中高温大曲作为浓香型白酒的糖化发酵剂,其微生物来源丰富,包括场地、工具、水源、空气、原料及人类活动,并通过人工翻曲、盖草帘、开窗、并房等有限措施进行发酵调控,所以人工调整的工艺参数指标对大曲的理化性质、可培养微生物、挥发性风味物质都会有较大的影响。正常的大曲发酵过程中,曲胚温度会呈现“前缓中挺后缓落”的典型变化规律,所谓“顶温”具体是指在中挺这一环节中曲胚的最高温度,“顶温期”是指曲坯温度升至顶温前后,保持该高温范围的持续时间段[1]。在中高温大曲生产的所有调控阶段中,顶温及顶温期的控制尤为重要,一方面,顶温是区别不同类别大曲的重要标志,基于顶温温度范围的不同,可以将大曲分为中温大曲(主要应用于清香型白酒)、中高温大曲(主要应用于浓香型白酒)和高温大曲(主要应用于酱香型白酒)[2];另一方面,顶温期的温度及持续时间(挺温时间)差异也会影响大曲中微生物的代谢活动及挥发性风味物质的积累。王昊乾等[3]探究了顶温温度的提高对大红心大曲理化及微生物群落结构的影响;当顶温提高5 ℃时,大曲糖化力、液化力均有下降,但不显著;发酵力和酒化力略有提高。细菌中的醋酸菌、魏氏菌和葡萄球菌占比显著增加,糖多孢菌占比显著下降;真菌中的嗜热子囊菌、曲霉和青霉的占比增加,而扣囊覆膜酵母的占比显著降低。邓皖玉等[4]发现大曲挺温时间与大曲的质量及风味有明显关联性,挺温时间延长,醋酸菌属、乳酸菌属和芽孢杆菌属等细菌增加,从而促进酱香风味物质的生成。DU等[5]对比研究了挺温时长为5 d和9 d的浓香型大曲的代谢途径及挥发性风味物质差异;延长挺温时间有利于微生物对氨基酸相关代谢途径的表达,但会减少四甲基吡嗪、乙醇和油酸乙酯这些物质的积累。目前业内对于中高温大曲生产中挺温时长并没有明确的规定,主要依赖工人及制曲技师在日常生产中摸索的大致经验决定的,具有较强的主观性。因此,挺温时间这一控制参数对中高温大曲的影响及最佳持续时长的确定有待更进一步的研究。
本研究以自动化温控曲房发酵控制模式下生产的挺温时长分别为6～10 d的中高温大曲出库曲样本为研究对象,系统分析上述大曲在理化指标、可培养微生物和挥发性风味物质的差异。本研究可以为后续自动化制曲生产的关键控制点提供参数依据和理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
中高温大曲,宜宾某浓香型公司。
NaOH、浓HCl、次甲基蓝、无水葡萄糖、KI、CuSO4·5H2O、酒石酸钾钠、无水乙酸钠、冰乙酸、糖化酶、可溶性淀粉、无水乙醇、己酸、酚酞、浓H2SO4、孟加拉红培养基(含0.1 g/L氯霉素)、营养琼脂培养基(含0.01 g/L两性霉素),分析纯,国药集团化学试剂有限公司;2-辛醇,阿拉丁试剂(上海)有限公司;MRS琼脂(含0.01 g/L两性霉素),北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BXP-280S微生物培养箱、DK-8D三温三控水槽、YXQ-100SII立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;AS2-6S1生物安全柜,新加坡艺思高科技有限公司;ml204T电子天平,梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;手动SPME进样器、固相微萃取针头(2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS),美国Supelco公司;8890 N-5975B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司。
1.3 实验方法
1.3.1 取样方法
曲样为不同挺温时间下生产的出库大曲(一般发酵约1个月),该大曲样本后续会进入贮藏阶段(一般贮存约3个月以上),大多数酒企一般会针对该阶段的大曲开展质量检测和大曲等级评估评级。本轮试验的挺温时长分别设置为5、6、7、8、9、10 d,采集的大曲样本编号分别为Q5～Q10。具体的采样方法如下:在大曲发酵结束时,从每个对应挺温时间的曲房中,采用空间五点取样法,从不同方位选取10块具有相同挺温时间的大曲,经粉碎并过20目筛后,将所得样品混合成一个样本。每个样本被分成2份,一份样本存放于4 ℃冰箱中,用于理化指标及可培养微生物数量的测定;另一份样本置于-40 ℃冰箱中,用于风味物质的检测。
1.3.2 理化指标的测定
大曲理化指标的测定包括水分、酸度、液化力、糖化力和发酵力,具体检测方法参照QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》执行。
1.3.3 可培养微生物生物量的测定
可培养微生物生物量的测定包括细菌总量、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌[6]。分别称取10 g不同挺温时间曲样于生理盐水,制成10-1菌悬液(芽孢杆菌计数样品经80 ℃水浴处理10 min),选择不同稀释梯度(酵母、乳酸菌选择10-3～10-4,细菌、霉菌、芽孢杆菌选择10-5～10-7),各取100 μL菌悬液涂布于对应培养基上[6],每个稀释度做3个平行,于对应温度培养箱,培养1～2 d,按典型菌落特征计数。同时准备空白对照平板一起培养。
1.3.4 大曲挥发性风味物质测定
参照卢中明等[7]的方法,采用HS-SPME-GC-MS进行大曲挥发性风味物质的测定。
1.4 数据处理方法
采用Excel 2021进行理化指标、可培养微生物及挥发性风味物质数据处理,理化指标、可培养微生物及挥发性风味物质、主成分分析(principal components analysis,PCA)、方差分析使用Origin 2025作图,挥发性风味物聚类热图与韦恩图使用R语言绘制。
2 结果与分析
2.1 不同挺温时间对大曲理化指标的影响
由图1-a可知,随着挺温时间由5 d逐渐升至10 d,出库大曲的水分由Q5样品的15.01%降至Q10样品的11.7%,呈持续下降趋势,说明顶温期持续时长的增加会导致大曲水分的持续流失。由图1-b可知,酸度呈先增后降趋势,Q8样品的酸度值最高,达到1.14 mmol/10 g,说明适当延长挺温时间使耐热细菌的产酸活动旺盛。然而挺温时间过长会导致水分流失增快,不适合真菌和不耐热细菌的生长,导致酸度降低。
液化力指微生物产生的液化酶(主要是α-淀粉酶)将酿酒原料中的淀粉分解为糊精等小分子物质的能力,大曲的液化力主要由霉菌及芽孢杆菌提供。由图1-c可知,液化力呈先增后降趋势,并在Q6样品中达到峰值0.85 U,后续的可培养微生物研究表明:挺温时间的适当延长可使芽孢杆菌生物量增加,霉菌生物量显著下降;霉菌的液化力可能比芽孢杆菌的贡献更大,故液化力在Q6后呈持续下降趋势。
糖化力指微生物产生的糖化酶将液化产物进一步分解为葡萄糖的能力,大曲的糖化力主要由霉菌提供,包括黑曲霉、米曲霉、根霉、嗜热子囊菌等[8],这些微生物对持续高温有一定的抗性,尤其是嗜热菌属。由图1-e可知,糖化力在Q7样品中达到了峰值948.6 mg/(g·h),但随着持续高温,这些微生物的生长繁殖也会被抑制,导致糖化力下降。
发酵力指微生物将糖化产物转化为乙醇及其他代谢产物的能力,酵母是提供发酵力的主要微生物。由图1-d可知,发酵力在Q6样品中达到峰值1.30 g/(0.5 g·72 h),随着挺温时间增加,发酵力的下降趋势相较于其他指标尤其明显,说明酵母对高温的耐受性很低。酯化力指微生物将发酵产生的有机酸与醇类结合,合成酯类物质的能力。酯化力与芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌都呈显著正相关[9]。由图1-f可知,酯化力在Q7时达到峰值661.35 U,在峰值后的下降趋势与糖化力、液化力、发酵力相比较为平缓,说明提供酯化力的芽孢杆菌、乳酸菌都有一定的耐热性。白酒的产量与质量和大曲的液化力、糖化力、发酵力、酯化力等酶活性密切相关[10]。基于上述分析,这些指标均随挺温时长的增加呈现先上升后下降的趋势。其中,液化力和发酵力在挺温时间为6 d时达到峰值,糖化力和酯化力在挺温时间为7 d时达到峰值。因此,从理化角度分析,中高温大曲的挺温时间控制在6～7 d较为适宜。
a-水分;b-酸度;c-液化力;d-发酵力;e-糖化力;f-酯化力
图1 不同挺温时间大曲样品理化指标
Fig.1 Physicochemical indexes of Daqu in different maximum-temperature keeping time
注:不同小写字母表示在P<0.05水平上显著(下同)。
2.2 不同挺温时间对大曲可培养微生物的影响
可培养微生物的检测可以说明该条件下存在且具有生物活性的微生物类别及数量,用微生物的动态变化解释理化性质及酶活性的动态变化。不同大曲样本中可培养细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌总数见图2。从图2-a可以看出,细菌总量随挺温时间的增加而增多,但在Q10样品中略有减少,且所有样品的细菌生物量处于106～107数量级。芽孢杆菌的生物量同样处于106～107数量级,且仅仅略低于同期的细菌生物量,说明芽孢杆菌是中高温大曲中主要的可培养细菌。由图2-c可知,乳酸菌数量在Q6样品中达到峰值,随后呈显著下降趋势,表明乳酸菌对高温的耐受能力较差。乳酸菌的生物量处于104～105区间,显著低于细菌和芽孢杆菌的生物量,因此,尽管随着挺温时间的延长乳酸菌生物量显著下降,但却未导致细菌总生物量显著下降。
酵母菌是浓香型白酒发酵的核心“产酒微生物”,以酿酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母等为主[11]。由图2-d可知酵母菌数量在Q6样品中达到最高,然后呈显著下降趋势,且数量级下降明显,说明酵母菌对高温的耐受性差,这也解释了在图1-d中挺温时间大于6 d后发酵力陡然下降的原因。霉菌由于其强大的淀粉酶活性而被认为是在发酵过程中“糖化引擎”,大曲中的霉菌主要有嗜热子囊菌属、热霉菌属、曲霉菌属、根毛霉属[12],其中不乏有耐热性较好的菌株。从图2-e可以看出,随着挺温时间的增长,霉菌的生物量在Q8样品中有明显的下降,且生物量数量级在105～107范围内,说明虽然霉菌里存在一些耐热菌株,但其耐受性远不如细菌。基于上述分析,除霉菌外,其余4种微生物的生物量在6～7 d时达到了各自的峰值,与理化结果的最佳挺温时间相同。
a-细菌;b-芽孢杆菌;c-乳酸菌;d-酵母;e-霉菌
图2 不同挺温时间大曲样品可培养微生物生物量
Fig.2 Culturable microbial biomass of Daqu in different maximum-temperature keeping time
2.3 不同挺温时间对大曲挥发性风味物质的影响
对上述大曲样本开展HS-SPME-GC-MS检测与分析,共确定99种挥发性风味物质,其中酯类34种、醇类8种、醛类9种、酸类8种、吡嗪类9种、酮类8种、呋喃类2种、其他类21种。由图3-a可知,所有的大曲样本中酯类物质的种类最丰富,其次为吡嗪类、醇类、醛类、酮类、酸类、呋喃类,这一点与四川宜宾产区生产的浓香型大曲风味相似[13]。随着挺温时间的延长,大曲中风味物质数量呈先上升后下降趋势,Q9样品中种类最多。由图3-b可知,酯类物质是所有的大曲样本含量最多的挥发性风味物质,占比在68.8%～80.8%,其次为吡嗪类和醇类物质。且随着挺温时间增加,风味物质的总含量呈上升趋势,其中酯类与醛类的含量呈上升趋势,在Q10样品中达到最高;醇类、吡嗪类、酸类的含量呈先上升后下降趋势,分别在Q9、Q8、Q9样品中达到最高。
a-不同类别大曲风味物质的数量;b-不同类别大曲风味物质含量
图3 不同挺温时间大曲风味物质数量和含量
Fig.3 Number and content of Daqu flavor substances in different maximum-temperature keeping time
利用UpSet韦恩图分析6组样本中共有及特有的风味物质,由图4可知,6组样本具有29种共有风味物质,Q5中独有的风味物质为乙苯、2,4-二甲基苯甲醛、对二甲苯、4-吡啶甲醛、苯戊酮;Q6中独有的风味物质为1-十二烯、4-戊烯-2-酮;Q7中独有的风味物质为甲酸甲酯、1-丁醇、丙酸、己酸己酯;Q8中独有的风味物质为苯乙醛酸异丙酯、异戊酸、4-乙基苯甲酸-2-苯乙酯;Q9中独有的风味物质为丁酸己酯、合金欢醇、香叶基丙酮;Q10中独有的风味物质为2-十五烷酮。
通过聚类热图分析不同挺温时间大曲的风味物质含量差异,由图5可知,挺温时间对大曲风味物质的形成具有较大的影响,Q5～Q10各样本间的优势风味物质存在明显的差异。总体而言,Q10中含量较高的物质有癸酸乙酯、油酸乙酯、棕榈酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、硬脂酸乙酯、亚油酸乙酯、月桂酸乙酯、亚麻酸乙酯、反油酸乙酯,这些酯类在中高温大曲中普遍存在[14]。Q9中含量较高的物质有2-乙基-6-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、合金欢醇、1-壬醇、异戊醇、苯乙醇、壬酸、己酸、乙酸,主要为吡嗪类物质和醇、酸等形成酯类的前体物质。Q8中含量较高的主要为吡嗪类物质,包括四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等,吡嗪类是白酒中重要的香气化合物之一[15],四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪可以赋予大曲坚果和烘烤香气[16],还可以在医学领域表现出各种生理活性,如扩张血管、改善血液循环和保护肝脏[17]。Q7中含量较高的物质有糠醛、己酸己酯、正丁醇、丙酸、甲酸甲酯、2,3-丁二醇、苯乙醛,其中2,3-丁二醇是呈甜味物质,能让酒的口感更加醇厚绵甜、自然[18],但是糠醛则为白酒中典型不良风味物质糠味的来源[19]。Q6中含量较高的风味物质有甲苯,3,4-二甲基苯甲醛,9,12-十八碳二烯酸乙酯,1-十二烯,4-戊烯-2-酮,2-正戊基呋喃。Q5中含量较高的风味物质有α-石竹烯、苯乙酮、对二甲苯、乙苯、苯戊酮、2,4-二甲基苯甲醛、4-吡啶甲醛、3-甲基吡啶、1-石竹烯。值得注意的是,甲苯、乙苯、4-戊烯-2-酮、对二甲苯、3-甲基吡啶这些Q5、Q6含有的风味物质,在白酒中属于典型的不良风味物质,即便浓度极低也会严重干扰酒体[20]。
图4 不同挺温时间大曲风味物质韦恩图
Fig.4 Venn diagram of flavor substances of Daqu in different in different maximum-temperature keeping time
图5 不同挺温时间大曲风味物质聚类热图
Fig.5 Clustering heatmap of flavor substances of Daqu in different maximum-temperature keeping time
2.4 理化性质、可培养微生物及挥发性风味物质相关性分析
利用Origin2025进行6种大曲的主成分分析,样本散点相互距离越近,意味着样本特征越相近[21];变量之间夹角呈锐角代表正相关,夹角呈钝角时为负相关[22],变量直线投影距离越长对样本分离的贡献越大[23];样本散点和变量箭头之间的距离反映出相关样本里这个变量的大小[24]。如图6-a所示,样本散点之间较为离散,说明挺温时长对大曲理化性质和可培养微生物数量有显著影响。糖化力、酯化力、液化力、水分、发酵力、乳酸菌、霉菌、酵母菌等变量之间的夹角为锐角,说明它们之间呈正相关性,芽孢杆菌、细菌、酸度与上述变量夹角为钝角,说明两部分指标呈负相关性,芽孢杆菌与发酵力在横轴上的投影较长,对样本分离贡献度大。将理化性质与可培养微生物数量进行关联性分析,由图6-b可知,挺温时间与糖化力、发酵力、液化力、酯化力等发酵性能指标呈负相关;细菌、芽孢杆菌与酸度有较强的正相关性;酵母、霉菌与液化力、糖化力、酯化力有较强的正相关性;酵母、霉菌、乳酸菌与发酵力有较强的正相关性。持续高温有利于细菌与芽孢杆菌的生长,较大的水分有利于霉菌及酵母菌的生长。
a-PCA图;b-气泡图
图6 理化数据和可培养微生物生物量间的关联性分析
Fig.6 Correlation analysis of physicochemical indexes and culturable microbial biomass
针对图4中的29种共有风味物质,按照去除最小主成分中具备最大量特征值物质的准则进行筛选,直至前2个主成分的累计贡献率达到80%以上[7]。通过筛选,从29种风味物质中剔除了4种最小主成分中最大量特征值物质,将余下25种物质通过Origin进行PCA,根据图7可知Q5、Q6聚为一类,Q7、Q8间距离较短,Q9、Q10间距离较短,与聚类热图结果相似,说明这25种物质能较好地代表大曲整体风味物质的变化规律。第一主成分(PC1)占61.5%,25种物质在PC1上均呈正相关,苯乙酸乙酯与壬酸乙酯在横轴的投影较长;第二主成分(PC2)占17.7%,14种物质在PC2上呈正相关,11种物质在PC2上呈负相关,2,3,5-三甲基吡嗪与肉豆蔻酸乙酯在横轴的投影较长。酵母、乳酸菌、霉菌与风味物质之间的夹角为钝角,说明它们之间呈负相关关系;芽孢杆菌、细菌与风味物质之间的夹角为锐角,说明它们之间呈正相关关系,芽孢杆菌及霉菌在横轴的投影较长,说明它们对风味的影响较大。
图7 风味物质和可培养微生物生物量间的PCA
Fig.7 PCA of flavor substances and culturable microbial biomass
3 结论
对不同挺温时间的中高温大曲进行分析可知,理化方面,除水分持续下降外,其余指标均呈先增后降趋势,其中液化力和发酵力在挺温时间为6 d时达到峰值,糖化力和酯化力在挺温时间为7 d时达到峰值;可培养微生物方面,细菌、乳酸菌、酵母菌的生物量随挺温时间的增加呈先增后降趋势,霉菌呈持续下降趋势,芽孢杆菌则为持续上升趋势。霉菌的生物量在挺温5 d的样本中达到最高,其余4种菌则在6～7 d时达到最高。采用HS-SPME-GC-MS共检测出99种风味物质,其中29种为共有风味物质,各样本中酯类物质含量最高,其次为吡嗪类物质。聚类热图表明,酯类物质在Q10样本中占优势,吡嗪类物质在Q8中占优势。由相关性分析可知,除酸度外的理化性质与乳酸菌、霉菌、酵母菌呈正相关,且与芽孢杆菌、细菌、挺温时间呈负相关关系,风味物质与酵母、霉菌、乳酸菌呈负相关关系,且与芽孢杆菌、细菌、挺温天数呈正相关关系。本研究初步探究挺温时间对中高温大曲理化性质、可培养微生物、挥发性风味物质的影响。发现较长挺温时间可增加芽孢杆菌、细菌生物量及大曲挥发性风味物质种类和含量,但会降低酵母、乳酸菌、霉菌的生物量及发酵性能,故挺温时间的选择取决于企业是风味导向还是发酵性能导向,此规律为酿酒制曲提供理论参考。
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