细菌素具有较广的抑菌谱,这一特性可能与其基因组中含有多种产细菌素合成相关基因密切相关。采用肉汤稀释法测定该细菌素粗提物对指示菌 P.lundensis 的MIC,结果显示L.plantarum F44产细菌素的MIC值为312 μg/mL。
2.4.2 细菌素的稳定性分析
由图5-a可知,细菌素粗提物经40～121 ℃分别处理30、15 min后,对P.lundensis仍保持较高抑菌活性,且活性无显著变化,表明该细菌素粗提物具备优良的热稳定性。细菌素自身结构稳定且疏水性良好,赋予其优异的温度耐受特性,这也是其在热处理后仍可维持抑菌活性的重要原因之一。由图5-b可知,在pH耐受性试验中,该细菌素粗提物在强酸性(pH=2.0)与强碱性(pH=10.0)条件下处理后,仍保持较高的抑菌活性,且在pH=4.0时抑菌活性达到峰值。
表2 F44的抑菌谱
Table 2 Antibacterial spectrum of F44
类别指示菌抑菌能力G-肺炎克雷伯菌++大肠杆菌++铜绿假单胞菌+++鲍曼不动杆菌++隆德假单胞菌+++鼠伤寒沙门氏菌++嗜水气单胞菌+++沙雷氏菌+++G+热死环丝菌+++金黄色葡萄球菌++蜡状芽孢杆菌++产气荚膜梭菌+生孢梭菌+单增李斯特菌Lm3++单增李斯特菌EDG-e++
注:“+++”,22～25 mm;“++”,18～21 mm;“+”,14～17 mm。
由图5-c可知,经不同蛋白酶处理后,细菌素粗提物均保留一定的抑菌活性,与空白对照相比,木瓜蛋白酶处理组对P.lundensis的抑菌活性下降幅度最大,表明L.plantarum F44细菌素粗提物中,大概率含有蛋白质或肽类抑菌活性成分。
a-温度耐受性;b-pH耐受性;c-酶敏感性
图5 细菌素粗提物对温度、pH值和蛋白酶的稳定性分析
Fig.5 Analysis of the stability of bacteriocin crude extracts under temperature, pH, and protease conditions
注:不同的小写字母表示温度、pH和蛋白酶处理组对P.lundensis抑菌圈直径的差异显著性(P<0.05)。
2.5 L.plantarum F44细菌素粗提物的抑菌特性
TBARS值是衡量肉类食品的脂肪氧化程度的经典指标,其数值越高,表明肉品脂肪氧化程度越高[23],TBARS>0.5 mg/kg时表明肉品已经变质。如图6-a所示,冷藏贮藏过程中,空白对照组鸡肉的TBARS值上升速率显著快于细菌素粗提物处理组,贮藏至第6天时,对照组、1MIC、2MIC的TBARS值为0.51、0.41、0.36 mg/kg,对照组已率先超出变质临界值;贮藏至第9天时,各组TBARS值均超过0.5 mg/kg。这表明L.plantarum F44细菌素粗提物可有效延缓鸡肉中脂肪的氧化分解。
鸡肉蛋白在蛋白酶和微生物的作用下,产生氨和胺类化合物等挥发性物质,故测定冷藏鸡肉中的TVB-N含量能反映肉的新鲜度。根据GB 2707—2016 《食品安全国家标准 鲜(冻)畜、禽产品》的规定,当鸡肉中TVB-N含量超过15 mg/100 g时,即可判定为变质肉品[24]。如图6-b所示,对照组在第6天的TVB-N含量达到19.28 mg/100 g,超出变质标准;在第9天、1MIC组、2MIC组TVB-N含量达到16.93、15.7 mg/100 g,鸡肉已经变质。对照组中TVB-N值的相对快速上升可能与蛋白质分解和非蛋白质含氮化合物在微生物生长和代谢过程中产生的各种基本含氮化合物的积累有关[25]。相比之下,细菌素粗提物可有效延长鸡肉货架期3 d,凸显其良好的保鲜应用潜力。
pH值是评估鸡肉新鲜程度的指标。一般认为,pH值>6.4即为变质肉。如图6-c所示,鸡肉的初始pH值均在6.0左右,表明3组鸡肉样品的酸碱度基本一样。结果显示,各组样品pH值在第3天出现明显下降,这可能是由于鸡肉微生物在初始阶段的代谢活动产生了酸性物质[26]。从第3天开始,pH值呈现上升趋势。在贮存期间,肉中的微生物活性和内源性蛋白酶会降解蛋白质,蛋白质降解和胺积累导致pH值上升[27]。对照组在第9天的pH值达到6.65,表明鸡肉变质,而处理组的pH值为6.36、6.23,未发生变质。与对照组相比,处理组pH值变化明显变缓,表明细菌素粗提物可延缓pH值变化,延长冷藏货架期。
如图6-d所示,鸡肉的初始菌落总数为3.99～4.05 lg CFU/g。随着贮藏时间的延长,鸡肉中的菌落总数不断增长。对照组菌落总数在4 ℃贮存6 d时为6.3 lg CFU/g,超过GB 16869—2005 《鲜、冻禽产品》的细菌限量。与对照组相比,第9天时,1MIC组和2MIC组为6.28、6.09 lg CFU/g,均超过了限量标准。与对照组相比,处理组将鸡肉的保质期延长了3 d。这一结果表明,细菌素粗提物可以减缓细菌生长繁殖,延缓鸡肉变质。
颜色是反映肉类新鲜度的重要因素,也是影响肉类产品受欢迎程度的关键参数[28]。如图6-e～图6-g所示,随着贮藏时间的延长,由于微生物繁殖、肌红蛋白氧化降解、脂质氧化和组织渗出液的释放,L*值下降,导致外观变暗和表面亮度降低。与对照组相比,处理组鸡肉L*值下降趋势缓慢。同时,所有组的a*值均呈下降趋势,对照组a*值降幅尤为明显。这是因为肌红蛋白氧化为高铁肌红蛋白,使鸡肉颜色变暗[29]。此外,b*值反映肉类的褐变程度,在贮藏期间,对照组 b*值增幅高于处理组。
3 结论
本研究从发酵辣椒酱中筛选出一种对P.lundensis的生长有显著抑制作用的L.plantarum F44。首先,对菌株F44进行了全基因组测序,经过多个数据库分析比对,确定该菌基因全长为3 746 814 bp,GC含量为41.33%,基因组预测获得3 360个编码基因,并且,预测到F44存在5个次级代谢产物合成基因簇。进一步对细菌素粗提物的温度、pH值和蛋白酶稳定性进行系统分析,结果显示,经40～121 ℃分别处理30、15 min,对P.lundensis仍保持较高抑菌活性,表明该细菌素粗提物具有良好的热稳定性;在pH 2.0～10.0范围内,其pH值稳定性优异;酶敏感性试验表明,该细菌素粗提物对蛋白酶敏感,提示其核心抑菌成分可能为蛋白或肽类物质。抑菌谱检测发现,细菌素粗提物具有广谱抑菌特性,测得其对P.lundensis的MIC为312 μg/mL。另外,鸡肉保鲜的应用实验中,细菌素粗提物显著降低肉品的菌落总数,延缓了pH值变化,减少了TVB-N和TBARS的生成,有效维持肉品品质并将货架期延长了3 d。因此,L.plantarum F44及其产生的细菌素是具有前途的天然防腐剂,为乳酸菌细菌素在食品中的保鲜应用打下了一个有希望的基础。
a-TBARS值;b-TVB-N含量;c-pH值;d-菌落总数;e～g-色差
图6 细菌素粗提物对鸡肉制TBARS值、TVB-N含量、pH值、菌落总数和色差的影响
Fig.6 Effect of bacteriocin crude extract on TVB-N, TBARS, pH, total bacterial count, and color difference in chicken meat
注:不同的小写字母表示不同组别同一贮藏时间下的样品具有显著差异性(P<0.05)。
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