酱香型白酒是中国白酒四大基本香型之一,具有酱香突出、回味悠长、空杯留香持久的风味特征[1],这种独特的风味特征主要源于复杂的多轮酿造及发酵工艺,即二次投料、九次蒸煮、八次发酵、七次取酒;其中七轮次基酒各具特色,是构成成品酒口感丰富、香气协调平衡的基础[2]。研究表明,轮次基酒的风格特点差异主要归因于其所含化合物种类和含量不同。LIU等[3]在贵州产区酱香轮次基酒中准确定性出246种挥发性风味化合物,表明轮次基酒主要区别来自于化合物含量上的差异;孙优兰等[4]发现一、二轮次基酒醇类物质含量占比最高,三至七轮次酯类含量占比最高,这些风味物质量比差异是轮次基酒香气口感丰富多样的物质基础。目前,对酱香轮次基酒挥发性化合物的研究较多,而对于其高沸点化合物的系统研究却较少。高沸点化合物是个相对宽泛的概念,定义较为模糊。但越来越多的研究表明,白酒的风味体验是低沸点与高沸点化合物共同作用的结果[5]。并且酱香型白酒的“四高工艺”(高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温蒸馏等)也导致其高沸点化合物的复杂性远高于其他香型白酒。因此,对酱香型白酒轮次基酒中高沸点化合物的解析应该得到更多的关注[6]。
白酒风味体验是一种复杂的多模态感知,是嗅觉、味觉等多种感知系统协调作用的结果[7-8]。只关注单一化合物的风味贡献可能会忽略一些无明显风味特征却能通过化合物相互作用对食品风味进行调节的物质[9]。非靶向代谢组学技术通量高、无偏倚,是解析复杂体系化学组分的有力工具。超高效液相色谱-高分辨质谱(ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UPLC-HRMS)分辨率超60 000,可同时检测多类物质,在传统发酵食品新型功能化合物发掘研究中应用潜力突出[10]。然而,面对分析物的高度异质性和未知性,以及海量数据的处理难题,实现化合物的全面识别与有效监测仍存在显著挑战[11]。为突破这一技术难题,基于质谱的分子网络技术应运而生,该技术可以通过谱图相似性对数据进行聚类分析。随后谈晓梅等[12]将其创新性应用于代谢组学分析,通过改进的余弦相似性算法量化谱图相似性,使相似的谱图自动聚类形成可视化网络,显著提升了数据挖掘效率与化合物鉴定通量。
基于上述科学问题,本研究将酱香型白酒经过真空蒸馏后留下并通过超高效液相色谱-轨道阱高分辨质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry,UPLC-Orbitrap-HRMS)检测出的化合物定义为高沸点化合物。通过构建基于结构导向的分子网络注释策略(structure-guided molecular networking strategy, SGMNS),结合项目组前期基于文本挖掘建立的中国白酒成分数据库(Chinese Baijiu Composition Database,CBDB)[11]进行数据挖掘。对酱香型白酒一至七轮次基酒中的高沸点组分进行表征,以期阐明不同轮次基酒高沸点化合物组成特征及挖掘轮次关键差异化合物,为厘清酱香型白酒轮次基酒风格差异及特点建立数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验样品为贵州某酱香型白酒企业提供的一至七轮次酱香基酒。每个轮次基酒分别从不同厂房与车间进行取样,各采集6个独立样品(n=6),共计42份轮次基酒;甲醇、乙腈、无水乙醇(均为色谱纯),德国默克公司;甲酸(色谱纯),中国百灵威科技公司;NH4HCO3(分析纯),美国Fluka公司;苯丙氨酸-d5(纯度≥99.9%),美国MedChemExpress公司。
1.2 仪器与设备
Aquaplore 3S超纯水系统,美国艾科浦国际有限公司;SyncorePlus/V-300真空蒸馏系统,步琦实验室设备贸易(上海)有限公司;PL3002电子天平,瑞士Mettler Toledo公司;Thermo Exploris 120超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪,美国赛默飞世尔科技。
1.3 实验方法
1.3.1 样品预处理
分别取42份一至七轮次待测基酒各10 mL,混合均匀制备成质控样品(quality control,QC);取待测轮次基酒及QC各30 mL分别置于旋蒸瓶中,加入100 μL质量浓度为2 μg/mL的苯丙氨酸-d5内标溶液涡旋振荡;通过真空蒸馏系统(150 r/min,50 ℃,35 mbar)旋蒸至1.5 mL,甲醇定容至2.0 mL。质量分数为53%乙醇水溶液做同样处理为空白对照。上述样品涡旋混匀后通过微孔滤膜(0.22 μm)过滤,分析前贮存在样品瓶中。
1.3.2 UPLC-Q/Orbitrap HRMS分析
正电离模式色谱条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C8(1.7 μm, 2.1 mm×50 mm),柱温60 ℃,流动相流速0.4 mL/min。流动相A1:0.1%甲酸(体积分数)水溶液,流动相B1:0.1%甲酸(体积分数)乙腈溶液。流动相初始比例是5% B1,维持0.5 min。随后在1.5 min内线性升至40% B1,在6 min内线性升至100% B1,维持2 min。在0.1 min内降至5% B1,并维持1.9 min。总梯度时间为12 min。
负电离模式色谱条件:色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8 μm, 2.1 mm×50 mm),柱温60 ℃,流动相流速0.4 mL/min。流动相A2:6.5 mmol/L NH4HCO3水溶液,流动相B2:6.5 mmol/L NH4HCO3的95%甲醇溶液(体积分数)。流动相初始比例是2% B2,维持0.5 min。随后在1.5 min内线性升至40% B2,6 min内线性升至100% B2,维持5 min。在0.1 min内降至2% B2,并维持1.9 min。总梯度时间为12 min。
质谱条件:电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)源,正、负电离模式下电压分别为3 500、-3 000 V,毛细管温度300 ℃,辅助气温度 350 ℃。鞘气和辅助气体分别为45、10 psi。采用全扫描结合数据依赖采集模式(data-dependent acquisition,DDA)。全扫描的分辨率120 000,MS2分辨率60 000;正电离模式的扫描范围为70～1 050 Da,负电离模式的扫描范围为66.7～1 000 Da。IDA模式的碰撞能量为15%、30%、45%。
1.4 数据处理与分析
HRMS数据(*.raw文件)通过MSconvert转换为MS/MS.mgf文件,MS-DIAL v 5.1软件用于提取峰强度并通过以下参数进行峰对齐,MS1和MS2容差分别设置为0.005 Da和0.01 Da,最小峰宽和tR容差分别设置为3.0 Da和0.2 min,其他参数使用默认值[13];CBDB[11]通过相同的文本挖掘工作流程进行了改进,以补充2021～2024年在中国白酒中发现的新化合物;SGMNS进行分子网络策略定性,定性得分(Score)>0.5,MS1相似度(Sim 1)及MS2相似度(Sim 2)>0.4,则化合物被鉴定。按照“5倍空白原则”及“80%法则”处理初步鉴定的化合物,即除去样品化合物峰面积<5倍空白样品化合物峰面积且在每组中占样品<20%的任何化合物。缺失值采用该化合物最小峰面积的1/5倍进行替换。再合并处理正/负离子扫描模式下分别鉴定出的化合物,经校准及去冗余,得到白酒中潜在的高沸点化合物清单。化合物通过ClassyFire(https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/)[14]进行分类;使用Python、SPSS AU进行统计学分析;使用Metaboanalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)进行数据可视化及正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 基于SGMNS的高沸点化合物定性分析
白酒中风味物质是微生物发酵代谢产生,彼此并不孤立,而是通过复杂的代谢反应彼此联系,因此通过相似结构可能具有相似MS2谱的原理,基于结构导向的分子网络策略可以有效提高注释率[15-17]。首先,基于文本挖掘的工作流程补充了近几年在中国白酒中发现的新化合物至CBDB,并以此作为定性数据库,将125种标准品MS/MS谱作为“种子”(OSI-SMMS)分配给GCMN中相邻代谢物的“伪”谱;针对理论分子质量、预测的tR和具有精确质量匹配和tR匹配的“伪”谱对非靶向代谢组学数据进行传播注释。如图1-a所示,使用Cytoscape绘制了分子结构网络图,蓝色为鉴定出的化合物,以CBDB中编号标识;红色为最相似的种子,以标准品编号标识;通过Dice系数计算结构相似性(structure similarity,Sim 1),Spec 2Vec计算质谱相似性(spectral similarity,Sim 2),当相同的代谢物特征与注释过程中的结果匹配时,对候选物按照Sim 1及Sim 2以及“伪”谱的Tol MS和Tol RT进行加权评分(Score),Score>0.5被认为是可信结果[18]。
a-结构导向的分子网络注释图;b-高沸点化合物精确分子质量分布;c-PCA
图1 高沸点化合物的结构导向的分子网络注释
Fig.1 Structure-guided molecular network annotation of high-boiling-point compounds
基于SGMNS注释结果,对鉴定的化合物按照Score、Sim 1等数据进行去冗余和人工校准,最终在一至七轮次酱香型轮次基酒中共鉴定出434种化合物。如图1-b所示,负离子模式下鉴定高沸点化合物79种,精确分子质量范围为72.021 12～360.214 80 Da;正离子模式下鉴定高沸点化合物355种,精确分子质量范围为70.041 86～506.360 739 Da。图1-c主成分分析(principal component analysis,PCA)显示,PC1与PC2累积解释能力大于70%,QC样品聚类,数据稳定;轮次基酒呈明显聚类特征,可分为4类,第一、二轮次基酒各自聚类,三、四、五轮次基酒聚为一类,六、七轮次基酒聚为一类,该聚类结果与文献报道的轮次基酒感官特征聚类较一致,发酵前期的一、二轮次基酒酸味、粮香突出;发酵中期的三至五轮次基酒称为“大回酒”,酒体协调丰满;发酵后期的六、七轮次基酒则呈现突出的焦糊味、苦味及后味,上述结果也进一步支持高沸点化合物在酱香轮次基酒典型风格形成中起重要作用[4-19]。
2.2 轮次基酒中高沸点化合物轮廓分析
对鉴定出的434种化合物利用ClassyFire进行分类,如图2所示,在轮次基酒中共检出8大类,27亚类化合物。其中脂质及类脂类110种(25.35%),有机酸及其衍生物类85种(19.59%),苯系物85种(19.59%),有机氧化合物71种(16.36%),有机杂环化合物59种(13.59%),苯丙素和聚酮类12种(2.76%),有机氮化合物9种(2.07%),碳氢化合物3种(0.69%)。脂质及类脂类主要包括脂肪酰基、萜醇酯类等,主要由原料分解、酵母代谢及醇酸类化合物缩合而成,具有特殊的芳香气味,是白酒中占比最大的一类化合物[20];有机酸及其衍生物类主要包括羧酸、羟酸、酮酸类化合物及其衍生物,主要由微生物通过糖氧化或乙醇氧化产生,具有酸味,能够协调口感、遮蔽苦味、增加后味,对酱香型白酒滋味具有重要贡献[21];苯系物主要包括芳香类化合物、酚类、萘类等,主要由原料分解、微生物代谢及陈酿氧化产生,在酱香型白酒中种类及含量较多,可能与生产中高温工艺相关,在酒体中量微香大,呈现花果香、烟熏香等;有机氧化合物主要包括醇类、醛酮类化合物,醇类物质主要由酵母糖代谢、氨基酸分解及酯类水解等产生,是酯类化合物形成的前体物质,能烘托酯香、丰富协调口感、维持酱香型白酒风格的作用,同时高级醇能增加酒体甜度及醇厚度,对酒体滋味具有重要贡献[22];醛酮类在白酒发酵或贮藏过程中通过醇类氧化或酸类脱羧产生,醛类化合物大多呈现青草、清香气味,酮类化合物大多呈现青香、脂香、奶香等[23];有机杂环化合物包括内酯类、吡嗪类、呋喃类化合物等,主要由原料热解、美拉德反应及微生物代谢产生,在酱香型白酒中种类及含量较多,被认为与酱香型白酒生产的高温工艺相关,是酱香型白酒独特风格的物质基础;内酯类化合物主要呈现奶香,吡嗪类、呋喃类主要呈现坚果香、焙烤香等[24]。此外,在轮次基酒中还定性到香豆素及其衍生物、有机氮化合物及不饱和烃类等化合物。
图2 高沸点化合物种类及数量
Fig.2 Categories and quantities of high-boiling-point compounds
轮次基酒高沸点化合物数量分布特征如图3-a所示,一、二轮次基酒分别定性出化合物369种和413种,其余各轮次化合物数量范围为428～431种,其中7个轮次共有化合物360种,相较于其他轮次,一轮次基酒在脂质及类脂类、苯系物类、有机酸及其衍生物类、有机氧化合物及有机杂环化合物五大类化合物上均少于其他轮次基酒。LIU等[3]研究指出挥发性风味化合物的数量在各轮次基酒中相对稳定。此外,除一轮次外,各轮次基酒高沸点化合物数量较为一致(变异系数=1.5%),这种化合物种类上的稳定性表明,一轮次基酒风格特征差异可能受高沸点化合物种类和量比关系2个方面影响,而其他各轮次基酒风格差异的关键因素主要源于高沸点化合物量比关系。进一步对高沸点化合物相对总含量分析,结果如图3所示,一轮次基酒高沸点化合物相对含量最低,为(79.95±11.51) mg/L;五轮次基酒高沸点化合物相对含量最高,为(229.46±13.70) mg/L。高沸点化合物含量在一到五轮次逐渐增加,可能与其沸点较高,存在轮次累积的现象,但随着发酵的进行,底物被消耗,六、七轮次各类高沸点化含量略微下降[25]。在各轮次基酒中,有机杂环化物、有机氧化合物及有机酸及其衍生物含量最高,酱香型白酒酿造过程中高温制曲、高温堆积等工艺为美拉德反应、焦糖化、缩合反应等创造了有力条件,其中有机杂环化物、有机氧化合物是美拉德反应的重要产物;而有机酸因含有羧基能形成强氢键,且分子作用力显著增强,沸点较高,因此相对含量较高;而碳氢化合物通常为非极性,仅靠范德华力,沸点最低,本研究中仅定性出3种,均为C8的长链化合物,相对含量较低[26]。
a-种类分析;b-相对含量分析
图3 高沸点化合物轮廓分析
Fig.3 Profile analysis of high-boiling-point compounds
2.3 轮次基酒高沸点化合物差异分析
轮次基酒中高沸点化合物的量比关系是影响基酒风格特点的关键因素,采用多维度分析策略对轮次基酒关键差异化合物进行筛选,通过对相邻轮次基酒使用单变量统计分析(analysis of variance,ANOVA)联合OPLS-DA以及倍数变化值(fold change,FC)共同筛选差异化合物,当相邻两轮次化合物同时满足P<0.05,|log2FC|≥1且变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1时被认为是差异化合物。如图4所示,7个轮次基酒中,累积发现338种差异化合物,在多轮次中均有出现化合物有87种。从数量上来看,一、二轮次差异化合物最多,共发现179种(上调175种,下调4种);二、三轮次发现75种差异化合物(上调72种,下调3种);五、六轮次差异化合物共32种(上调18种,下调14种)。从差异化合物种类上来看,脂质及类脂分子差异化合物最多(70种);其次为苯系物(56种)、有机酸及其衍生物(45种)。酱香型白酒中,酯类化合物是最丰富的香气成分,在各类香气成分中其占比较大;苯系物则是重要的芳香族化合物,包括其衍生物,如酚类、萘类等都具有香气阈值低、气味突出等特点;而有机酸对酒体的酸度、滋味协调性和风格特征的形成具有重要影响[6]。
一、二轮次差异化合物种类最多的为脂质及类脂分子(59种)和有机酸及其衍生物(39种),部分代表差异化合物含量如图5所示,如具有水果和茉莉样甜香的丁酸苄酯(log2FC=2.68)及呈现酸味的戊酸(log2FC=2.64)在二轮次基酒中显著增加;二、三轮次差异最多的化合物为苯系物(20种),其中呈现馥郁茉莉花香乙酸苄酯(log2FC=1.16)及具有玫瑰花香、甜香且低浓度时呈蜂蜜香的2-苯乙醛(log2FC=2.55)在三轮次基酒中显著增加;五、六轮次基酒中各类化合物均存在一定差异,无明显优势种类区分,值得注意的是,多种吡嗪化合物在六轮次后相对含量明显下调,如2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(log2FC=-1.12),2,6-二甲氧基-3-甲基-5-异丙基吡嗪(log2FC=-1.14)等;吡嗪类化合物多呈焦香、焙烤香等香气特征,主要由芽孢杆菌类微生物发酵代谢合成。这一变化趋势可能与发酵温度相关,一、二轮次(12～2月)发酵环境温度较低,微生物对原料利用相对有限,但在该过程会积聚大量吡嗪类物质的前体乙偶姻,待三至五轮次(3～7月)环境温度升高,微生物代谢合成逐渐旺盛,原料利用率提高,美拉德反应加剧,从而促进吡嗪类化合物的形成[27-28]。
a-高沸点差异化合物火山图;b-差异代谢物数量分析
图4 高沸点差异化合物筛选
Fig.4 Screening of differential high-boiling-point compounds
a-丁酸苄酯;b-乙酸苄酯;c-2,6-二甲氧基-3-甲基-5-异丙基吡嗪;d-戊酸;e-2-苯乙醛;f-2-乙基-3,5-二甲基吡嗪
图5 部分代表差异化合物相对含量
Fig.5 Relative content of representative differential compounds
为了直观对比各轮次基酒差异代谢物的变化趋势,基于差异代谢物的相对含量绘制聚类热图,如图6-a所示,蓝色为低表达组分,橘色为高表达组分。整体分析表明,多数高沸点差异化合物在一、二轮次基酒中相对含量较低,从三轮次开始逐渐积累,其相对含量呈现上升趋势,其中部分化合物相对含量在五轮次达到峰值,而另一部分则随着轮次增加继续累积,在七轮次达到峰值。进一步将差异代谢物匹配KEGG数据库,获得代谢物参与的通路信息,选择P值排名前10的通路进行展示。如图6-b所示,在白酒酿造过程中,差异代谢物主要参与代谢及合成途径。主要包括苯丙氨酸代谢(48.08%),色氨酸代谢(9.39%),花生四烯酸代谢(8.73%),苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸生物合成(48.08%),精氨酸生物合成(13.74%),丁酸代谢(12.82%),泛醌和其他萜类-醌的生物合成(10.68%),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(6.85%),硫辛酸代谢(6.85%)及赖氨酸退化(6.41%)等10个重要途径,值得注意的是,前10条通路中,有6条通路与直接参与氨基酸代谢相关,表明氨基酸代谢网络在酱香型白酒高沸点化合物形成中起枢纽作用。差异代谢物在苯丙氨酸代谢与生物合成通路中的双重富集现象,提示其可能通过“代谢-合成”循环参与风味物质转化[29]。现有研究也表明,氨基酸是美拉德反应及斯特雷克降解等关键风味生成路径的直接前体,能够直接生成吡嗪类、醛类等重要高沸点风味化合物。其次,氨基酸通过转氨作用生成的α-酮酸,如苯丙酮酸、α-酮异己酸等可作为核心碳骨架进入多种代谢途径,进而合成苯乙酸、苯乙酸乙酯、支链有机酸等一大类高沸点化合物。最后,氨基酸代谢整合了碳氮代谢,通过微生物代谢形成各类高沸点组分[30]。
a-高沸点差异化合物热图;b-KEGG通路富集分析
图6 高沸点差异化合物相对含量及KEGG通路富集分析
Fig.6 Relative content of high-boiling-point differential compounds and KEGG pathway enrichment analysis
3 结论与讨论
本研究采用真空蒸馏结合UPLC-Orbitrap-HRMS联用技术,对酱香型白酒一至七轮次基酒中的高沸点组分进行表征。通过构建基于SGMNS并结合CBDB进行数据挖掘,成功鉴定出包括脂质及类脂类、有机酸及其衍生物类、苯系物、有机氧化合物等在内的8大类434种高沸点化合物。PCA显示不同轮次基酒的高沸点化合物具有明显的聚类特征;不同轮次基酒高沸点化合物分布特征显示,在化合物数量方面,一轮次基酒中检出369种化合物,自二轮次起化合物数量显著增加,并在后续轮次数量保持相对稳定;在相对含量方面,一轮次相对含量较低,二轮次开始逐步呈现高沸点化合物的积累,五轮次达到峰值,六、七轮次可能因原料利用率降低从而小幅下降。通过多维统计方法筛选获得281个具有轮次差异的标志性化合物,其中一、二轮次关键差异化合物主要为脂质及类脂分子、有机酸及其衍生物;三轮次苯系物出现特征性升高,四、五轮次吡嗪类化合物开始富集;KEGG通路富集分析发现这些差异化合物于氨基酸代谢通路显著富集,表明微生物驱动的氨基酸转化网络可能是高沸点风味物质形成的关键代谢枢纽。本研究系统解析了酱香型白酒轮次基酒高沸点化合物组成及差异,从物质层面为解释酱香型白酒高温工艺的科学内涵提供参考,为酱香型白酒风味研究及品质提升提供数据支撑。
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