据世界卫生组织估计,全球每年有约6亿人因食用受污染的食品而患病,其中造成42万人死亡[1]。我国报告平均每年每6.5人中,就有1人因摄入污染致病菌的食品而患病[2]。目前杀灭食源性致病菌最有效、最经济的手段就是进行有效的热处理,因热处理不仅可以有效杀灭食源性致病菌,还可以达到熟制的目的,使产品具有良好的商业价值。因此,食源性致病菌的耐热性成为国内外研究的热点。现有研究主要集中在采用不同方式探讨致病菌的耐热性,通过探究其D值(在一定的环境和温度下,杀死某细菌数群原有残存活菌数90%所需的时间)、Z值(热力致死时间呈10倍增加或减小时,所对应的杀菌温度变化值)、F值(特定温度下,杀灭微生物所需要的时间)、杀菌温度、杀菌时间等,评价食源性致病菌的耐热性[3-4]。由于研究方法不同造成结果差异较大,本文通过总结国内外常见食源性致病菌耐热性研究情况,利用细菌致死率公式把不同条件下的耐热性换算成同一条件下的耐热性进行比较,直观探究其差异产生的原因,总结出良好耐热性研究方法,并提出相关建议,以期为未来相关研究提供有益的参考,为食品加工企业保障食品安全提供了有益的指导。
1 常见食源性致病菌选取
为保证文献的权威性和代表性,本研究以知网、Web of Science引文数据库的核心合集作为检索源,通过检索致病菌、风险评估等关键词,选择具有代表性、高质量期刊、研究较系统、发表时间较新的相关论文作为研究对象。
食品加工过程控制的主要致病菌即为热力杀菌的目标菌。综合有关研究,食品加工中常见较耐热致病菌为:肉毒梭菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌[5-6]。
分别选取我国东北、华北、西北、华中、华南5地区中5省市近五年食源性致病菌总体研究结果,以及进口食品食源性致病菌污染情况,进行汇总归纳。表1显示:单增李斯特菌出现的频率为6,沙门氏菌出现的频率为5,金黄色葡萄球菌与阪崎克罗诺杆菌出现的频率均为4,副溶血性弧菌出现的频率3,蜡样芽孢杆菌出现的频率为2,大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌出现的频率均为1。
通过微生物风险分级模型和风险矩阵[13-14],对食源性致病菌影响人群健康情况进行分析,微生物定量风险评估(swift quantitative microbiological risk assessment,sQMRA)发现41.67%的病例为沙门氏菌的食物中毒,第二为金黄色葡萄球菌食物中毒,第三为蜡样芽孢杆菌食物中毒。通过风险评估器发现,56.84%的病例为沙门氏菌食物中毒,第二为蜡样芽孢杆菌食物中毒,第三为金黄色葡萄球菌食物中毒[15]。通过sQMRA和Risk Ranger的研究发现,沙门氏菌感染程度最高,其次为金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。
表1 销售食源性致病菌污染情况汇总
Table 1 Summary of foodborne pathogens pollution in retail food
地区致病菌单增李斯特菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌蜡样芽孢杆菌大肠埃希氏菌副溶血性弧菌霍乱弧菌阪崎克罗诺杆菌小肠结肠炎耶尔森菌新疆[7]√√√√√√√河南省[8]√√√吉林省[9]√√√北京市[10]√√√√福建省[11]√√√√√进口[12]√√√√√
以食源性致病菌在食品加工过程、市场调研、风险分级分别作为一个集合,对3个集合采用韦恩图分析,分析结果见图1。
图1 食源性致病菌三集合交集
Fig.1 The intersection of three sets of foodborne pathogens
根据微生物风险性评估的原则和指南结合专家循证评价方法,选取在每个研究过程中排名第一的致病菌和3个研究过程有交集的致病菌作为研究对象,可以得出本次研究的常见食源性致病菌为:肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌共5种。
2 常见食源性致病菌耐热性研究进展
为了更直观、更有效的对食源性致病菌耐热性进行比较分析,可以采用细菌致死率来代表细菌的耐热性,而细菌致死率计算如公式(1)所示[16]:
(1)
式中:T1,标准温度,即参考的温度;T2,需要转换的温度;Z,T1条件下的参考Z值。
把不同温度下的耐热性转换到同一温度下的耐热性进行比较。
2.1 肉毒梭菌耐热性
肉毒梭菌是一种厌氧芽孢菌,形成的孢子比母细胞大,呈梭形,若人体摄入的肉毒梭菌超过0.1 μg, 便具有致死的风险。即便人体摄入的肉毒梭菌量较低,也会导致神经系统受到破坏,出现斜视、头晕、呼吸困难、肌肉乏力等症状。如果把A型肉毒梭菌置于120 ℃的高温环境中, 仅需4 min就能将其灭活[17]。选取T1=121 ℃,Z=10 ℃[18],计算转换后的F值,然后对肉毒梭菌耐热性进行总结归纳见表2。
对表2归纳总结可知:1)从研究时间来看,除罐藏食品热穿透测试规程是2021年出版的,其他文献均在2014年之前,这是因为肉毒梭菌风险较高,早期研究较多且趋于成熟;2)从研究方法来说,肉毒梭菌耐热性结果大分部源于实验室,采用耐热性特征值D值和Z值进行研究;3)从耐热性结果来看,致死温度研究范围较广,从100～121 ℃,跨度21 ℃。选取肉毒梭菌最低耐热性1.79,是肉毒梭菌毒素0.04～0.2耐热性的8.95～44.7倍,说明肉毒梭菌耐热性显著高于其毒素;而李笑坤[22]研究结果(17.28)为GB/T 39945—2021《罐藏食品热穿透测试规程》[18]和中国SN/T 0400.6—2005《进出口罐头食品检验规程 第6部分:热力杀菌》[19]规定值(3)的5.76倍,雷桅等[20]研究结果是规定值的3.33倍以上,产生上述偏差的主要原因是,实验过程对初始菌群数量设定、杀菌条件计算等因素造成的;4)ESTEBAN等[23]利用不同模型对肉毒梭菌耐热性进行研究,不同模型之间得出的耐热时间存在高达17%的差异。所以在研究过程中,综合考虑模型和实验数据,并对模型进行修正,剔除偏差产生因素,得出的最终结果更具有参考价值。
表2 肉毒梭菌耐热性汇总
Table 2 Summary of heat resistance of C. botulinum
致死温度/℃致死时间/min耐热性特征值得出结果方式转换后的F值参考文献1213.0—国家标准3.0[18]1213.0—出入境标准3.0[19]121≥10—实验室≥10[20]煮沸5～20(毒素)——0.04～0.2[21]12117.28(按照12D计算)D和Z实验室17.28[22]1202.63(Weibull模型,pH=7.0)1202.25(Geeraerd模型,pH=7.0)D和Z实验室2.091.79[23]
注:—表示无相应数据(下同)。
2.2 金黄色葡萄球菌耐热性
金黄色葡萄球菌是较为常见的食源性致病菌,该菌是一种典型的革兰氏阳性致病菌,普遍表现出耐盐、耐干旱的特性,这些特性使其能够在较为苛刻的环境中长期存活和传播,在皮肤黏膜等组织发生损伤或机体免疫能力下降时,该菌能够侵入机体,引起表皮软组织、血液或脏器感染[24]。另外,金黄色葡萄球菌代谢过程中能够产生对人体有害的肠毒素,肠毒素经摄食进入人体消化系统会产生恶心、呕吐、腹泻、腹痛等食物中毒症状[25]。选取T1=65 ℃,Z=11.8 ℃[26],计算转换后的F值,对金黄色葡萄球菌耐热性进行总结归纳见表3。
表3 金黄色葡萄球菌耐热性汇总
Table 3 Summary of heat resistance of S. aureus
致死温度/℃致死时间/min细菌/毒素耐热性特征值实验方式转换后的F值参考文献57～61(中心温度)112.2～52.7细菌D和Z实验室23.56～24.14[26]650.76～7.64(4D计算)细菌D和Z实验室0.76～7.64[27]6515细菌—实验室15[28]10030肠毒素—实验室94 868[29]
对表3进行归纳总结可得:1)从研究方法来说,基本上是研究D值和Z值,全部是在实验室内进行研究;2)对卢玮[28]和孙冲等[29]研究结果进行比较,金黄色葡萄球菌产生的肠毒素耐热性(94 868)是金黄色葡萄球菌耐热性(15)的6 324.5倍,所以在实际生活和应用过程中更应该关注毒素的产生和污染;3)国外对金黄色葡萄球菌的耐热性研究是遵循细菌耐热性的一般研究规律,先研究D值和Z值,再研究其总体耐热性,而国内采用直接表达致死温度和时间的方式进行研究;4)从研究结果来看,致死温度研究范围较广,从65～100 ℃,跨度35 ℃。耐热性研究结果差异较大,最高94 868与最低0.76相差124 825倍,卢玮[28]研究结果为15,与LEHOTOV
等[26]研究结果23.56～24.14较接近,研究差异性较大是由研究的前提假设、研究方法和实验设计不同造成的。
2.3 沙门氏菌耐热性
尽管沙门氏菌不能形成芽孢,但热处理后的产品仍可能会被沙门氏菌污染[30]。在生产环境中,沙门氏菌可在惰性的和有机体表面形成生物膜,可以将菌体保护起来,对不良环境具有极强耐受力[31]。选取T1=71 ℃,Z=6.31 ℃[32],计算转换后的F值,对沙门氏菌耐热性进行总结归纳见表4。
对表4归纳总结可得:1)从研究方法来说,基本上是出自实验室研究其D值和Z值;2)由研究结果可知,沙门氏菌的耐热性与水分活度有关,水分活度越高,耐热性越差[33-35]。最低水分活度条件下的耐热性最大(1 980.18),最高水分活度条件下的耐热性为0.101,两者相差19 604.74倍,主要是因为水分活度越高,产品传热性能越好,细菌更容易被杀死。但是在相近的水分活度条件下,MATTICK等[34]的研究结果为34.74(水分活度0.45),而ALSHAMMARI等[35]研究表明在水分活度为0.4时,转换后的F值为260.55～301.08,两者相差6.5～7.67倍,主要是研究方法不同造成的,而国内很少关注水分活度对此的影响;3)从沙门氏菌耐热性的结果来看,致死温度研究范围较广,从65.6～80 ℃,相差14.6 ℃。宋晓燕等[32]耐热性研究结果为0.568,SUMNER等[33]在产品水分活度为0.98时的耐热值为0.101,均达不到加拿大卫生部推荐的参考值,而其他研究结果均远远大于标准值1,最低为其14.03倍。应分析较大差异产生的原因,减少此类问题的出现;4)按照加拿大卫生部的标准,只要产品中心温度达到71 ℃,即可对沙门氏菌进行灭活,对于限定条件,比如水分活度均未考虑,这对后续研究更具有现实意义。
表4 沙门氏菌耐热性汇总
Table 4 Summary of heat resistance of Salmonella
中心温度/℃致死时间/min耐热性特征值实验方式备注转换后的F值参考文献68.1—D和Z实验室—0.568[32]65.60.29 D实验室产品水分活度0.980.10140.2——产品水分活度0.8314.03[33]806D和Z—产品水分活度0.4534.74[34]8045～52101.5～111.5181～196288～342D和Z实验室产品水分活度0.50260.55～301.08产品水分活度0.40587.69～1134.84产品水分活度0.311 047.99～1 134.84产品水分活度0.181 667.52～1 980.18[35]71————1[36]
2.4 单增李斯特菌耐热性
单增李斯特菌是一种常见的食源性致病菌,它比大多非芽孢菌具有更强的耐热性和较强的环境适应能力,可在低温、高渗透压、酸性/碱性等不利环境下存活。这些特性使得分布在自然界和食品加工环境中的单增李斯特菌成为重要的食品安全隐患[37]。因此,明确单增李斯特菌的耐热性对于食品安全防护至关重要。选取T1=70 ℃,Z=7.5 ℃[38],计算转换后的F值,对单增李斯特菌耐热性的总结归纳见表5。
表5 单增李斯特菌耐热性汇总
Table 5 Summary of heat resistance of L. monocytogenes
中心温度/℃致死时间/min耐热性特征值实验方式备注转换后的F值参考文献702——水产品危害及控制指南2.0[38]6320D和Z实验室生理盐水和MH肉汤基质1.17[39]712D和Z实验室—2.72[40]608D和Z实验室—0.37[41]6896D和Z实验室Brie-1菌株25.9762.4D和Z实验室LCDC81-861菌株16.8844.4D和Z实验室Scott A菌株12.0134.2D和Z实验室DA-3菌株9.25[42]
对表5归纳总结可得:1)从研究方法来说,绝大部分是在实验室内通过D值和Z值研究其耐热性;2)GOLDEN等[42]认为单增李斯特菌耐热性和菌株有很大的关系,其中Brie-1菌株耐热性最强为25.97,DA-3菌株耐热性最差为9.25,两者相差2.8倍;3)从整体研究结果来看,致死温度研究范围从60～71 ℃,跨度为11 ℃。单增李斯特菌最高耐热性为25.97,最低耐热性为0.37,两者相差69.19倍;4)水产品危害及控制指南作为美国食品药品监督管理局官方审核指南,其要求为:在70 ℃条件下,F值为2,与唐宇宏[40]的研究结果(2.72)相接近。
2.5 蜡样芽孢杆菌耐热性
蜡样芽孢杆菌能够在不良环境下形成休眠的芽孢。该芽孢对热、干燥和辐射具有极强的抵抗力,因此能在加热杀菌过程中存活。随后在食品贮存期间,一旦条件适宜,芽孢便会萌发并大量繁殖,产生致吐毒素或致腹泻毒素,进而造成食物中毒,其症状与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等细菌引发的食物中毒类似,主要为恶心呕吐,可能伴有发烧、腹泻与乏力等[43]。选取T1=121 ℃,Z=11.30 ℃[44],计算转换后的F值,对蜡样芽孢杆菌耐热性进行总结归纳见表6。
对表6归纳总结可得:1)从研究方法来说,全部是在实验室内进行的,绝大部分研究的是D值和Z值;2)RAJKOVIC等[49]的研究结果可知,呕吐毒素的耐热性为80,远远大于所有研究蜡样芽孢杆菌菌体的耐热性,也是所有菌株耐热性中最大值(20)的4倍,所以未来应更关注毒素形成及其抑制条件。蜡样芽孢杆菌菌体耐热性研究结果的最大值(20)是其最小值(0.035)的2 285.7倍,在实际生产过程中,如果按照最高F值对产品来进行灭菌,那么产品的商业价值就有可能大打折扣,因此,应关注研究过程的科学性以及差异性产生的原因,应用过程应增加从实验室到产业上的验证环节;3)在所有蜡样芽孢杆菌耐热性研究中,致死温度研究范围较广,从95～121 ℃,跨度为26 ℃。在同一PBS条件下,HAYRAPETYAN等[48]研究的结论为0.66是JAGANNATH等[47]结论(0.042)的15.71倍。
表6 蜡样芽孢杆菌耐热性汇总
Table 6 Summary of heat resistance of B. cereus
致死温度/℃致死时间/min耐热性特征值实验方式备注转换后的F值参考来源1210.95～1.48D和Z实验室—0.95～1.48[44]12120—实验室—20[45]100(中心温度)2.52D和Z实验室—0.035[46]100(中心温度)3D和Z实验室PBS0.042[47]95(中心温度)132D和Z实验室PBS0.66[48]12180—实验室pH值9.5,呕吐毒素80[49]
2.6 综合分析
对上述5种致病菌及其毒素的耐热性进行了分析,选取上述致病菌及其毒素耐热性最强的F值,耐热性转换如公式(2)所示[50]:
F2=F1×10∧[(T1-T2)/Z]
(2)
式中:F1,参考温度T1条件下测得的灭菌时间;F2,目标温度T2条件下达到与F1相同灭菌效果所需的等效时间;T1,参考温度,℃;T2,实际灭菌温度,℃。
把不同温度下的F值转换成同一温度下的F值,即F转=F2,根据公式设置T1=121 ℃,F1即为原温度下的F值,把所有的F值均转换总结归见表7。
表7 五种食源性致病菌耐热性比较
Table 7 Comparative heat resistance of five foodborne pathogens
致病菌(毒素)种类参考温度/℃F值理论转换F转值肉毒梭菌12117.2817.28肉毒梭菌毒素1000.21.6×10-3金黄色葡萄球菌6524.156.1×10-6金黄色葡萄球菌肠毒素6594 8680.238沙门氏菌711 980.180.02单增李斯特菌7025.972.06×10-4蜡样芽孢杆菌1212020蜡样芽孢杆菌呕吐毒素1218080
对表7进行综合分析得出不同致病菌及其毒素耐热性顺序为:蜡样芽孢杆菌毒素(80)> 蜡样芽孢杆菌(20)>肉毒梭菌(17.82)>金黄色葡萄球菌肠毒素(0.238)>沙门氏菌(0.02)>肉毒梭菌毒素(1.6×10-3)>单增李斯特菌(2.06×10-4)>金黄色葡萄球菌(6.1×10-6)。通过上述分析可知,在同一种食品同时受到几种致病菌污染的情况,只要关注杀灭耐热性最强的致病菌即可。
3 结论与展望
食源性致病菌耐热性研究方法主要有3种:1)研究热致死温度和热致死时间;2)研究热致死中心温度的和热致死时间;3)研究热致死温度和最终结果F值。从研究的科学性来说,第1种方法因为缺乏食品的传热特性,所以适用性较差;第2种方法对于杀菌温度<100 ℃的致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌)来说,操作和使用比较方便;第3种方法对于杀菌温度>100 ℃的致病菌(肉毒梭菌、蜡样芽孢杆菌)来说更为有效。而目前企业很少关注所生产食品针对的目标菌,只是根据经验来设定热致死温度和时间,再去检验杀菌结果来验证加工过程的有效性,不仅效率低,而且需要多次反复验证。因此在对不同类型食品进行热处理的时候,首先要明确产品的目标菌,根据目标菌耐热程度进行实验,验证产品安全性和产品品质,最终确定杀菌公式。
同一种食源性致病菌耐热性产生较大差异的影响因素为:1)食品本身特性、菌株等原始条件的不同;2)过程条件,如缓冲液、温度、含盐量等过程条件的变化;3)计算方法不同,食源性致病菌耐热性大部分是基于实验室结果得出的。常规的计算方法有3种:一是选定特定微生物、增菌、模拟灭菌、计算D或Z值、D和Z值、D值Z值和F值;二是采用半定量评估、热失活模型、微生物动力学等探究其耐热性;三是直接利用微生物挑战性实验[51]。因此在研究过程中,应综合上述影响因素,明确产品特定属性,优化过程条件,最后选择合适的计算方法模拟计算。理论计算结束后,根据实际生产条件下热力杀菌验证,即根据热分布、热穿透检测结果制定出合理的杀菌条件,这样理论与实践相结合,可以大大减少结果的偏差,制定更为科学的耐热性指导公式。
中国SN/T 0400.6—2005《进出口罐头食品检验规程 第6部分:热力杀菌》和GB/T 39945—2021《罐藏食品热穿透测试规程》对肉毒梭菌的耐热性、加拿大卫生部对沙门氏菌耐热性、美国水产品危害与控制指南对单增李斯特菌耐热性从法律法规或标准层面上提出来具体要求,企业可以直接进行引用,对于金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的耐热性没有明确的官方指导文件,未来官方如能给出上述致病菌的具体要求,形成有效指导的法律法规或标准,则有利于整个食品行业的进一步发展和提升。
未来食源性致病菌耐热性的研究应聚焦菌株多样性与耐热性特质之间的相关性,聚焦不同食源性致病菌耐热性影响因素、食品热力杀菌与营养之间关系等方面的研究;应致力推动政府在不同致病菌耐热性相关标准、法律法规等的建立,指导企业、实际生产生活建立更为科学的杀菌规程,推动利用系统生物学、人工智能、细胞工程等技术完成基于食源性致病菌耐热性交叉学科或方向的研究。
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