辣椒(Capsicum annuum L.)是茄科植物中重要的蔬菜和经济作物,在全球范围内广泛种植,2000年至2020年期间,全球辣椒产量增加了1 526万t,比增长率为73.11%,其中近一半的增长来自中国[1]。辣椒中含有丰富的生物活性物质,这些成分不仅赋予其独特的营养特性,还具有抗氧化、抗炎及潜在的抗癌等健康促进作用[2]。辣椒因独特的辛辣味道而受到消费者的青睐,辣味主要来自于辣椒素,然而不同辣椒品种之间的辣椒素含量差异很大,这可能会影响其潜在的健康益处。SARPRAS等[3]表明,136个基因型辣椒的辣椒素含量存在显著差异,辣椒素含量主要受其基因型的影响[4]。辣椒除鲜食之外,还具有极高的加工价值,可制成干辣椒、辣椒粉、辣椒酱、辣椒油等,在化妆品、药品和食品添加剂中也扮演重要的作用[5]。随着生产和消费水平的提高,辣椒果实品质受到越来越多的关注,辣椒育种也从以抗病高产为主要目标转入以改善品质为主要目标。
辣椒在我国拥有丰富的种质资源,具有不同的形状、颜色以及大小,它们的营养成分可能因基因型、果实颜色、发育阶段、生长地区而不同[6]。不同的辣椒品种在营养成分和代谢物水平上存在差异[7]。WAHYUNI等[8]发现,32份辣椒种质的植物营养素组成存在很大差异。辣椒的驯化过程根据期望性状改变了果实的形状、大小、辛辣味和颜色,但这种人工选择也导致了辣椒营养素和代谢物的改变[9]。辣椒果实的香气由多种挥发性有机化合物组成,是影响消费者感官接受度、评判果实新鲜度的核心参数。研究显示,挥发性风味化合物可用于评价农产品品质,花椒[10]、干辣椒[11]、大米[12]等均利用了挥发性风味物质构建品质评价模型。同时,LI等[13]利用挥发性风味来区分松茸的不同部位和生产区域,WANG等[14]利用挥发性风味来区分板栗的生产区域,证明了挥发性风味化合物还可以区分农产品的产地。尽管如此,对辣椒的风味品质和品种鉴定的研究仍然有限。目前,ZHANG等[15]在皱皮椒和光滑椒中共鉴定出199种化合物,这些风味化合物能将2个品种有效的区分,但辣椒果实类型众多,通过分析外观、营养品质和挥发性风味化合物对辣椒进行分类,尚未进行深入研究。因此,本研究旨在研究各种类型辣椒营养成分和风味特征,进行顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)联用技术结合多变量统计分析,系统表征和区分不同类型辣椒的挥发性风味化合物。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料由江西省农业科学院蔬菜花卉所、江西大家族种业有限公司和江西华农种业有限公司提供,测定辣椒横径、纵径、单果质量以及颜色后,将辣椒去蒂通过匀浆机破碎,在-20 ℃下贮存以备后续实验。样品进行3次重复,以确保结果的一致性和可靠性,辣椒材料基本信息见表1。
C2H5OH、福林酚、CH3OH、Na2CO3、四氢呋喃、Na2SO4、HPO3、Na3PO4、H3PO4、KH2PO4、L-半胱氨酸、乙酸乙酯、蒽酮(均为国产分析纯),西陇科学股份有限公司;标准品维生素C、辣椒素、二氢辣椒素,德国Sigma公司。
表1 供试辣椒材料基本信息
Table 1 Basic information of tested pepper materials
序号辣椒名称品种类型材料编号序号辣椒名称品种类型材料编号1大螺丝37-94螺丝椒LS113余干辣椒羊角椒YJ132旋螺2020螺丝椒LS21423E184牛角椒NJ143精质海螺螺丝椒LS315无名2号牛角椒NJ154大家族旋风螺丝椒LS416大家族910牛角椒NJ165大家族紫陇螺丝椒LS517精质019泡椒PJ176赣椒34线椒XJ618赣椒338泡椒PJ187大家族93号线椒XJ719大家族酷优泡椒PJ198赣椒188线椒XJ820青泡椒37-137泡椒PJ209龙线12线椒XJ921安源红辣1号朝天椒CTJ211023E228羊角椒YJ1022安源红辣2号朝天椒CTJ2211高安椒1号羊角椒YJ1123玉龙朝天椒朝天椒CTJ2312赣椒219羊角椒YJ12
1.2 仪器与设备
MNT300E游标卡尺,德国美耐特公司;ZG-TB203电子天平,浙江松竫公司;SCQ-1A颜色测定仪,北京天翔飞域科技有限公司;GCMS-TQ8040三重四极杆气质联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),日本岛津公司。
1.3 测定项目和方法
1.3.1 外观测定
使用游标卡尺测量辣椒的纵径和橫径,使用电子天平测定辣椒单果质量,使用颜色测定仪测量辣椒色差指数L*(亮度)值、a*(红绿)值和b*(黄蓝)值。
1.3.2 营养成分的测定
维生素C含量的测定参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》中的高效液相色谱法,辣椒素(辣椒素和二氢辣椒素之和)含量的测定参照GB/T 21266—2017《辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法》,可溶性糖含量的测定参照蒽酮比色法,总多酚含量的测定参照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定 分光光度法》。
1.3.3 辣椒挥发性风味化合物的测定
准确称取1.00 g样品于20 mL顶空瓶中,并添加100 μL内标2-辛醇(10 mg/L),在60 ℃条件下平衡20 min,使用DVB/CAR/PDMS 120 μm SPME纤维头插入顶空瓶中60 ℃萃取30 min。萃取结束后在进样口解析2 min,下一针前SPME纤维头在270 ℃老化5 min,以防止样品间相互污染。使用三重四极杆气质联用仪进行分析。
气相色谱条件:用He作载气,流速1.0 mL/min。分流比50∶1进样,升温程序:色谱柱起始柱温50 ℃,保持5 min,以10 ℃/min升到250 ℃,保持10 min。
质谱条件:采集方式为Scan数据采集,采集质量范围m/z 35～400;电离方式为电子轰击;发射能量70 eV;检测电压+0.6 kV,离子源温度200 ℃;进样口温度250 ℃。
定性与定量:挥发性风味化合物的鉴定基于正构烷烃计算保留指数,正构烷烃(C9～C30)混合标样按辣椒风味化合物加热程序进行液体进样分析,2-辛醇标准样品作为内标物,使用NIST数据库对样本的挥发性风味进行了质谱定性定量分析,只考虑质谱匹配度>75%的化合物,挥发性风味化合物含量的计算如公式(1)所示:
(1)
式中:Ci,挥发性化合物i的含量,ng/g;C0,内标物的质量浓度,mg/L;V0,内标物体积,mL;Si,挥发性化合物i的峰面积;S0,内标物峰面积;m,样品质量,g。
1.4 数据处理
利用Excel 2019软件对数据进行整理,通过SPSS 22软件进行单因素方差分析和主成分分析(principal component analysis, PCA),所有指标测量均重复3次,结果以“平均值±标准差”表示,GraphPad Prism10软件进行数据分析和图表绘制,采用SIMCA 14.1软件对挥发性风味化合物进行PCA和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)。
2 结果与分析
2.1 辣椒外观形态分析
通过观察23份辣椒的大小和形状(图1)发现,螺丝椒和线椒果型长,牛角椒和泡椒果型宽,朝天椒果型小。
图1 二十三份辣椒大小和形状
Fig.1 Size and shape of 23 peppers
如图2-a～图2-c所示,辣椒的纵径范围为42.18～316.28 mm,变异系数40.58%,横径范围为9.70～53.49 mm,变异系数48.47%,大多数品种呈长条形。辣椒单果质量在1.63～77.92 g,变异系数64.43%。从形态特征来分析,牛角椒和泡椒类型的辣椒果型更宽、果实更重。颜色是消费者评价食品质量评价的关键因素。如图2-d所示,表示亮度的L*值的范围为32.38～73.03,表示红绿成分的a*值范围为-8.88～-3.65,而反映黄蓝成分的b*值范围为-2.84～34.70。在所有品种中,玉龙朝天椒的L*值最高,表明亮度最大,而大家族紫陇的L*值最低。a*值表示红绿色,负值越小表示更接近绿色,精质海螺的a*值最高,23E184的a*值最低。b*值表示黄蓝色,正值越大表示更接近黄色。23E184的b*值最高,大家族紫陇的b*值最低。
2.2 辣椒基本营养成分的分析
23份辣椒的维生素C、辣椒素、可溶性糖、总多酚含量见图3。23份辣椒的4个营养品质指标变异系数为22.21%～193.92%,变异系数最大的指标是辣椒素含量,其他指标的变异系数都在44%以下,可见辣椒素含量在品种间差异较大,改良潜力大。维生素C变化范围为43.72～122.81 mg/100 g,最高为玉龙朝天椒,最低为大家族910(图3-a)。辣椒素含量范围为0～1 126.30 mg/kg,安源红辣1号含量最高,大家族910、精质019和大家族酷优未检测出辣椒素(图3-b)。可溶性糖变化范围为1.03%～2.35%,大螺丝37-94含量最高,旋螺2020含量最低(图3-c)。总多酚变化范围为451～2 169.41 mg/kg,安源红辣1号含量最高,旋螺2020含量最低(图3-d)。
2.3 辣椒综合品质分析
2.3.1 辣椒品质相关性分析
对10项辣椒品质指标进行Pearson相关分析,如图4所示。维生素C、辣椒素、总多酚互相呈极显著正相关(P<0.001),可作为评价辣椒的主要指标。
a-纵径;b-橫径;c-单果质量;d-颜色
图2 二十三份辣椒的外观数据
Fig.2 Appearance data of 23 peppers
a-维生素含量;b-辣椒素含量;c-总多酚含量;d-可溶性糖含量
图3 二十三份辣椒的营养品质
Fig.3 Nutritional quality data of 23 peppers
橫径、单果质量、纵径分别与维生素C、辣椒素、总多酚呈极其显著负相关(P<0.001),表明辣椒营养品质与果型之间存在密切相关性。可溶性糖与辣椒素、总多酚呈极其显著负相关(P<0.001),与L*值呈极显著负相关(P<0.01),与单果质量呈极其显著正相关(P<0.001),与橫径、纵径呈极显著正相关(P<0.01)。采用层次聚类分析对10项辣椒品质指标生成树状图,10项品质指标被聚成2大类,其中维生素C、辣椒素、总多酚、L*值和b*值聚为第一大类,其余指标聚为第二大类。在每个大类中又可分为几个亚类。其中维生素C、辣椒素和总多酚为一个亚类,L*值和b*值为一个亚类,橫径和单果质量为一个亚类,纵径和可溶性糖为一个亚类,a*值单独为一个亚类,这与相关性分析结果一致,呈显著相关的品质指标均聚为一类。
图4 二十三份辣椒品质相关性分析
Fig.4 Correlation analysis of qualities of 23 peppers
注:*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001。
2.3.2 辣椒品质PCA
如表2所示,基于特征值>1的标准挑选出3个主成分,累计贡献率达到74.432%,主成分1占总方差的45.951%,主成分2占17.228%,主成分3占11.252%。为了确定每个指标的重要性,通过计算主成分的加载系数与相应特征值的平方根的比值来构建主成分分数,表达式如下:
F1=-0.136X1-0.157X2-0.177X3+0.143X4-0.005X5+0.066X6+0.169X7+0.188X8-0.122X9+0.199X10
F2=0.042X1+0.179X2+0.214X3+0.398X4-0.222X5+0.525X6-0.078X7+0.055X8-0.003X9-0.093X10
F3=-0.415X1+0.463X2+0.269X3+0.089X4+0.599X5-0.055X6+0.028X7+0.228X8+0.037X9+0.073X10
表2 各主成分的特征根和累计方差贡献率
Table 2 Characteristic values and cumulative contribution rates of three principal components
指标主成分1主成分2主成分3纵径(X1)-0.6240.073-0.467橫径(X2)-0.7200.3080.521单果质量(X3)-0.8120.3680.303L∗值(X4)0.6570.6860.100a∗值(X5)-0.024-0.3830.674b∗值(X6)0.3020.904-0.062维生素C(X7)0.775-0.1340.031辣椒素(X8)0.8660.0950.257可溶性糖(X9)-0.562-0.0050.041总多酚(X10)0.916-0.1600.082特征值4.5951.7231.125贡献率/%45.95117.22811.252累积贡献率/%45.95163.18074.432
考虑到各主成分可能有不同的方差贡献,综合评价模型以各主成分的方差贡献与累积方差贡献的比值作为权重,综合评价模型表达式为Q=0.617F1+0.231F2+0.151F3。根据已建立的评价标准如表3所示,排名前三的辣椒分别是安源红辣1号、玉龙朝天椒和安源红辣2号,均为朝天椒类型,适用于加工,表现为辣椒素含量高,三者中安源红辣1号品质最佳。其余20种为鲜食型辣椒,排名前五的鲜食型辣椒分别为23E184、高安椒1号、余干辣椒、旋螺2020、赣椒34,表现为维生素C较高、辣椒素含量适中。从辣椒类型上可以看出螺丝椒类型中旋螺2020品质最优,线椒类型中赣椒34品质最优,羊角椒类型中高安椒1号品质最优,牛角椒类型中23E184品质最优,泡椒类型中青泡椒37-137品质最优。
表3 辣椒综合品质排名
Table 3 Comprehensive quality ranking of pepper
材料编号排名样品排名样品排名LS121XJ919PJ1715LS27YJ1022PJ1813LS320YJ115PJ1910LS417YJ1218PJ209LS523YJ136CTJ211XJ68NJ144CTJ223XJ716NJ1512CTJ232XJ811NJ1614
2.4 辣椒挥发性风味化合物分析
2.4.1 挥发性风味化合物的组成和含量
a-挥发性风味化合物数量;b-挥发性风味化合物含量
图5 二十三份辣椒挥发性风味化合物数量和含量
Fig.5 Number and content of volatile flavor compounds in 23 peppers
如图5-a所示,23份辣椒所鉴定的挥发性化合物共有183种,包括44种醇类、37种醛类、36种酯类、23种酮类、15种酸类、13种萜类和15种其他化合物,羊角椒和朝天椒类型的辣椒挥发性风味化合物种类较多,其中大家族紫陇检测出来的种类较多,共检测出83种,其次是高安椒1号,共检测出80种。如图5-b所示,不同的辣椒品种表现出不同的挥发性成分含量。其中,大家族紫陇的醇类含量占比最高(47.72%),旋螺2020的醛类含量占比最高(57.73%),玉龙朝天椒酯类含量占比最高(25.87%),大家族旋风酮类含量占比最高(19.46%),23E184酸类含量占比最高(37.74%),余干辣椒萜类含量占比最高(17.20%),这些挥发性成分的差异导致不同类型辣椒呈现出不同的香气。
为了突出不同辣椒样本中挥发性风味化合物含量的差异,对23份辣椒样本建立了相应的风味特征指纹,并用热图表示。如图6所示,图中的每一列代表一个辣椒样本,每一行则代表同一挥发性风味化合物含量,颜色越红含量越高,颜色越蓝含量越低。其中β-紫罗兰酮、水杨酸甲酯、芳樟醇在23份辣椒中均有分布,线椒和朝天椒中挥发性风味物质含量积累较多,羊角椒和牛角椒次之,螺丝椒和泡椒最少,表明线椒和朝天椒属于高香型辣椒,羊角椒和牛角椒属于中香型辣椒,螺丝椒和泡椒属于低香型辣椒。
图6 二十三份辣椒挥发性风味化合物热图
Fig.6 Heatmap of volatile flavor compounds in 23 peppers
2.4.2 挥发性风味化合物主成分分析
以183种风味化合物成分为因变量,不同品种为自变量建立PCA模型,如图7-a所示,朝天椒样品主要位于第四象限,线椒样品主要位于第三象限,螺丝椒样品主要位于第二象限,说明不同类型的辣椒风味有显著差异。但PCA不能有效地区分群体差异,如图7-b所示,OPLS-DA却能够有效区分来自6个类型的23份辣椒样品,自变量拟合指数和因变量拟合指数分别为:R2x=0.944;R2y=0.952,模型预测指数为:Q2=0.904,表明模型拟合结果是有效的。在进行200次置换试验后,如图7-c所示,位于最右侧的R2、Q2值均高于左侧,且Q2回归线与纵轴相交的点小于零,说明模型没有过拟合,适用于辣椒风味化合物的差异分析。OPLS-DA将辣椒区分为4类,朝天椒为第一类,线椒为第二类,螺丝椒与泡椒风味化合物接近为第三类,羊角椒与牛角椒风味化合物接近为第四类。利用变量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)筛选差异风味化合物,VIP值越大,该变量对于模型的影响越大。以VIP值>1.0为筛选条件,共得到45种差异风味物质,进一步提高筛选阈值,以VIP值>1.8为标准对不同物种样品中的挥发性风味化合物进行筛选,最终鉴定出17种差异挥发性风味化合物(图7-d),为精准区分不同物种样品间的风味差异提供了重要理论依据。包括7个醛类、5个酸类、4个醇类和1个萜类,分别为辛醛、5-甲基己酸、石竹烯、己醛、乙醛、辛酸、月桂酸、十六醇、十五醛、香兰素、反式-2-己烯醛、十一酸、反式-2-己烯酸、十一烷醇、1-辛醇、反式-2-十一烯醛、顺式-2-己烯-1-醇。
a-PCA;b-OPLS-DA;c-模型拟合验证;d-VIP得分
图7 二十三份辣椒挥发性风味化合物主成分分析
Fig.7 Principal component analysis of volatile flavor compounds in 23 peppers
3 讨论
3.1 辣椒果实外观形态和营养品质的差异
在辣椒品种的选育过程中,首先关注的特征包括果实大小、形状、颜色和与生产相关的性状。然而,营养和风味经常被忽视。本研究所评价的23份辣椒果实不仅在外部形状上存在显著差异,而且在营养品质上也存在显著差异。KIM等[16]认为辣椒大小是营养价值的关键的决定因素,辣椒素类物质与果实重量和长度呈显著负相关,任朝辉等[17]研究表明辣椒单果鲜质量与辣椒素含量呈极显著负相关,与本研究结果一致,辣椒素与纵径、橫径和单果质量呈极显著负相关(P<0.001),朝天椒果型最小,辣椒素含量最高,反之,泡椒果型偏大,辣椒素含量最低。辣椒中含有丰富的生物活性物质,尤其是维生素C含量高,有研究表明维生素C的含量取决于水果的成熟度和辛辣味,高辛辣度的成熟辣椒果实通常维生素C含量较高[2],与本研究结果一致,维生素C与辣椒素呈极其显著正相关(P<0.001),朝天椒辣椒素含量高,其维生素C含量也高。通过外观和营养成分分析表明,影响辣椒质量的关键指标是单果质量、维生素C和辣椒素含量。颜色是消费者购买蔬菜时的重要标准,它是根据其在绿色成熟阶段的叶绿素含量来确定的[15]。L*值与b*值呈极其显著正相关(P<0.001),表明辣椒果实颜色越黄,亮度越高,23E184、安源红辣1号和玉龙朝天椒的a*值高,果皮颜色偏黄,L*值更大。L*值还与辣椒素、维生素C、总多酚呈显著正相关,表明果实亮度可作为消费者选购高品质辣椒时的一项参考指标。
3.2 辣椒综合品质分析
在针对多样品多指标所开展的综合评价分析工作中,PCA与聚类分析方法已被广泛用于水果[18]、蔬菜[19]中。PCA的核心在于借助降维技术,实现精准反映样品基本特征信息的目标。潘静等[20]利用主成分综合评价苹果杂交后代的性状,得出以短成熟期亲本‘金冠’为母本,易获得早熟F1代;王兴波等[21]对9种干辣椒进行综合评价,得出朝天椒是制粉和火锅底料等的优质原料,角椒适宜作制酱原料;王楠艺等[22]基于PCA对不同气候生产区的辣椒进行综合评价,贵州省麻江县的气象条件有利于提升辣椒的品质。本研究将辣椒品质指标综合为3个主成分,其累计贡献率达74.432%,较全面地代表了原始信息。其中第1主成分贡献率为45.951%,其对应的特征向量中绝对值较大的为橫径、纵径、单果质量、维生素C、辣椒素、总多酚和可溶性糖等指标,第2主成分贡献率为17.28%,其对应特征向量为L*值和b*值,第3主成分贡献率为11.252%,其对应特征向量为a*值。建立辣椒综合评价模型为Q=0.617F1+0.231F2+0.151F3。根据已建立的评价标准,安源红辣1号、玉龙朝天椒和安源红辣2号,表现为维生素C、辣椒素和总多酚高,适用于加工型。23E184、高安椒1号、余干辣椒、旋螺2020、赣椒34,表现为维生素C较高、辣椒素含量适中,适用于鲜食型。
3.3 辣椒果实挥发性风味化合物的差异
无论鲜食、加工还是作为其他食品的成分,辣椒的香气在决定其质量方面起着至关重要的作用,辣椒品种之间的遗传多样性会导致挥发性风味化合物的类型和浓度发生变化,这直接影响新鲜辣椒及其衍生产品的香气特征,从而影响消费者的偏好[23-24]。HS-SPME是目前常用且有效的挥发物提取技术,GC-MS用于分离复杂的挥发物,并有效表征和定量这些组分[25]。CUEVAS-GLORY等[26]优化了HS-SPME-GC-MS方法,用于辣椒中挥发性风味化合物的检测和定量,并检测到53种化合物。在本研究中,检测到183种挥发性风味化合物,表明辣椒果实中挥发性化合物的多样性。ZHANG等[15]的研究中,醇类、醛类和萜类是辣椒最常检测到的3种挥发性类别,但醇类、醛类和酯类是最丰富的,与本研究结果一致,不同类型辣椒中,醇类和醛类含量占比较高。其中,大家族紫陇的醇类含量最高,旋螺2020的醛类含量最高,玉龙朝天椒酯类含量最高,余干辣椒萜类含量最高,这些挥发性成分的差异是导致不同类型辣椒呈现出不同的香气。例如醛类香气描述主要为绿叶、黄瓜或草本气味,尤其是C6和C9醛是绿色香气的主要来源,并参与脂肪酸代谢[27]。反式-2-己烯醛和己醛是辣椒呈现绿色气味的关键芳香族化合物[28]。PCA是一种常用于分析挥发性化合物的无监督分析工具。采用SIMCA 14.1软件建立辣椒挥发性风味化合物的PCA模型不能有效区分群体差异,OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法,它可以有效地滤除与分类信息无关的噪音,从而对样本的分组进行预测[14]。OPLS-DA将辣椒区分为4类,朝天椒为第一类,线椒为第二类,螺丝椒与泡椒风味化合物接近为第三类,羊角椒与牛角椒风味化合物接近为第四类。每种挥发性风味化合物对分类的贡献是根据VIP计算得出的[29],本研究以VIP>1.8为筛选条件,共鉴定出的17种差异挥发性风味化合物,包括了包括7个醛类、5个酸类、4个醇类和1个萜类,其中就含有关键绿色气味化合物反式-2-己烯醛和己醛,表明醛类化合物是实现不同类型辣椒区分的关键潜在特征物质。
4 结论
本研究对23份辣椒的形态特征、营养成分和挥发性风味化合物进行了评价。通过PCA和层次聚类分析,对23份辣椒综合品质进行了评价,前三为安源红辣1号、玉龙朝天椒和安源红辣2号,表现为维生素C、辣椒素和总多酚高,适用于加工型。排名第4名至第8名的辣椒为23E184、高安椒1号、余干辣椒、旋螺2020、赣椒34,表现为维生素C较高、辣椒素含量适中,适用于鲜食型。利用HS-SPME-GC-MS共鉴定出183种挥发性风味化合物,其中以醇类、醛类、酯类为主要成分。多变量数据分析使关键挥发性化合物的鉴定和确定辣椒的类型成为可能,可为选择适合的加工和栽培品种提供参考。
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