玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)广泛存在于霉变玉米、小麦以及以这些谷物为原料的食品和饲料中[1],是对人类和动物健康造成严重威胁的一种霉菌毒素[2]。我国是玉米加工大国,玉米浆是玉米加工过程中的一种重要副产物,因其含有ZEN等毒素而无法被高效利用[3]。因此,绿色高效地解决玉米浆中霉菌毒素污染问题具有重大的现实意义。
近年来,研究人员发现漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)除了可以降解木质素等多酚物质外,还可以高效降解霉菌毒素[4-5]。如SUN 等[6]发现地衣芽孢杆菌 ZOM-1中的漆酶 CotA可降解 98.58%的 ZEN;符浩东等[7]发现来源于粉红黏帚霉的漆酶 zhd-6可降解 65.1%的 ZEN。SUN等[8]的研究发现,来自Pleurotus pulmonarius和Aspergillus oryzae的2种漆酶PpLac1和AoLac2,经过优化后,对ZEN的降解率分别达到78.90%和80.60%。然而,当应用于成分复杂的玉米浆中时,PpLac1对ZEN降解率显著下降至50.93%。这与玉米浆自身特点有密切关系,玉米浆中富含蛋白质、酚类及芳香族化合物等物质,会与ZEN竞争降解酶的活性位点,从而抑制酶解活性[9]。玉米浆中的固体颗粒、胶体及大分子物质会包裹ZEN或阻碍酶与底物的接触,产生传质限制,降低酶解效率[10]。增加漆酶的稳定性,并降低酶的使用成本是解决上述问题的关键。酶的固定化技术被认为是克服以上问题的理想方法,常见固定化酶的方法可分为载体固定化和无载体固定化[11]。在无载体固定化技术中,交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates, CLEAs)作为一种较新的策略,采用沉淀与交联相结合的方式实现酶的固定[12-13]。该技术已成功用于脂肪酶[14]、纤维素酶[15]和α-淀粉酶[16]等多种酶的固定,固定化后的酶均展现出显著增强的稳定性与催化效率。但目前,通过CLEAs技术对漆酶进行固定,以提升其在复杂基质(玉米浆)中稳定性、重复实用性及降解效率的研究有待深入。
本研究采用CLEAs技术对漆酶进行固定化,优化制备工艺参数,系统评估固定化酶的催化性能、稳定性及结构特征,以提升其在玉米浆中降解ZEN的效率,为开发低成本、高稳定酶法降解ZEN技术提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
菌种E.coli BL21(DE3) -pET-PpLac-30a,本实验室保藏;戊二醛(质量分数25%),上海麦克林生化科技股份有限公司;乙腈、NaCl、硫酸铵,福晨(天津)化学试剂有限公司;ZEN标准品(纯度> 99%),青岛普瑞邦生物工程有限公司;色谱级甲醇、乙腈,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;聚乙二醇2000(polyethylene glycol 2000,PEG 2000),北京博奥拓达科技有限公司;乙醇、异丙醇,天津市富宇精细化工有限公司;酵母浸粉、胰蛋白胨,北京奥博星生物科技有限公司。
LB培养基(g/L): 酵母浸粉 5,NaCl 10,胰蛋白胨 10。121 ℃高压湿热灭菌15 min。
1.2 主要仪器与设备
UNIVERSAL 320R 高速冷冻离心机,德国 Hettich公司;SW-CJ-1FD型单人单面超净工作台,苏州净化设备有限公司;BXM-30R 立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;TU-1810 紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;DK-8D三孔电热恒温水槽,上海一恒科技有限公司;ZWY-2102C 恒温振荡培养箱,上海智城分析仪器制造有限公司;Regulus 8100扫描电镜,日本日立公司;Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 漆酶的制备
将活化的E.coli BL21(DE3)-pET-PpLac-30a工程菌接种于LB培养基,37 ℃培养至OD600值约为0.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG和1 mmol/L CuSO4 在25 ℃诱导表达10 h。收获菌体,经超声波破碎与离心,所得上清液作为漆酶粗酶液。经镍柱进行纯化,并在-4 ℃保存备用。
1.3.2 酶活力测定
参考OUYANG等[17]的方法,稍作改进。取适量酶液加入到2.9 mL ABTS(终浓度为1.0 mmol/L)的缓冲液(pH=3.5)中,在40 ℃反应3 min。于420 nm下测定OD值,酶活力的测定结果取3次平行实验的平均值。酶活力单位(U):在一定的条件下,每min氧化1 μmol ABTS所需要的酶量定义为1个酶活力单位。
1.3.3 PpLac-CLEAs制备工艺优化
参照文献[18]的方法制备PpLac-CLEAs,稍作修改。向0.1 mL的游离酶溶液中加入1 mL 0.52 g/mL的硫酸铵溶液中,4 ℃下沉淀40 min后,加入戊二醛溶液至终溶度为体积分数0.5%,在35 ℃反应4 h后,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,并用去离子水洗涤3次,置于4 ℃保存备用。
选用5种沉淀剂,乙醇、乙腈、异丙醇、硫酸铵溶液以及PEG 2000。沉淀剂(硫酸铵)的质量浓度为0.36～0.76 g/mL。向0.1 mL的游离漆酶溶液中加入1 mL 不同质量浓度的硫酸铵溶液,在4 ℃沉淀10～60 min后,混合溶液在10 000 r/min离心10 min后用PBS重悬,测定酶活力,计算酶活力回收率。
1.3.4 交联过程参数的优化
交联剂选用戊二醛(0.1%～1.1%,体积分数),在25～45 ℃交联温度条件下,交联1～5 h。最后,将得到的PpLac-CLEAs离心(12 000 r/min、10 min、4 ℃)回收,使用PBS (pH 7.4)洗涤后于4 ℃冷藏备用。测定酶活力并计算酶活力回收率。
1.3.5 扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)和傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)测定
将样品通过镀膜器溅射涂金处理,利用SEM对PpLac-CLEAs 表面形貌的观察。使用FT-IR仪分析游离酶和PpLac-CLEAs的结构。通过使用PeakFit V4.12软件研究酰胺Ⅱ区域(1 600～1 700 cm-1)来分析游离酶和PpLac-CLEAs的二级结构。
1.3.6 PpLac-CLEAs的酶学性质分析
1.3.6.1 温度对酶学性质的影响
PpLac-CLEAs和游离酶的最适温度测定,分别在30～60 ℃条件下进行反应,以最高酶活力为100%计算相对酶活力;其温度稳定性探究分别在60～70 ℃下孵育10～60 min后测定剩余酶活力,未处理样品为对照组。
1.3.6.2 pH对酶学性质的影响
PpLac-CLEAs和游离酶的最适pH测定,分别在pH 2.5～4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中进行反应,以最高酶活力为100%计算相对酶活力;分别在pH 3.0～12.0条件下冰浴1 h后,测定剩余酶活力,探究pH稳定性,未处理样品为对照组。
1.3.6.3 金属离子和有机溶剂的耐受性
将终浓度为5 mmol/L的金属离子(Na+、K+、Cu2+、Mg2+、Zn+、Ca2+、Mn2+、Li+、Fe2+、Ag+)和有机溶剂(丙酮、乙醇、吐温-80、尿素、SDS、甲醇)置于酶活力反应体系中,在其最适温度和最适pH下测定其对PpLac-CLEAs和游离酶的影响。
1.3.6.4 酶动力学参数测定
不同浓度(0.15～0.6 mmol/L)的ABTS条件下,参照标准酶活力测定方法,采用双倒数作图法,绘制双倒数Lineweaver-Burk曲线[19],计算Vmax和Km。
1.3.7 PpLac-CLEAs的储存稳定性及重复性测定
游离酶和PpLac-CLEAs在4 ℃储存21 d,每隔3 d取样,参照1.3.2节的方法测定剩余酶活力,初始酶活力定义为100%,探究其储存稳定性。
通过测定连续6个重复使用周期中的酶活力来评价PpLac-CLEAs的可重复性,初始酶活力设为100%。
1.3.8 PpLac-CLEAs对受污染样品玉米浆中毒素降解
向受污染的玉米浆样品(0.1 mL)中分别加入PpLac-CLEAs和游离酶(9～15 U)和ABTS (终浓度10.0 mmol/L),用水调节体积至0.8 mL,在45 ℃下反应24 h,加入相同体积的乙腈提取20 min,12 000 r/min离心5 min后,上清液经0.22 μm有机过滤膜过滤,采用 HPLC 法测定残留ZEN毒素含量。色谱柱为 C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。HPLC检测条件:柱温30 ℃,流速0.6 mL /min,进样量20 μL,检测波长236 nm,流动相为V(甲醇)∶V(水)=70∶30。
1.4 数据统计分析
实验数据采用SPSS 27.0和Microsoft Excel 2016进行统计分析,结果以“平均值±标准差”表示,相关图表使用GraphPad Prism 8.0绘制。
2 结果与分析
2.1 PpLac-CLEAs制备条件的优化
2.1.1 沉淀过程参数优化
沉淀剂种类对酶活力的回收有重要影响[20]。本研究采用中性盐(硫酸铵),有机溶剂(乙腈、乙醇和异丙醇)和非离子聚合物(PEG 2000)作为沉淀剂制备PpLac-CLEAs,结果见图1-a,硫酸铵为沉淀剂,PpLac-CLEAs的酶活力回收率为96.28%。在有机溶剂中,PpLac-CLEAs的酶活力回收率较硫酸铵有不同程度的下降,酶活力回收率在50%～80%。酶活力下降源于其构象发生了变化,而这可能是有机溶剂分子包围了酶内部的疏水残基,削弱了维持蛋白质折叠的驱动力,从而导致酶发生构象松弛甚至部分展开,活性丧失[21]。在PEG 2000中,PpLac-CLEAs的活性回收率显著下降,酶活力回收率为9.49%。可能由于PEG 2000的黏度高,减缓分子扩散速率,影响漆酶分子与PEG 2000的充分作用,并阻碍酶聚集体有效移动和富集,所以在固定的离心时间和离心力下,难以从溶液中分离交联酶,导致回收率降低。KULKARNI等[22]发现,芳基酰胺酶经硫酸铵沉淀后,酶活力回收率约90%,与本研究结果相似。因此,选择硫酸铵作为沉淀剂进一步开展研究。
如图1-b所示,当硫酸铵的质量浓度为0.36 g/mL时,酶活力回收率低,可能是游离漆酶不完全沉淀引起的。当硫酸铵的质量浓度增加到0.52 g/mL,酶活力回收率出现明显上升。质量浓度在0.52～0.76 g/mL,酶活力回收率保持在92%以上,当质量浓度为0.68 g/mL时,酶活力回收率达到最高98.67%,可能较高质量浓度的硫酸铵可加速酶蛋白的沉淀过程,有助于维持其空间结构的相对完整性,从而降低对酶活性中心的破坏程度[23]。为了节约成本,选择硫酸铵质量浓度为0.52 g/mL为最佳浓度。
如图1-c所示,随着沉降时间的增加,PpLac-CLEAs酶活力回收率先升高后保持稳定,当沉降时间为40 min时酶活力回收率最高,为97.47%。因此,最终确定沉淀过程的最佳条件为:沉淀剂硫酸铵、质量浓度0.52 g/mL、沉淀时间40 min。
a-沉淀剂;b-硫酸铵质量浓度;c-沉淀时间
图1 沉淀条件对PpLac-CLEAs酶活力回收率的影响
Fig.1 Effect of precipitation conditions on enzyme activity recovery in PpLac-CLEAs
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.1.2 交联过程的优化
交联剂的浓度是制备PpLac-CLEAs的关键参数之一。如图2-a所示,随着交联剂(戊二醛)含量的增加,酶活力回收率先增加后下降。当戊二醛体积分数<0.5%时,PpLac-CLEAs的酶活力回收率较低,这可能是由于交联不足,从而使PpLac-CLEAs在水中过于灵活和不稳定。当交联剂戊二醛体积分数为0.5%时,酶活力回收率最高,为58.43%。当交联剂戊二醛体积分数为1.1%时,酶活力回收率下降至38.65%,这可能是由于过度交联引起的PpLac-CLEAs中刚性增加和底物扩散受限。
如图2-b所示,在25～45 ℃,PpLac-CLEAs的酶活力回收率先上升后下降,在35 ℃达到最高45.54%。当温度>35 ℃,PpLac-CLEAs的活性下降。可能由于在高温下的戊二醛与酶分子上的氨基反应速率急剧加快,戊二醛的反应选择性降低。它可能直接攻击靠近活性中心的关键氨基,或者形成过多、过密的交联键,这些“破坏性交联”会直接破坏酶的催化能力或使其构象变得刚性过强而失活。在后续的酶热稳定性研究中,游离酶和PpLac-CLEAs在60 ℃高温孵育1 h后,酶活力均保留90%以上,表明漆酶的三维结构在60 ℃时相当稳固。因此,在60 ℃以下的交联温度下,酶蛋白并不会发生大规模的热变性。
交联时间是影响制备PpLac-CLEAs效率的关键参数之一。如图2-c所示,酶活力回收率随交联时间延长呈先增后降的趋势,并在4 h达到峰值。随后的下降可能归因于过度交联对酶活性的负面影响。因此,确定最佳交联条件为:戊二醛体积分数0.5%、交联温度35 ℃、交联时间4 h。
a-戊二醛体积分数;b-交联温度;c-交联时间
图2 交联条件对PpLac-CLEAs酶活力回收率的影响
Fig.2 Effect of crosslinking conditions on enzyme activity recovery in PpLac-CLEAs
2.2 电镜结果分析及二级结构分析
CLEAs 的微观形貌可划分为2种典型结构类型,即Ⅰ型和Ⅱ型[24]。Ⅰ型结构呈现规则球形,孔隙率较高,有利于底物扩散;而Ⅱ型结构则由松散聚集形成不规则大颗粒,内部结构较为致密、孔隙率低。如图3-a所示,所得PpLac-CLEAs呈粗糙、多孔的无定形结构,可归类为Ⅱ型。表面存在颗粒凸起,这种结构表明其具有较大的比表面积,有利于酶与底物之间的充分接触。
a-PpLac-CLEAs的SEM图;b-游离酶和PpLac-CLEAs的FT-IR光谱
图3 PpLac-CLEAs 的 SEM 图和 FT-IR光谱图
Fig.3 SEM images and FT-IR spectra diagrams of PpLac-CLEAs
酶的催化性质密切依赖其空间构象,特别是二级结构的稳定性[25]。为探究固定化对游离酶构象的影响,本研究采用FT-IR分析了游离酶及PpLac-CLEAs的酰胺Ⅱ带(1 600～1 700 cm-1),并利用PeakFit V4.12软件对谱图进行分峰拟合,以定量计算各二级结构元件的含量(图3-b)。结果显示,固定化引起了酶蛋白二级结构的显著变化。与游离酶相比,PpLac-CLEAs中α-螺旋含量由17.86%增加至21.46%,而无规卷曲结构由11.11%增加至19.67%。与此同时,β-折叠含量从27.99%降至22.79%,β-转角含量从43.04%降至36.09%。综合来看,α-螺旋含量的增加和β-转角的减少共同表明PpLac-CLEAs的二级结构刚性得到了增强。这一结论与ATIRO
LU等[26]在α-淀粉酶固定化研究中的发现一致。结构刚性的提高有助于稳定酶分子的整体三维构象,这为解释PpLac-CLEAs在热稳定性、pH稳定性及操作稳定性方面的提升提供了分子层面的依据。
2.3 PpLac-CLEAs的酶学性质分析
2.3.1 最适温度和 pH 值及其稳定性
如图4-a所示,与游离酶最适温度40 ℃相比,PpLac-CLEAs最适温度由40 ℃提升至45 ℃,在50 ℃下,PpLac-CLEAs的相对活性可保持92.87%,而游离酶相对活性76.12%。最适反应温度和稳定性的提升可归因于戊二醛诱导蛋白质分子间形成共价交联,增强了酶的空间构象刚性,使其在受热条件下不易发生构象变形或结构破坏[27]。此外,游离酶和PpLac-CLEAs在60、65、70 ℃下孵育1 h后,两者的酶活力均保留60%以上且无显著差异(图4-b),说明漆酶本身具有良好的热稳定性,固定化进一步扩展了酶的温度适用范围。
如图4-c所示,与游离酶的最适pH 3.5相比,PpLac-CLEAs的最适pH值为3.0,有所降低,表明固定化提高了漆酶在酸性环境中的适应性,扩展了其有效作用pH范围。如图4-d所示,在pH 3.0～12.0条件下冰浴1 h后,PpLac-CLEAs表现出比游离酶更广泛的pH稳定性,尤其在pH 4.0～11.0范围内,PpLac-CLEAs的相对酶活力均在90%以上;即使在碱性条件下(pH 12.0)其相对酶活力仍达79.09%,显著高于游离酶的54.11%。PpLac-CLEAs pH稳定性的增强主要归因于戊二醛引发的分子间共价交联,这种交联能够降低极端pH条件下酶分子带电状态变化对活性中心关键氨基酸解离状态的扰动,从而保护酶的催化构象不受严重破坏。此外,交联聚集体的物理包埋效应也可能限制H+或OH-向酶分子内部的扩散速率,进一步缓冲了pH冲击对酶结构的直接影响[28]。
a-最适温度;b-温度稳定性;c-最适pH;d-pH稳定性
图4 游离酶和PpLac-CLEAs的酶学性质
Fig.4 Enzymatic characterization of free enzymes and PpLac-CLEAs
2.3.2 金属离子和有机溶剂对PpLac-CLEAs的影响
如表1所示,在终浓度为5 mmol/L的金属离子中,Zn+、Mn2+和Cu2+对PpLac-CLEAs和游离酶均表现激活作用。与之相反,Fe2+和Ag+则表现出抑制,但PpLac-CLEAs表现出更强的耐受性,在Fe2+和Ag+的干预下,相对酶活力保持在30.43%、67.93%,而游离酶的相对酶活力为4.01%、23.25%,与游离酶相比,PpLac-CLEAs对Fe2+、Ag+的耐受性分别提高了26.42%、44.68%。Ca2+对PpLac-CLEAs具有激活作用,而对游离酶产生抑制作用。在有机溶剂耐受性方面,PpLac-CLEAs也表现出优于游离酶的耐受力,尤其在SDS和吐温-80溶剂中,游离漆酶的活性几乎被完全抑制,而PpLac-CLEAs仍保持5.55%、48.43%的残余酶活力。与游离酶相比,PpLac-CLEAs对吐温-80的耐受性提高了43.92%。这种耐受性的提升可能源于戊二醛交联形成的刚性结构,有效减弱了溶剂分子对酶活性中心的扰动,并限制了金属离子接近酶分子关键位点,从而增强其在不同化学环境下的构象稳定性[29]。
表1 金属离子及有机试剂对游离酶和PpLac-CLEAs活性的影响
Table 1 Effect of metal ions and organic reagents on free enzyme and PpLac-CLEAs activity
金属离子/有机试剂相对酶活力/%PpLac-CLEAs游离酶CK100100Na+72.41±3.0865.17±1.28Zn+101.61±4.15103.60±3.81Ca2+133.52±1.0773.41±3.13Fe2+30.43±7.344.01±0.65Mn2+113.83±9.91104.06±5.29Mg2+40.15±2.5565.43±0.41Cu2+109.09±2.30125.57±2.99K+16.29±2.2331.43±2.31Li+53.41±4.4565.28±5.26Ag+67.93±1.7923.25±3.85尿素107.18±3.8792.66±2.89甲醇101.21±4.8095.44±2.84丙酮82.60±0.1370.48±2.93乙醇95.36±4.7991.59±6.72SDS5.55±4.600±0吐温-8048.43±6.454.51±4.05
2.3.3 动力学参数测定
如表2所示,PpLac-CLEAs的米氏常数Km为0.86 mmol/L,最大反应速度Vmax为11.148 mmol/(L·min),与游离酶相比,PpLac-CLEAs的Km值提高了3.3倍,Vmax值提高了1倍。Km值的显著上升表明固定化后酶对底物的亲和力有所降低。这一变化可能与酶分子构象的改变密切相关。二级结构分析结果显示,PpLac-CLEAs中α-螺旋含量的增加与β-转角的减少,导致酶分子整体刚性增强。这种结构上的刚化,可能在一定程度上阻碍了底物与催化位点的有效结合,从而导致底物的亲和力下降。然而,一旦底物进入活性中心,经固定化形成的微环境可能更有利于后续的电子传递与催化[30],导致Vmax增大。
表2 游离酶和PpLac-CLEAs的酶学性质对比
Table 2 Comparison of enzymatic properties between free enzyme and PpLac-CLEAs
酶学性质PpLac-CLEAs游离酶最适温度/℃4540最适 pH33.5Km/(mmol/L)0.860.2Vmax/[mmol/(L·min)]11.1485.577
2.4 PpLac-CLEAs重复使用性及储存稳定性
本研究评估了PpLac-CLEAs在连续使用6次循环中的酶活力变化(图5-a)。首次使用后,PpLac-CLEAs保留了81.4%酶活力,该阶段酶活力下降较为明显,推测是由于部分酶分子未充分交联、仅吸附于聚集体表面,在洗涤与离心回收过程中发生脱落所致[31]。在使用6次后,PpLac-CLEAs仍能维持初始酶活力的63.4%,表现出良好的操作稳定性。
a-重复使用性;b-储存稳定性
图5 PpLac-CLEAs的重复使用性和储存稳定性测定
Fig.5 Reusability and storage stability testing of PpLac-CLEAs
图5-b显示了游离酶和PpLac-CLEAs在4 ℃下储存21 d的稳定性变化。储存21 d后,PpLac-CLEAs保留64.49%的初始活性,而游离酶仅保留了27.96%,固定化处理显著增强了漆酶的贮存稳定性。这一改善主要归因于戊二醛介导的分子间交联增强了酶分子的结构刚性,有效减缓了在储存条件下酶蛋白的构象松弛与变性失活过程。在交联脂肪酶[32]、α-淀粉酶[16]等研究中学者也得到了类似的结果,说明CLEAs技术对提升酶长期储存性能具有普适性优势。
2.5 CLEAs对玉米浆中的ZEN毒素降解
在玉米浆体系中,当游离酶添加量分别为9、15 U时,对ZEN的降解率分别为3.38%、4.83%。该降解率显著低于SUN等[8]报道的来自Pleurotus pulmonarius的PpLac1漆酶对玉米浆中ZEN降解率(50.93%)。研究表明,不同来源的漆酶对饲料原料中霉菌毒素降解效果存在明显差异。如谷晓丹[4]发现来自Weizmannia coagulans的Lac-W漆酶可以高效降解来自母猪妊娠全价料和棉籽粕中的ZEN,降解率分别达85.2%和100%。此外,SUN等[6]发现来自Bacillus licheniformis ZOM-1的CotA漆酶对小麦粉和玉米粉中的ZEN和AFB1的降解率为30%～40%。PpLac漆酶来源于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)STS-6,属于乳酸菌来源的漆酶,具有良好的生物安全性。
PpLac-CLEAs在相同添加量(9、15 U)下对ZEN的降解率显著提升至28.71%、29.47%,表明固定化处理有效增强了漆酶在玉米浆中的催化性能。这种提升主要归因于CLEAs技术赋予酶分子的结构刚性增强,能够更好地抵抗玉米浆中复杂成分(包括变性剂、亚硫酸盐、吸附物质、蛋白酶等)的不利影响,从而维持较高的催化活性与稳定性。
3 结论
本研究基于CLEAs技术对漆酶进行固定化,以提高其稳定性与重复使用性,拓展在霉菌毒素降解等工业应用中的潜力。通过系统优化,确定最佳固定条件:0.52 g/mL的硫酸铵为沉淀剂、体积分数为0.5%戊二醛为交联剂、交联4 h,该条件下PpLac-CLEAs的酶活力回收率达58.43%。固定化后,酶的催化特性发生显著变化:最适pH值由3.5降到3.0,最适温度由40 ℃提高至45 ℃,且在pH 4.0～11.0的广泛范围内仍能维持90%以上的酶活力,在极碱条件(pH 12.0)下,比游离酶的酶活力高24.98%,表明固定化有效增强了漆酶对外部环境的抵抗能力。对金属离子(Fe2+、Ag+)和有机试剂(吐温-80、SDS)的耐受性显著高于游离酶,展现出在复杂成分体系中更好的适用性。此外,PpLac-CLEAs表现出优良的操作稳定性,重复使用6次后仍保留63.4%的酶活力。在4 ℃储存21 d后,残余酶活力为64.49%,显著优于游离酶,有利于降低酶的使用成本。二级结构分析表明,固定化后漆酶分子结构的刚性增强,稳定性增强。此外,PpLac-CLEAs对ZEN毒素的降解率最高达到29.47%,约为游离酶的6倍。综上所述,基于CLEAs技术固定化漆酶有效克服了游离酶稳定性差、难以回收的缺点,显著提升了其在宽pH、高温、金属离子及有机溶剂等苛刻条件下的适应性与重复使用性,为漆酶在毒素降解、工业生物催化等领域的实际应用提供了可靠的技术支撑。
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