食源性疾病是指通过摄入被致病因子污染的食品而引起的一类感染性或中毒性疾病[1]。食源性致病菌是此类疾病的主要致病因素。常见病原细菌包括肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等;此外,部分真菌类如青霉属(Penicillium)、麦角菌属(Claviceps)、曲霉属(Aspergillus)及镰孢属(Fusarium)也可污染食品,其可通过入侵感染或产生毒素危害人体健康,引起腹泻、呕吐、发热等症状,严重时甚至危及生命[2]。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)统计[3],全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而患病,导致约42万人死亡,其中5岁以下儿童约占30%,对经济发展和社会稳定产生负面影响。因此,发展快速、准确的检测方法及高效的治疗策略对控制食源性疾病的传播具有重大意义。
在应对致病菌引起的食源性疾病时,“预防优于治疗”已成为国际共识。实现有效预防的关键在于对致病菌进行早期、准确检测。目前常用的检测方法包括细菌培养法、PCR技术、分子探针法等,然而这些方法大多操作繁琐、耗时长且依赖大型仪器,难以满足现场快速检测的需求[4]。在治疗领域,广泛使用的抗生素疗法(口服或静脉注射)虽具有一定效果,但随着耐药性的不断增加,其治疗效果日益受限[5],催生了对新型诊疗策略的研发需求。
近年来,抗体药物因其高特异性和亲和力,在病原菌识别与中和方面展现出显著优势,已成为抗感染领域的研究热点。与传统培养方法相比,免疫分析方法具有操作简便、成本低、易于现场推广等优势,已成为食源性致病菌快速检测的重要发展方向[6]。然而,传统抗体(单克隆抗体、多克隆抗体)存在分子尺寸偏大、组织穿透性差、稳定性不佳、制备工艺复杂、价格昂贵、批次间差异明显等问题,严重限制了其在检测和治疗领域的广泛应用[7]。
纳米抗体(nanobody, Nb)是来源于驼科或软骨鱼动物的重链抗体可变区(variable heavy domain of heavy chain, VHH)的新型重组抗体,具有分子质量小、稳定性强、免疫原性低、易于基因工程改造和大规模表达等优势[8],被广泛认为是传统抗体的理想替代品。自纳米抗体被发现以来,其在生物医学、生物分析等领域展现出巨大应用潜力。本文综述了纳米抗体的分子特性,并重点讨论其在食源性致病菌检测与中和治疗中的研究进展,以期为开发高效、精准、便捷的食源性致病菌防控策略提供借鉴和参考。
1 纳米抗体的结构特性
1.1 分子质量小、免疫原性弱
纳米抗体由VHH组成,分子质量(12～15 kDa)仅为传统抗体的十分之一(图1)。该特性使其在人体内更容易被代谢和清除[9],且其VHH序列和人类VH3家族具有高度同源性(75%～90%),免疫原性低,在动物及临床研究中均未观察到显著的免疫反应[10-11]。此外,纳米抗体不含传统抗体的Fc片段,从而有效避免补体反应异常激活,减少检测中的假阳性现象[12]。
图1 传统抗体与纳米抗体结构示意图
Fig.1 Schematic diagram of conventional antibody and nanobody
1.2 溶解性好、组织渗透性强
纳米抗体的FR2区中4个疏水性氨基酸被亲水残基取代(V37F、G44E、L45R、W47G),使其具备优异的溶解性和低聚合性,增强了其在组织中的渗透能力[13]。这一特性在食源性致病菌的快速检测和靶向治疗中尤为关键。例如,在复杂食品基质或生物膜环境中,纳米抗体可高效渗透并富集于靶标菌体表面,从而提升检测灵敏度与药物递送效率[14]。
1.3 稳定性高、抗原结合能力强
纳米抗体的FR区氨基酸序列较为保守,构成一个稳定的结构框架,有助于维持其正确的折叠和构象。FR1与FR3区之间存在保守的二硫键,部分纳米抗体还存在额外的二硫键,增强了纳米抗体的稳定性。此外,由于缺乏轻链,纳米抗体避免了由轻链与重链解离所引起的结构不稳定性[15]。研究表明,纳米抗体的解链温度(melting temperature, Tm)通常在50～80 ℃,部分纳米抗体,如抗葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B, SEB)的NbA3的解链温度可达85 ℃[16-17]。纳米抗体对有机溶剂、极端pH值等恶劣环境均具有良好的耐受性。例如,在黄曲霉毒素(aflatoxin, AF)检测中,纳米抗体在体积分数80%的甲醇溶液中仍能保持完整的活性,而单克隆抗体仅保留50%的活性[18]。此外,针对李斯特菌的纳米抗体在pH值为2和12的极端条件下孵育过夜后,仍能保留至少30%的活性。这种出色的稳定性使其能够适应各种复杂的检测环境,并在口服药物治疗中延长体内作用时间[19]。另外,纳米抗体具有更长的CDR3区(通常含16～18个氨基酸),可形成凸环结构,使其能够深入传统抗体难以触及的抗原缝隙(如离子通道或病毒糖蛋白的保守表位)、酶活性中心及隐蔽表位,实现对半抗原、酶活性位点的结合[20]。例如,在针对跨膜糖蛋白Trop2的研究中,纳米抗体N14和N152利用其长CDR3环,成功靶向了Trop2分子二聚化界面,从而破坏了其功能性的二聚体形成,展现出广泛的抗原结合能力,并有助于发现传统抗体无法识别的药物新靶点[21]。
1.4 易生产、成本低、易于改造
纳米抗体可在原核(如大肠杆菌)、真核(如酵母)和哺乳动物细胞等多种表达系统中实现高效表达[22]。因其结构简单,无需复杂的翻译、修饰,显著降低了生产成本。而传统抗体由于翻译后需要修饰,往往依赖哺乳动物细胞培养系统,制备过程复杂且成本高昂。例如,Nb 11-59通过毕赤酵母表达发酵210 h后产量可达20 g/L[23]。此外,纳米抗体可通过基因工程进行改造,例如人源化改造以降低免疫原性,或与荧光蛋白、酶标签进行偶联,或构建多价及多功能复合物[24]。从而显著拓展其在食源性致病菌多重检测、毒素中和抗菌治疗中的应用潜力。
2 纳米抗体在食源性致病菌诊断检测中的应用
加强食源性致病菌的预防往往比治疗更具有成本效益与可控性。纳米抗体凭借分子质量小、特异性强等优势,可作为新型免疫探针,在食源性致病菌的高灵敏度免疫测定中展现出极大的应用潜力,并通过与多种检测方式结合,为食源性致病菌的现场筛查提供更加高效、灵敏的解决方案(图2)。
图2 纳米抗体在食源性致病菌治疗和检测中的应用
Fig.2 Applications of nanobodies in the detection and therapy of foodborne pathogens
2.1 酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种基于抗原-抗体特异性结合的高灵敏度免疫检测技术。常见类型包括直接ELISA、间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)、夹心ELISA(sandwich ELISA, sELISA)、竞争ELISA(competitive ELISA,cELISA)等。在产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)感染的早期诊断中,志贺毒素(shiga toxin, Stx)的检测至关重要。MELLI等[25]开发了一种基于双纳米抗体(1vb1、2vb10)及生物素-链霉亲和素的ELISA方法,检出限(limit of detection, LOD)为4～8 ng/mL。该方法在产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin producing Escherichia coli,STEC)培养物上清和粪便样本中表现出优异的灵敏度和临床相关性,灵敏度较商业ELISA试剂盒提高4倍,且与PCR和商业化免疫分析法检测结果高度一致,显示出良好的诊断潜力。HE等[26]筛选出识别大肠杆菌O157:H7的特异性纳米抗体,并利用VHH O3建立了与多克隆抗体配对的夹心ELISA方法,LOD为8.7×103 CFU/mL,适用于实际样品的检测。WANG等[27]提出了一种基于双特异性纳米抗体支架的新型“一对二”定向固定平台的ELISA方法,可分别用于沙门氏菌和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检测。其LOD较单价纳米抗体夹心ELISA提高了13倍以上,并显著提升了固定化效率。此外,TU等[19]从未免疫羊驼噬菌体抗体文库中筛选出两个抗单核增生李斯特菌特异性纳米抗体,并利用其中一株纳米抗体L5-79与单克隆抗体配对,建立了用于检测巴氏杀菌乳中单核增生李斯特菌的夹心ELISA方法,其LOD为1×104 CFU/mL。该结果表明,通过合理设计淘选策略,可从天然库获得高亲和力和高特异性纳米抗体。
2.2 化学发光免疫分析
化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是一种将高灵敏的化学发光反应与高特异性的免疫反应相结合的超微量检测技术。ZHANG等[28-29]开发了一种基于噬菌体介导的夹心酶联免疫分析方法。该方法以Cs-Nb2作为捕获抗体,phage Cs-Nb1作为检测抗体,LOD为1.04×104 CFU/mL,灵敏度较传统显色方法增长10倍,且纳米抗体用量减少了200倍,为食源性病原体的免疫测定提供了一种策略。此外,在另一项研究中,该团队以Nb9为捕获抗体,phage-Nb1为检测抗体,建立了用于检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)的噬菌体介导的双纳米抗体夹心ELISA方法(phage-mediated double-nanobody sandwich ELISA, P-ELISA),并进一步构建了噬菌体介导的双纳米抗体夹心化学发光酶免疫分析方法(phage-mediated double-nanobody sandwich chemiluminescent enzyme immmunoassay, P-CLISA)。其中,P-ELISA的LOD为5.08×104 CFU/mL,灵敏度较基于双纳米抗体的ELISA方法提高了100倍。而P-CLISA的LOD为3.63×103 CFU/mL,线性范围在5.1×103～1.2×106 CFU/mL,灵敏度较传统显色法提高了14倍。LIAO等[30]则通过将纳米抗体与铁蛋白融合,构建了针对沙门氏菌的特异性铁蛋白-纳米抗体融合蛋白(ferritin-nanobody fusion construct, Fb),并以Fb为捕获抗体,Nb 422为检测抗体,建立了FbNb-CLISA方法。该方法的灵敏度较传统显色方法增长了12倍,为纳米抗体在食品安全检测领域中的应用提供了新思路。
2.3 免疫层析试纸条
免疫试纸条(lateral flow immunoassay,LFIA)是一种利用抗原与抗体特异性结合原理,以胶体金等材料作为标记物进行快速检测的免疫层析技术。WANG等[31]利用链霉亲和素(streptavidin, SA)功能化修饰的金纳米颗粒(au nanoparticles, AuNP)可与生物素化抗体特异性结合的原理,构建了AuNP-Nb探针,建立了一种超灵敏比色免疫层析法(Au/SA@Bio-Nb-LFIA),用于检测食品中鼠伤寒沙门氏菌。该方法视觉检测的LOD为103 CFU/mL,线性检测范围为103～107 CFU/mL。ZHANG等[32]开发了一种基于K0.27MnO2·0.54H2O(KMO)@Au纳米复合材料与纳米抗体协同作用的比色-光热双模式免疫层析试纸条。该研究通过在三维KMO表面修饰AuNP,提高了光热传感探针KMO@Au的光热转换效率,并利用小尺寸的纳米抗体Nb9与KMO@Au偶联,进一步提升了检测灵敏度和特异性,实现了104 CFU/mL(比色模式)和103 CFU/mL(光热模式)的鼠伤寒沙门氏菌检测。HU等[33]设计了一种双信号放大LFIA,通过将纳米抗体与传统抗体对配对,并采用Fe3O4@SiO2@TQD纳米材料作为兼具富集与检测双的双功能标签,可在13 min内快速、灵敏检测肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、单核增生李斯特菌和空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)。该法的LOD分别为38、125、47 CFU/mL,与直接LFIA检测相比,富集模式的灵敏度增长了5～6倍,具有优异的选择性、可靠性和准确性,为纳米抗体在快速检测领域的研究提供参考。
2.4 免疫传感器
免疫传感器是一种利用抗原-抗体特异性结合的生物传感器,广泛应用于医疗诊断、环境监测、食品安全等领域。WANG等[34]建立了一种基于噬菌体展示纳米抗体(phage display nanobodies,Phage-Nb)的一步无标记比色免疫传感器,用于快速检测副溶血性弧菌。该方法利用展示于pVIII外壳蛋白上的硫醇化纳米抗体诱导AuNPs聚集,而纳米抗体与细菌特异性结合可抑制该聚集行为,进而引起表面等离子体共振变化及溶液颜色改变。该传感器可在100 min内完成副溶血性弧菌的检测,视觉检测的LOD为104 CFU /mL,定量检测的LOD为103 CFU/mL,展现出纳米抗体在细菌现场快速检测中的巨大潜力。SU等[35]通过纳米抗体与绿色荧光蛋白(synthetic green fluorescent protein, SGFP)融合,构建了SGFP-Nb融合蛋白作为赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)的荧光示踪剂,以SGFP-Nb作为供体,以OTA偶联的量子点为受体,基于荧光共振能量转移原理开发了基于荧光纳米抗体的纳米传感器。在优化条件下,传感器的LOD为5 pg/mL,线性检测范围为5～5 000 pg/mL,与LC-MS/MS检测结果高度一致,具有良好的准确性和可重复性。PAN等[36]研制了一种基于纳米抗体的高灵敏电化学免疫传感器,用于检测黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1),LOD可达3.3 pg/mL。与基于单克隆抗体的免疫传感器相比,该传感器的线性范围拓展了两个数量级,灵敏度提高了10倍。同时,较HPLC和ICA检测时间显著缩短,在AFB1的快速检测方面具有显著的应用前景。
2.5 其他
免疫聚合酶链反应(immuno-PCR, IPCR)是一种将免疫分析的高特异性与PCR的高灵敏度相结合的超微量检测技术,具有更高的灵敏度及更宽的线性范围。LEI等[37]基于抗AF的特异性纳米抗体及编码DNA的M13噬菌体,开发了一种实时IPCR检测方法用于农产品中AF的准确定量检测。该方法的LOD可达0.02 ng/mL,与PCR相比,IPCR结合了ELISA的多功能性,可直接用于AF的检测,且灵敏度较噬菌体ELISA提高4倍,为AF污染监测提供了一种新策略。
免疫亲和高效液相色谱-串联质谱法(immunoaffinity-HPLCMS/MS)通过将特异性抗体固定于亲和吸附剂上,利用抗原-抗体反应实现复杂样品中目标物的高效富集与纯化。李志强等[38]成功表达了抗AFB1纳米抗体,并制备了相应的免疫亲和柱,应用于玉米中的AFB1的HPLC-MS/MS检测。该方法在0.1～100.0 μg/L范围内线性良好,LOD为0.014 μg/L,定量限(limit of quantification, LOQ)为0.047 μg/L。在使用150次后回收率仍在80%以上,而传统单克隆色谱柱在使用10次后回收率降至50%以下,性能优异。解决了市面上商品化免疫亲和柱再生性差的问题。
纳米抗体在食源性致病菌检测中的应用主要包括上述几种,详见表1。
3 纳米抗体在食源性致病菌中和治疗中的应用
随着抗生素耐药性问题日益严峻,食源性致病菌对人类健康的威胁不断加剧。纳米抗体凭借自身的优势,在抗感染治疗中展现出显著优势,成为替代传统抗生素的潜在策略。纳米抗体主要通过两种途径发挥抗菌作用,如图3所示,一是通过特异性结合细菌毒素的特殊位点,阻止毒素与宿主细胞受体结合、抑制毒素内化或破坏毒素的酶活性,从而中和毒素;二是通过黏附于菌体鞭毛或菌毛,抑制致病菌运动、定植与增殖,从而预防和治疗感染[39]。
表1 纳米抗体在食源性致病菌诊断检测中的应用
Table 1 Application of nanobodies in the diagnostic detection of foodborne pathogens
检测方法检测目标抗体类型(名称)LOD线性范围应用参考文献夹心ELISAStx 2纳米抗体-生物素化(HA-2vb10-6xHis)4 ng/mL—粪便[25]夹心ELISA大肠杆菌O157∶H7单价纳米抗体(VHH O3)8.7×103 CFU/mL103～109 CFU/mL牛肉、橙汁、牛奶[26]O-ELISA肠炎沙门氏菌二价纳米抗体(NbS22-V20、phage -NbS22)3.33×103 CFU/mL—鸡肉副溶血性弧菌二价纳米抗体(NbS22-V20、phage -NbV28)6.35×104 CFU/mL—虾[27]夹心ELISA单核增生李斯特菌单价纳米抗体(L5-79)1×104 CFU/mL—火腿肠、牛肉、虾[19]Ph-ELCISA阪崎肠杆菌噬菌体展示纳米抗体(Cs-Nb2、phage-Cs-Nb1)1.04×104 CFU/mL1.69×103～1×108CFU/mL奶粉、牛奶[28]P-CLISA鼠伤寒沙门氏菌噬菌体展示纳米抗体(Nb9、phage -Nb1)3.63×103 CFU/mL5.1×103～1.2×106CFU/mL果汁、蜂蜜、牛奶、猪肉[29]FbNb-CLISA沙门氏菌纳米抗体融合蛋白(Fb、Nb422)2.94×103 CFU/mL—果汁、蜂蜜、牛奶[30]LFIA鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体-纳米颗粒(Au/SA@Bio-Nb)103 CFU/mL103～107 CFU/mL牛奶、果汁、猪肉[31]KNb-DITS鼠伤寒沙门氏菌纳米抗体-纳米颗粒(KMO@Au@Nb9 p)103 CFU/mL103～108 CFU/mL果汁、蜂蜜、巧克力[32]D-LFIA肠炎沙门氏菌单核增生李斯特菌空肠弯曲菌纳米抗体-纳米颗粒(Fe3O4@sio2 @TQD@Nb)38 CFU/mL—125 CFU/mL—47 CFU/mL—牛奶、猪肉[33]IS副溶血性弧菌噬菌体展示纳米抗体(phage -Nb20-SH)103 CFU /mL—虾[34]OTA纳米抗体融合蛋白(SG-FP-Nb)5 pg/mL5～5 000 pg/mL大米、大麦、小麦、燕麦[35]AFB1单价纳米抗体(Nb70)3.3 pg/mL0.01～100 ng/mL小麦[36]IPCRAFB1噬菌体展示纳米抗体(phage -Nb V2-5)0.02 ng/mL—玉米、大米、花生、饲料[37]LC-MS/MSAFB1单价纳米抗体(AFB1 Nb)0.014 ng/mL0.1～100.0 μg/L玉米[38]
注:“—”表示文献未注明。
图3 纳米抗体中和治疗食源性致病菌的主要途径
Fig.3 Major pathways of nanobodies for neutralization therapy foodborne pathogens
3.1 大肠杆菌
大肠杆菌是肠道菌群中分布广泛的兼性厌氧菌,每年导致全球超过200万人死亡[40]。其主要致病型包括产肠毒素大肠杆菌和产志贺毒素大肠杆菌。产肠毒素大肠杆菌是一种非侵入性病原体,可借助定植因子吸附于肠黏膜产生肠毒素,引起肠腔内液体积聚及腹泻。产肠毒素大肠杆菌引起的水样腹泻是新生仔猪及断奶仔猪发病、死亡的主要原因,其中F4菌毛是其常见的黏附素[41]。HARMSEN等[42]筛选出6种抗F4菌毛的纳米抗体,并从中选出对产肠毒素大肠杆菌黏附性最强、表达量最高的K609进行进一步分析。体外黏附试验和小肠灌注试验表明,K609对细菌附着的抑制率可达90%,并能将感染产肠毒素大肠杆菌的小肠恢复至正常水平的30%,显著减少空肠段中的液体流失。随后,该团队进一步将K922偶联成二价纳米抗体BL1.2,作为饲料添加剂给予断奶仔猪。该二价体经胃液处理后仍保持78%的结合能力,可有效抑制产肠毒素大肠杆菌的增殖与黏附[43],显示出二价纳米抗体作为饲料添加剂限制小猪中产肠毒素大肠杆菌繁殖的潜力。此外,通过开发疫苗策略防止产肠毒素大肠杆菌附着和定植,也是当前防治产肠毒素大肠杆菌腹泻的有效方法。AMCHESLAVSKY等[44]采用产肠毒素大肠杆菌黏附素免疫美洲驼,成功筛选出11种特异性纳米抗体。通过小鼠模型口服灌胃实验发现,服用2R215、1H4、1D7和2R23的小鼠小肠中产肠毒素大肠杆菌的定植量分别下降2.9、2.3、1.7、1.5个对数单位,展现出良好的预防潜力。
产志贺毒素大肠杆菌可导致腹泻、溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)甚至死亡。Stx是产志贺毒素大肠杆菌的主要毒力因子。MEJ
AS等[45]制备了抗Stx 2B的纳米抗体,进一步将2个抗Stx 2B纳米抗体与1个抗血清白蛋白纳米抗体结合构建了三价融合蛋白(2vb27)2-SA,使其体内半衰期从5 min延长至15 d,并保护小鼠免受致死剂量Stx 2攻击,使其治疗活性大大提高,为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染以预防或改善HUS提供一个选择。另外,HUS可导致急性肾损伤、持续性肾脏疾病和死亡,目前还没有预防或治疗产志贺毒素大肠杆菌感染后HUS的特效疗法。ROBINSON等[46]开发了1种基于纳米抗体的中和剂(VHH-based neutralizing agents,VNA),并将其以RNA的形式负载于LION纳米颗粒中,通过肌肉注射给药,在给药时复制,从而产生一种可与全身毒素结合的快速循环的VNA。在小鼠急性Stx毒性模型中,肌肉注射RNA/VNA2-Stx可有效防止中毒和死亡。LU等[47]开发了1种能够同时阻断Stx和黏附素结合蛋白的双特异性中和剂siNb,与单价纳米抗体NB 113、IB 10相比,siNb结合亲和力分别提高了8.7倍、2.7倍,表现出显著的抗原结合能力。当Stx与黏附素蛋白共存时,siNb可同时结合Stx 2B亚基和紧密连接蛋白的C末端IntC 280,从而有效阻断这些毒力因子与其他受体的相互结合。此外,siNb在恶劣的储存条件及胃肠道pH环境中表现出良好的稳定性。在4 ℃储存30 d后,其对Stx 2B和IntC 280的结合活仍分别保持在85%和75%以上,即使在pH值为1.9的极端酸性条件下,也能保留至少25%的结合能力。这些特性表明siNb具备开发为抗产志贺毒素大肠杆菌感染治疗剂的潜力。
3.2 金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌是1种广泛分布的革兰阳性菌,能够产生多种毒力因子,引起多种感染性疾病、中毒性休克综合征以及食物中毒。其中,金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是该菌重要的毒力因子。MING等[48]利用酵母表面展示技术结合荧光激活细胞分选技术,筛选出1种靶向SEB的纳米抗体Nb 8。分子对接模拟显示,Nb 8的CDR3区能够与SEB的MHC-II结构域结合,阻断SEB和MHC-II之间的相互作用。体外实验证实,Nb 8可抑制SEB诱导的IL-1β和TNF-α的mRNA表达,进而缓解SEB所引起的炎症反应。HUGHES等[49]则开发了15种抗SEB特异性纳米抗体,其中11种具有中和活性,并在人外周血单核细胞实验中显著抑制IL-2的表达。此外,金黄色葡萄球菌凝集因子A(clumping factor A, ClfA)作为一种纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)结合蛋白,在血浆中介导细菌凝集过程中起关键作用[50]。MEI等[51]筛选出抗ClfA 221-550的纳米抗体,并通过易错PCR技术提高其结合亲和力,最终获得抑制效果最优的突变体CNb 1。当浓度为50 μmol/L时,CNb 1对Fg的抑制效率约68%。结构模拟分析表明,CNb 1不仅与ClfA D327C/K541C保持高亲和力,其结合表位更与ClfA的D327C/K541C-Fg互作区域存在部分重叠,从而抑制了ClfA与Fg的结合。凸显了CNb 1在控制金黄色葡萄球菌感染方面的潜在应用价值。
3.3 沙门氏菌
沙门氏菌是一种革兰氏阴性肠道致病菌,是引起胃肠道疾病的主要病原体之一。YANG等[52]表达并鉴定了9种抗鞭毛蛋白C(flagellin C, FliC)的特异性纳米抗体,其中FliC-Nb-76通过氢键和疏水相互作用与FliC蛋白结合,有效抑制了沙门氏菌的运动性,并降低其对HIEC-6、RAW264.7及鸡肠上皮细胞的黏附与侵袭能力。研究还构建了可分泌FliC-Nb-76的重组乳酸乳杆菌菌株FliC-Nb-76 NZ 9000,动物实验表明该菌株可显著降低沙门氏菌感染雏鸡的死亡率,同时减轻由该病原体引起的炎症反应。DULAL等[53]用伤寒毒素(typhoid toxin,TyTox)免疫羊驼,获得了41个特异性纳米抗体。通过竞争ELISA进行表位分类,筛选出2种抗PltB(T2E7和T2G9)和4种抗CdtB(T4C4、T4C12、T4E5和T4E8)的纳米抗体。其中,T2E7、T2G9和T4E5在体内表现出显著的TyTox中和活性。小鼠在接受致死剂量TyTox攻击后全部存活,且几乎未出现TyTox介导的上肢运动功能损伤。HUEN等[54]筛选出一种靶向FliC的纳米抗体Abi-Se07,其与FliC的亲和力为(16.2±0.1) nmol/L,并能与伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、海德堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)和哈达尔沙门氏菌(Salmonella hadar)等多种血清型交叉结合。通过鸡小肠上皮细胞体外侵袭试验和定量PCR检测发现,经Abi-Se07处理后,沙门氏菌的DNA拷贝数减少了2.7倍,表明该纳米抗体可显著抑制细菌运动性及其在宿主肠道的定植,展现出良好的治疗潜力。
3.4 单核增生李斯特菌
单核增生李斯特菌引起的李斯特菌病具有较高的死亡率。该菌可通过内化蛋白家族蛋白(如InlA、InlB)入侵宿主细胞,是其重要的毒力因子[55]。YAMAZAKI等[56]分离出2种高亲和力结合InlA的纳米抗体VHH 10和VHH 24。表面等离子体共振及等温滴定量热法分析表明,2种纳米抗体在体外能有效抑制InlA与E-钙黏蛋白胞外结构域的结合。在细胞入侵抑制试验中,仅100 ng/mL的VHH 10和VHH 24即可分别将细菌入侵率降低至0.04%、0.06%。KING等[57]筛选出3种高亲和力结合InlB的纳米抗体,并通过庆大霉素保护试验和荧光显微镜试验验证了它们对细菌入侵HeLa细胞的抑制能力。其中,纳米抗体VHH R303与InlB复合物的高分辨率X射线结构显示,其结合于InlB上的c-Met相互作用的位点,通过竞争性抑制剂阻断细菌入侵,为李斯特菌病的预防提供了新策略。
3.5 其他
肉毒梭菌是1种革兰氏阳性厌氧芽孢菌,其产生的肉毒杆菌神经毒素(botanicneurotoxins,BoNT)可抑制突触前神经元乙酰胆碱的释放,导致弛缓性神经肌肉麻痹和呼吸衰竭死亡。目前BoNT中毒尚无特效治疗。JIN团队[58-61]筛选了多种抗BoNT的特异性纳米抗体,如抗BoNT/A特异性纳米抗体(ciA-C2、ciA-B5)、抗BoNT/B特异性纳米抗体(JLK-G12、JLO-G11)、抗BoNT/E特异性纳米抗体(JLE-E5、JLE-E9)等。通过晶体结构分析发现,JLE-E5和JLE-E9结合于BoNT/E的易位结构域上假定的跨膜区域部分重叠的2个不同的表位,从而干扰BoNT/E1与脂质囊泡的结合,阻止蛋白通道形成,进而阻碍蛋白酶结构域的跨膜递送,最终中和BoNT/E1。这些研究为开发用于BoNT中毒的诊断和治疗剂奠定了基础。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种条件致病菌,其α毒素可导致家畜肠炎、肠毒血症以及人和动物的创伤性梭菌性肌坏死[62]。因此,对α毒素的预防和治疗至关重要。CPV-VHH是一种抗α毒素的特异性纳米抗体,在小鼠体内的半衰期可达2.8 h,且在60 ℃以下保持稳定[63]。该纳米抗体能有效中和α毒素的磷脂酶和溶血活性,在Vero细胞和模型小鼠中均表现出显著细胞毒性中和效果。当纳米抗体质量浓度为35.7 ng/g时,小鼠存活率提高至90%,展现出良好的治疗潜力。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是1种广泛存在于环境及医疗机构中的革兰氏阴性杆菌,是导致烧伤患者医院感染的主要病原体。其鞭毛蛋白通过Toll样受体引发宿主炎症反应,并参与生物膜形成。VHH 9D是一种在酿酒酵母中生产的抗鞭毛蛋白纳米抗体,具有nM级的亲和力,可有效结合铜绿假单胞菌的鞭毛、抑制菌体运动并阻止生物膜形成,在该菌的预防和治疗方面具有良好的应用潜力[64]。
真菌及其毒素是引发食源性疾病的另一重要因素。β-葡聚糖是真菌细胞壁的重要组成成分,LIU等[65]制备了一种针对β-葡聚糖的纳米抗体,并将那他霉素(natamycin, NAT)与纳米抗体的C端连接,形成Nb-NAT结合物。在体外实验中,Nb-NAT表现出显著的抗真菌作用,且与NAT相比,其细胞毒性和角膜刺激性更小。β-1,3-葡聚糖转移酶(β-1,3-glucanosyltransferase, Gel)在β-1,3-葡聚糖的合成、修饰和重塑过程中发挥关键作用,因此可作为潜在的药物靶点。REDRADO-HERN
NDEZ等[66]筛选出抗Gel的纳米抗体Nb3。在体外实验中,Nb 3对Gel4的抑制活性几乎达到100%,并在体外和体内模型中均表现出良好的抗菌效果。此外,在小鼠模型中,Nb 3通过给药显著提高了感染新型隐球菌和曲霉菌小鼠的存活率,并减少了真菌定植。伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)具有致癌、致突变、畸形性、细胞毒性、肾毒性、神经毒性等多种毒性。CHEN等[67]通过免疫羊驼筛选出抗FB1的纳米抗体Nb 5,在鸡胚胎实验中,Nb 5处理组的孵化率、雏鸡体重和FB1残留均显著优于未处理组。在肉鸡实验中,每日口服FB1的肉鸡体重显著下降,而Nb 5组的相对体重增加更高,胃溃疡率、脾脏和滑囊炎更少。表明Nb5可作为FB1解毒剂,用于中和FB1。
纳米抗体在食源性致病菌中和治疗中的应用主要包括上述几种,详见表2。
表2 纳米抗体在食源性致病菌中和治疗中的应用
Table 2 Application of nanobodies in neutralizing and treating foodborne pathogens
食源性致病菌靶向分子纳米抗体功能亲和力IC50EC50参考文献大肠杆菌F4菌毛K609抑制细菌附着———[42]F4菌毛BL1.2抑制细菌增殖与附着———[43]CFsR215、2R23、1H4、1D7抑制细菌定植—10.213、5.09 μmol/L—[44]Stx 2B2vb27、(2vb27)2-SA中和毒素—0.5、0.06 nmol/L—[45]StxJKB-2中和毒素———[46]Stx 2B、IntC280siNb中和毒素———[47]金黄色葡萄球菌SEBNb8中和毒素、抑制炎症反应100.5 nmol/L——[48]SEBSEB-5、SEB-9、SEB-20等中和毒素———[49]ClfACNb 1抑制细菌黏附——(4.8±0.3) nmol/L[50]沙门氏菌FliCFliC-Nb-76抑制细菌运动、黏附——1.373 nmol/L[52]Pltb、CdtBT2E7、T2G9T4E5中和毒素629、341、95.8 pmol/L——[53]FliCAbi-Se07抑制细菌运动、黏附(16.2±0.1) nmol/L—(6.5±3.4) nmol/L[54]单核增生李斯特菌InlAVHH10、VHH24抑制InlA与EC 12的结合,抑制细菌入侵696、194 pmol/L——[56]InlBR303与c-Met位点结合,抑制细菌入侵0.9 nmol/L—0.4 ng/mL[57]肉毒梭菌BoNT/A1、BoNT/B1CIA-B5、CIA-H7、CIA-D12等中和毒素———[58]BoNT/EJLE-E5、JLE-E9、JLE-G6、JLG-G12抑制BoNT/E1的结构变化,中和毒素——1～20 nmol/L[59-60]BoNT/ACIA-C2抑制BoNT/A与SV2的结合,中和毒素3.7 nmol/L——[61]产气荚膜梭菌α毒素CPV-VHH中和毒素0.9 nmol/L9.8 μg/mL—[62]铜绿假单胞菌鞭毛蛋白VHH 9D抑制细菌运动,防止生物膜形成4.7 nmol/L——[64]曲霉β-葡聚糖Nb-NAT抑制真菌生长———[65]曲霉、新生隐球菌Gel4Nb3抑制细胞壁生成,抑制真菌定植3.24 nmol/L——[66]镰刀菌、曲菌FB1Nb5中和毒素———[67]
4 结论
随着食源性致病菌耐药性的增加及对公共卫生威胁的加剧,开发新型检测与治疗技术显得尤为迫切。纳米抗体凭借独特的生物学特性,成为食源性致病菌防控领域中极具潜力的工具。在治疗方面,基于纳米抗体及其多聚体的策略已成为研究重点。目前大多数治疗策略依赖于纳米抗体对毒素的中和作用或对鞭毛运动的抑制。然而,由于食源性致病菌结构复杂,致病机制多样,单一靶点的干预往往难以彻底消除感染风险。此外,目前对食源性致病菌的研究主要集中在细菌方面,对真菌及其毒素治疗的研究略有不足,且对纳米抗体免疫原性认识的不足,一定程度上限制了其临床应用。在诊断方面,纳米抗体通常与信号蛋白或纳米材料偶联,显著提升检测系统的灵敏度与特异性。各类基于纳米抗体免疫检测方法不仅增强了检测性能,还简化了操作流程,大幅度缩短了检测时间。尽管纳米抗体在食源性致病菌检测中已取得了显著进展,仍面临若干挑战。例如,纳米抗体的研发技术门槛仍较高,筛选高亲和力纳米抗体需要投入大量时间与资源;而且,现有检测方法覆盖的病原种类仍有限,对复杂污染样本中多种菌共存情况的检测能力尚显不足。未来,该领域的发展趋势将朝着多学科交叉、技术联用发展,通过优化筛选流程,降低高亲和力纳米抗体研发门槛,推动多靶点协同干预策略的建立,以应对抗菌机制的复杂性。同时,推动检测技术不断创新,使食品安全检测更快速便携准确。
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