副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一类典型的食源性致病菌,属于革兰氏阴性嗜盐菌,广泛分布于沿海环境[1-2],在全球温带及热带区域均有相关感染病例报道,是引发全球食源性急性胃肠炎的重要病原菌之一。近年来,副溶血性弧菌的污染范围已由海产品逐渐向淡水产品延伸,成为内陆地区不可忽视的食品安全风险因素。人们在日常饮食中若摄入被副溶血性弧菌污染的水产品,易出现腹泻、呕吐、发热等急性胃肠炎症状,严重时可引发败血症等并发症[3-4]。
副溶血性弧菌主要通过污染的海产品侵入人体胃肠道并引发感染,而人体肠道内不仅存在复杂的微生物群落,还具有多样的理化环境,胆盐便是其中关键环境因子之一。当副溶血性弧菌进入人体后,首先需要耐受胃肠道内的胆盐环境,胆盐不仅具有抑菌作用,还可作为信号分子调控细菌毒力基因的表达。同时,细菌能否形成稳定的生物被膜,直接影响其在肠道内的定植、存活及致病能力。
食源性致病菌生物被膜形成的异质性,受菌株来源、培养环境、基因型、血清型及接触材料等多种因素影响,显著增加了致病菌的防控难度。若副溶血性弧菌在小肠内受胆盐胁迫形成生物被膜,将给临床治疗带来巨大挑战,同时也会降低其风险评估结果的准确性。已有研究证实,胆盐可诱导或促进沙门氏菌、双歧杆菌、艰难梭菌、克雷伯氏菌等多种细菌形成生物被膜[5-8],但在胆盐胁迫下副溶血性弧菌生物被膜形成的异质性仍缺乏系统研究。
本课题组前期已探究了温度、盐度、pH、寡营养及人工模拟胃液等条件对副溶血性弧菌生长异质性的影响[9-11]。在此基础上,本研究聚焦不同浓度胆盐胁迫对副溶血性弧菌生物被膜形成异质性的影响,旨在进一步完善副溶血性弧菌异质性研究体系,为食品安全管控与临床治疗提供理论依据,为副溶血性弧菌生物被膜的精准防控提供新思路。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
本实验选用6株具代表性的副溶血性弧菌分离株。在生长环境分布上,菌株精准覆盖了从“自然环境和水产品”到“临床人体宿主”的完整感染链条, 其中VPC29、VPC44、VPC94来自上海市胃肠道门诊急性腹泻患者粪便(临床致病菌株),VPE9、VPE17、VPE49为实验室前期从海水及淡水捕捞虾类中纯化鉴定的环境优势菌株;在遗传特征上,6株菌针对性地涵盖了核心致病基因tdh(耐热直接溶血素)的阳性与阴性分离株(具体信息见表1),能为后续研究提供依据,保障实验结果的参考价值。为确保菌种的代谢活力与遗传稳定性,所有供试菌株均按标准规范悬浮于体积分数为25%的无菌甘油管中,并长期贮藏于-80 ℃超低温冰箱内备用。
表1 六株副溶血性弧菌的信息
Table 1 Information of 6 strains of V.parahaemolyticus
菌株编号毒力基因tdhtrhtlh来源VPE9+-+海水VPE17+-+海水VPE49--+淡水虾VPC29+-+急性腹泻患者VPC44+-+急性腹泻患者VPC94-++急性腹泻患者
注:+代表菌株携带此基因,-代表没有携带此基因。
基础分离与扩增培养基[硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(thiosulfate citrate bile salts sucrose,TCBS)琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤(trypticase soy broth,TSB)],北京陆桥技术有限责任公司;样本固定与荧光染色系统(4% 戊二醛固定液、SYBR GreenⅠ核酸染料、PBS),生物工程(上海)股份有限公司;胆盐、结晶紫,美国Sigma公司;体积分数95%的乙醇,国药集团化学试剂(上海)有限公司;增强型 CCK-8 检测试剂盒,碧云天生物技术有限公司。
1.2 实验设备
MIR-254恒温培养箱、HZQ-X300C恒温振荡器,上海一恒科学仪器有限公司;5804R高速台式离心机,德国Eppendorf公司;SynergyTM2酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;TCS SP8激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM),德国Leica公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株培养
将超低温冻存于甘油的菌液取出后,采用划线法将其接种于TCBS琼脂固体平板上,并置于恒温培养箱(37 ℃)内静置孵育12 h以完成初次活化。接着挑取形态典型的单一菌落,转接至含有5 mL TSB液体培养基(pH 8.0,NaCl质量分数3.0%)的试管中。将试管置于恒温摇床内,37 ℃、220 r/min振荡培养过夜。待扩培完成后,将富集的过夜菌液置于离心机中,4 000 r/min离心10 min以富集菌体。随后弃去上清液,利用新鲜配制的TSB培养基对底部的菌体沉淀进行重悬,使其OD600nm的值为0.6 ～0.7(此时通过平板计数测得菌液中的细胞数量约为108 CFU/mL),确保后续实验中的初始活菌接种量控制在108 CFU/mL左右。
1.3.2 不同浓度胆盐的培养基的配制
为构建符合实验需求的胆盐胁迫条件,预先配制补充有质量分数3% NaCl的TSB作为基础液。在具体制备过程中,利用分析天平精准称取0.06、0.20、0.40、0.60 g四个梯度的纯胆盐粉末,分别置于独立的三角烧瓶内,121 ℃、15 min高压蒸汽灭菌。待灭菌容器冷却后,转入生物安全柜内进行操作:向各装有定额无菌胆盐的烧瓶中,分别定量注入200 mL 上述预先配制的含盐TSB基础液。经充分混匀溶解后,最终成功构建出胆盐浓度依次为0.03%、0.10%、0.20%、0.30%的系列胁迫培养基。此外,本实验同步设立未额外添加胆盐的纯 TSB 基础液,作为对照组。
1.3.3 不同浓度的胆盐胁迫下生物被膜的培养
参照KUMAR等[12]的经典微量滴定板法并稍作修改,采用24孔聚苯乙烯微孔板构建副溶血性弧菌被膜的体外发育模式。实验按照1∶100(体积比)的接种比例进行体系分配。以临床分离株VPC29为例,具体步骤如下:使用移液枪吸取10 μL活化好的菌液,分别精准接入预装有 990 μL 不同干预梯度培养液(即纯TSB培养液以及含0.03%、0.10%、0.20%、0.30% 胆盐的TSB胁迫液,基础盐度均为3% NaCl)的测试孔中,轻柔混匀以启动被膜诱导。其余5株菌株的接种体积与浓度梯度设置均与 VPC29 体系保持一致。上述每一个测试组合均设立3个独立的平行实验。接种完毕后,将24孔板整体置于无菌自封袋内密闭(旨在有效规避长时间孵育所诱发的水分挥发及边缘效应),随后移入25 ℃恒温培养箱内静置培养。整个胁迫周期涵盖12、24、36、48、60、72 h六个连续的时间监测节点;待达到预设的胁迫时间后,即终止培养并进入被膜生成量的定量表征阶段。
1.3.4 生物被膜的结晶紫实验
待各实验组达到预设的时间后,将24孔微量滴定板移出培养箱。吸取各孔内的上清培养液,随后沿孔壁缓慢加入0.1 mol/L的PBS冲洗2～3遍,旨在彻底剥离并清除体系中游离的浮游细菌。将洗涤后的培养板置于60 ℃恒温箱中固定15～20 min。待游离水分完全挥发后,向各孔内定量注入1 mL质量分数为0.1%的结晶紫染液,室温静置孵育20～30 min,以确保染料分子与被膜基质及细胞结构充分结合。染色程序结束后,弃染色液,并利用0.1 mol/L 的 PBS 连续漂洗3次,直至最后1次洗脱液呈现无色状态,以最大程度洗脱背景中非特异性附着的游离染料。随后,每孔加入1 mL体积分数为95%的乙醇溶液作为脱色剂,在室温下吸附30 min。期间借助移液枪反复轻柔吹打,促使结合态的结晶紫染料从固相被膜中完全释放并均匀溶解。精确吸取200 μL均质化的洗脱液转移至洁净的96孔板中。最终,用酶标仪读取各孔在 600 nm波长下的吸光度值(OD600nm),其数值代表形成的生物被膜量[13]。
1.3.5 生物被膜的细胞活力实验
为精确量化固着态被膜内细菌的存活状态与生理机能,本研究用增强型CCK-8快速比色检测试剂盒进行评估,参考LI等[14]的方法,在各实验组达到干预时间后,小心吸除微孔板内的上层游离培养物。随后,利用0.1 mol/L PBS对底部的被膜固着网络进行轻柔漂洗,充分规避残存浮游菌对最终读数的干扰。洗涤程序结束后,向每一测试微孔中定量回填1 mL新鲜的TSB基础培养液,并同步滴加100 μL的CCK-8溶液。将混合后的反应板整体移入25 ℃的恒温环境中,持续孵育不少于2 h,以确保试剂中的WST-8 能够被活细胞线粒体内的脱氢酶充分还原为橙黄色的甲臜染料。孵育结束,立即用酶标仪读取其在450 nm特征波长下的吸光度(OD450nm)。该光学特征值的动态变化可直接反映并量化不同胆盐胁迫条件下被膜细胞的整体增殖与代谢活力。
1.3.6 CLSM观察生物被膜
参考SONG等[15]的方法。将直径14 mm的定制无菌玻璃盖玻片平铺垫入24孔细胞培养板底部,作为被膜网络黏附生长的固相载体。随后,向各测试孔内精准接入含有不同浓度胆盐的菌液,并置于25 ℃恒温体系中连续动态胁迫。分别在24、48、72 h时,仔细吸掉上覆培养物,并使用0.1 mol/L PBS轻柔漂洗3遍,以彻底洗脱非特异性附着的游离细胞。待玻片表面自然风干,随即滴加1 mL体积分数为4%的戊二醛溶液,于4 ℃交联固定30 min,从而稳固被膜原始的三维空间构象。固定程序结束后,再次采用0.1 mol/L PBS连续洗涤2～3次以清除游离的交联剂残余。在核酸靶向标记阶段,向每孔注入200 μL经深度稀释(比例为 1∶10 000)的SYBR Green I荧光染料,于室温下严格避光孵育30 min;染色完毕后以PBS冲洗3遍并避光晾干,完成原位显微样品的制备。CLSM使用40×高分辨率物镜,激发光波长488 nm,荧光发射信号的采集通道在500～550 nm区间。获取的系列二维光学图片被无损导入 ISA-2生物被膜分析软件(美国蒙大拿州立大学生物膜工程中心Haluk Beyenal团队),以实现对生物被膜核心结构参数的精准三维定量解析[16]。
1.4 数据分析
实验的每组样品设置3平行,并进行3次独立重复实验后取平均值。使用Excel 2016进行数据计算;通过Origin 2024软件作图;使用SPSS 25.0软件采用One-way ANOVA和Duncan’s检验进行单因素方差分析,P<0.05 表示具有显著性差异[17]。
2 结果与分析
2.1 不同浓度的胆盐胁迫下环境菌株的生物被膜动态形成过程
形成生物被膜是细菌在漫长进化中衍生出的重要环境耐受机制。该过程不仅依赖于菌株固有的生物被膜形成潜能,还受到外部生长环境因素的影响。图1结果表明,无论在纯培养还是胆盐胁迫下,3株菌株的生物被膜量与细胞活力均表现出随时间先增长后减少的趋势。整体而言,在整个动态监测周期内,各胆盐处理组的生物被膜形成量总体趋势低于纯培养对照组,这一发育动态反映出胆盐对副溶血性弧菌生物被膜的形成具有整体的抑制趋势。当胆盐浓度超过0.20% 时,菌株几乎丧失生物被膜形成能力及细胞活力,凸显了高浓度胆盐的强烈抑制作用。此外,无胁迫条件下菌株VPE9的生物被膜形成高峰出现在48 h(图1-a),而VPE17与VPE49则在24 h达到峰值(图1-c和图1-e),证实了不同菌株在生物被膜形成上存在异质性。在低浓度(0.03%)胆盐环境中,携带tdh基因的VPE9和VPE17不仅生成生物被膜峰值的时间未变,且生物被膜量较纯培养组也无显著减少(P>0.05)(图1-a和图1-c),而不携带tdh基因的VPE49生成生物被膜峰值的时间向后推迟(图1-e),这反映出环境菌株的tdh阳性分离株对低浓度胆盐具有较强适应性,其生物被膜形成机制未受严重干扰。然而,随着胆盐浓度进一步增大,这2株菌的生物被膜量高峰均延迟至60 h;而VPE49在胆盐胁迫下,其峰值时间也统一推迟至48 h。这不仅进一步印证了胆盐的抑制作用,也表明在不同浓度胆盐胁迫下,副溶血性弧菌生物被膜形成的动力学特征具有显著的时间异质性。
a-VPE9生物被膜动态形成能力;b-VPE9生物被膜细胞活力;c-VPE17生物被膜动态形成能力;d-VPE17生物被膜细胞活力;e-VPE49生物被膜动态形成能力;f-VPE49生物被膜细胞活力
图1 不同浓度胆盐胁迫下副溶血性弧菌环境菌株生物被膜的动态形成能力、细菌细胞活力
Fig.1 Dynamic biofilm formation ability and bacterial cell viability of environmental strains of V.parahaemolyticus under different concentrations of bile salt stress
2.2 不同浓度的胆盐胁迫下临床菌株的生物被膜动态形成过程
图2结果显示,在纯培养体系中,3株临床菌株的生物被膜形成高峰均出现在48 h(图2-a、图2-c和图2-e)。对比而言,环境菌株VPE17和VPE49的峰值在24 h(图1-c和1-e),VPE9则在48 h(图1-a)。表明不同来源的副溶血性弧菌在生物被膜形成动力学特征上存在显著的时间异质性。类似于环境菌株,临床菌株在纯培养与胆盐胁迫中的生物被膜量及细胞活力也呈现随时间“先升后降”的动态变化;同时,胆盐处理组的整体成膜水平低于纯培养组。这再次印证了胆盐对副溶血性弧菌生物被膜的抑制作用。当胆盐浓度达到0.30% 时,临床菌株的生物被膜形成能力几乎完全丧失,与环境菌株表现一致;在0.20%的较高浓度下,临床菌株仍能维持微量的生物被膜生成。该现象表明,面对高浓度胆盐胁迫,临床菌株展现出了比环境菌株更强的成膜耐受潜力。在胆盐干预下,各临床菌株达到成膜峰值的时间均推迟至60 h。此时,低浓度(0.03%)胆盐组的生物被膜量甚至反超了纯培养对照组,这与环境菌株的响应模式截然不同。这一现象不仅进一步证实了临床菌株在受迫环境下更易形成生物被膜,同时也揭示了在60 h这一特定生长阶段,低浓度胆盐对临床菌株的生物被膜发育反而具有促进作用。
2.3 不同浓度的胆盐胁迫下副溶血性弧菌最大生物被膜量的比较
如图3所示,环境菌株与临床菌株的最大生物被膜量均呈现出随胆盐浓度递增而显著衰减的趋势。特别是当胆盐浓度升至0.20%时,两类菌株的最大生物被膜量均跌至极低水平,这充分证实了较高浓度的胆盐可强烈抑制副溶血性弧菌生物被膜的形成。结合图3-a与图3-b的分析可知,携带tdh基因的菌株(环境株VPE9和VPE17,临床株VPC29和VPC44)最大生物被膜量均高于不含该基因的菌株(VPE49与VPC94)。这一现象表明,tdh基因的存在赋予了副溶血性弧菌在胆盐胁迫下更为强劲的生物被膜形成潜力。环境菌株在纯培养及0.03%、0.10%、0.20%胆盐胁迫下,其最大生物被膜量(OD600nm)依次分布在1.49～2.04、1.30～1.73、0.46～0.83及0.18～0.31区间。相对应地,临床菌株则分布在1.48～1.98(纯培养)、0.96～1.42(0.03%)、0.41～1.03(0.10%)以及0.18～0.45(0.20%)。对比发现:在低浓度胆盐干预下,环境菌株的生物被膜形成能力优于临床菌株;然而,胆盐浓度达到0.20%时,临床菌株则展现出优于环境菌株的生物被膜形成能力。环境株VPE17与临床株VPC29在多梯度胆盐胁迫下均表现出较大的生物被膜形成能力,应作为后续深入探究该菌生物被膜耐受机制的重点目标菌株。
a-VPC29生物被膜动态形成能力;b-VPC29生物被膜细胞活力;c-VPC44生物被膜动态形成能力;d-VPC44生物被膜细胞活力;e-VPC94生物被膜动态形成能力;f-VPC94生物被膜细胞活力
图2 不同浓度胆盐胁迫下副溶血性弧菌临床菌株生物被膜的动态形成能力、细菌细胞活力
Fig.2 Dynamic biofilm formation ability and bacterial cell viability of clinical strains of V.parahaemolyticus under different concentrations of bile salt stress
a-环境菌株;b-临床菌株
图3 不同浓度的胆盐胁迫下副溶血性弧菌的最大生物被膜量比较
Fig.3 Comparison of the maximum biofilm mass of V.parahaemolyticus under bile salt stress at different concentrations
2.4 不同浓度的胆盐胁迫下副溶血性弧环境菌株生物被膜结构的分析
环境株VPE9生物被膜的结构见图4。对比同一时间节点(图4-a)的显微图像可知,VPE9在纯培养体系中的生物被膜形成状态最佳;伴随胆盐浓度的不断升高,其被膜空间结构由高度致密逐渐演变为松散、稀疏,这与前述结晶紫定量分析结果高度契合。具体而言,0.03%的低浓度胆盐处理组与纯培养组在被膜结构上无实质性差异;但当浓度增至0.20%时,生物被膜的形成量出现显著降低。该显微证据直观地验证了前期结论:高浓度胆盐对副溶血性弧菌的生物被膜形成过程具备强烈的抑制作用,而低浓度的抑制效应则相对微弱。观测单一浓度不同处理时间的动态特征发现:在培养初期(24 h),生物被膜形成水平普遍偏低,但纯培养组的生物量多于处理组;48 h时,纯培养条件下的VPE9被膜发育成熟密度极大;然而,当培养时间延长至72 h,所有测试组的生物被膜形成量均急剧减少,其微观结构甚至比24 h的初始阶段更为稀疏。这一现象可能是由于培养后期体系内营养耗竭,加之长时间的胆盐胁迫,最终导致了生物被膜基质的解离与细胞的大量脱落。在0.20%的胆盐胁迫下,24～72 h的整个监测周期内VPE9的被膜形态几乎未发生实质性变化,被膜形态稀疏,生物膜生长受抑,这进一步验证了高浓度胆盐对成膜行为的阻滞作用。综上所述,通过CLSM的定性观测与结晶紫的定量互证,本研究揭示了环境分离株在不同梯度胆盐胁迫下生物被膜形成动力学的时间异质性。
a-生物被膜的形态;b-生物被膜的生物体积;c-生物被膜的厚度;d-生物被膜的粗糙度
图4 通过CLSM(×400倍)分析胆盐胁迫下副溶血性弧菌环境菌株VPE9生物被膜的形成情况
Fig.4 Analysis of biofilm formation of environmental V.parahaemolyticus strain VPE9 under bile salt stress by CLSM(×400)
注:相同培养环境条件不同字母表明具有显著性差异(P<0.05),下同。
通过ISA-2软件的三维图像定量分析,进一步确证了副溶血性弧菌在胆盐处理下生物被膜形成的异质性。如图4-b所示,在培养初期(24 h),所有实验组的被膜体积均处于较低水平。48 h时,纯培养组的被膜体积大幅跃升至6.5×104 μm3;而在 0.03%、0.10% 和 0.20% 的胆盐胁迫下,该生物被膜体积分别锐减至2.3×104、2.9×103μm3、1.2×103μm3。结果显示,生物被膜量与胆盐浓度呈显著的剂量依赖性负相关。随着实验组胆盐浓度的不断升高,VPE9的被膜平均厚度发生显著衰减(图4-c),而粗糙度则呈现进行性上升(图4-d)。当胆盐浓度为0.20%时,被膜厚度最低,糙度指标最高,这标志着被膜三维空间的严重受损与高度碎裂化。综上,0.20%的高浓度胆盐对VPE9的生物被膜形成具有强烈的抑制作用。
2.5 不同浓度的胆盐胁迫下副溶血性弧临床菌株生物被膜结构的分析
为深入探究胆盐环境下副溶血性弧菌生物被膜形成的异质性,采用CLSM对临床分离株VPC94的被膜动态发育过程进行了定性与定量表征(图5)。
如图5-a所示,伴随胆盐浓度的递增,生物被膜的空间构型由致密逐渐转为松散与稀疏,这与环境菌株生物被膜形成规律类似(图4-a)。特别是当胆盐浓度升至0.20%时,VPC94的荧光信号近乎消失,直观地证实了高浓度胆盐对生物被膜形成的强效抑制作用。不同浓度胆盐胁迫组中,VPC94达到最大成膜致密度的时间各不相同。该现象与结晶紫染色所揭示的规律吻合,再次凸显了胆盐胁迫下该菌生物被膜形成动力学特征的时间异质性。此外,利用ISA-2软件提取的被膜三维定量参数(图5-b),发现在0.20%的高浓度胁迫下,VPC94生物被膜体积始终处于极低水平,进一步量化了高浓度胆盐的抑制作用。48 h时,纯培养组的被膜体积高达2.9×104 μm3;而在0.03%、0.10% 和0.20%的胆盐处理下,该被膜体积分别降至1.4×104、1.3×103、1.6×103 μm3,生物被膜体积随胆盐浓度升高而递减。结合图5-c与5-d可知,随胁迫加剧,厚度持续减少而粗糙度不断升高。与环境株VPE9的响应模式相似,当胆盐浓度达到0.20%的临界值时,VPC94的被膜体积与厚度均最低,粗糙度则最高。将临床株VPC94与环境株VPE9进行对比发现,在纯培养体系48 h 时,环境菌株的被膜结构较临床菌株更为紧密,相关生长参数也支撑了这一结果。这也证明了菌株的来源是影响其生物被膜形成的重要因素。
a-生物被膜的形态;b-生物被膜的生物体积;c-生物被膜的厚度;d-生物被膜的粗糙度
图5 通过CLSM(×400倍)分析胆盐胁迫下副溶血性弧菌临床菌株VPC94生物被膜的形成情况
Fig.5 Analysis of biofilm formation of clinical V.parahaemolyticus strain VPC94 under bile salt stress by CLSM(×400)
3 讨论与分析
本研究通过对胆盐胁迫下不同来源的副溶血性弧菌生物被膜形成的异质性进行研究,以结晶紫染色法与CCK-8法作为间接定量手段,分别从生物被膜量与被膜内细胞活力宏观证明了胆盐对副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制效应。在此基础上,CLSM结合原位荧光标记,直观揭示了胆盐胁迫导致生物被膜结构由致密变得松散、稀疏的微观形态学解离过程。此外,微观定量参数(被膜体积、厚度与粗糙度),进一步印证了结晶紫定量的结果,证明了胆盐对副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制效应。
细菌为应对外界胁迫,常自发构建具有三维空间构型的生物被膜。该防御体系主要由菌体及其分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)构成。其中,以胞外蛋白、多糖及环境DNA为核心组分的EPS占据了被膜总质量的90%以上,是保障细菌稳态定植与抵御环境压力的关键物理屏障,其形成情况受多重环境因子的调控[18]。先前研究指出,胆盐干预可有效遏制副溶血性弧菌混合菌株生物被膜的构建,扰乱被膜系统的空间聚集度,并在破坏结构完整性的同时阻滞胞外多糖与蛋白的合成途径[17]。KUMAR等[19]的体外定量试验证实,牛磺胆酸盐对副溶血性弧菌成膜的抑制效应呈显著的剂量依赖性。与谷鑫等[11]的结果相契合,本研究亦确认了胆盐对成膜过程的强烈阻滞作用。探究其机制,胆盐可能通过修饰细菌表面电荷分布与疏水特性,削弱了游离菌体对非生物表面或宿主细胞的初始黏附效能[20]。此外,环境压力会对生物被膜形成的时间产生影响,俞文英等[21]观察到冷激胁迫会改变副溶血性弧菌达到生物被膜形成最大量的时间。本研究中,胆盐胁迫同样导致了生物被膜形成最大量时间的显著延迟。这一现象表明,外界环境的胁迫使副溶血性弧菌生物被膜形成时间产生差异,研究结果能够为水产品的加工和贮藏提供借鉴。
在菌株遗传背景方面,tdh与trh(TDH相关溶血素)作为副溶血性弧菌最核心的两大毒力基因,其在介导环境耐受中的作用备受关注。刘冰宣[22]与王扬眉[11]的研究均表明,携带特定毒力基因簇(如tlh+/tdh+/trh-)的菌株在复杂生存环境(如模拟胃液)中展现出更强的生存适应性与生长变异度。本研究使用的菌株主要呈现为tdh阳性而trh阴性的菌株特征,因此重点考察了tdh基因对生物被膜形成的影响。结果表明,携带tdh基因的分离株在胆盐胁迫下维持了较高的生物被膜形成能力。表明即便在缺乏trh基因协同的情况下,tdh这一关键基因的存在也可以带给菌株更强的环境响应能力,进而增加了食品加工环境中该类致病菌的清除难度。当然,trh基因及其与tdh的共同表达在介导生物被膜形成及肠道胆盐耐受中的具体作用机制,仍需深入研究。
高璐等[23]提出副溶血性弧菌倾向于通过强化生物被膜形成能力来抵御极端逆境,与本研究结果不一致。这可能归因于胆盐特异性胁迫机制与其他常规理化压力的本质差异。SANCHEZ等[24]研究发现,牛磺鹅去氧胆酸盐削弱了霍乱弧菌的成膜能力,并促进生物被膜解离;BIA
UCHA等[25]的研究证实,3%浓度的胆汁能显著抑制肠沙门氏菌的成膜行为,这些结论与本实验高度一致,即作为胆汁核心成分的胆盐,对肠道致病菌的生物被膜形成有抑制作用。本研究进一步明确了不同来源副溶血性弧菌在不同浓度胆盐胁迫下,生物被膜形成与最大量形成时间存在异质性,且在0.20%的胆盐胁迫下,副溶血性弧菌几乎不形成生物被膜。
目前为止,学者已研究了不同理化因子对副溶血性弧菌生物被膜形成的干预效果。例如,姜黄素介导的光动力灭活[26]及酸性电解水处理[27]均表现出优异的被膜破坏效果。在寡营养胁迫下,环境株的成膜能力通常优于临床株且具备更大变异性[28]。本研究在低浓度胆盐体系中观察到了与之类似的规律;然而,当胆盐浓度较高时,临床分离株则展现出超越环境株的生物被膜形成能力。推测这种现象可能源于临床菌株在宿主体内长期演化过程中,已演化出针对胆盐环境的特异性耐受机制,从而能够更高效地抵御高浓度胆盐胁迫。
4 结论
本研究综合运用结晶紫染色、CCK-8细胞活力测定及CLSM等技术手段,系统剖析了副溶血性弧菌在多梯度胆盐胁迫下生物被膜形成的异质性规律。研究表明,副溶血性弧菌菌株的来源会影响其生物被膜的形成;其中,携带tdh毒力基因的分离株展现出更敏锐的逆境响应机制与较强的胆盐耐受力,进而维持了相对较高的生物被膜形成量。整体而言,胆盐对副溶血性弧菌的生物被膜形成有明确抑制作用,且诱发了生物被膜量峰值到达时间的延后。在生长环境适应性方面,临床分离株在胆盐浓度较高时,生物被膜形成能力优于环境株;反之,在低浓度干预下,环境株的成膜优势则更为突出。值得关注的是,当胆盐浓度超过0.30%这一临界阈值时,副溶血性弧菌的成膜能力近乎丧失,充分证实了高浓度胆盐对生物被膜形成的抑制作用。尽管本研究已清晰界定了胆盐胁迫下副溶血性弧菌生物被膜形成的异质性,但自然中多重环境因子(如胆盐联合抗生素、重金属等)胁迫下副溶血性弧菌的响应机制仍亟待解析。本研究不仅为靶向清除与控制副溶血性弧菌生物被膜提供了新的思路,更可为水产品的微生物风险定量评估输出精准的理论支撑,对构筑和优化食源性致病菌的安全防线具有重要的应用价值。
[1] CHEN H H, DONG S L, YAN Y, et al.Prevalence and population analysis of Vibrio parahaemolyticus isolated from freshwater fish in Zhejiang Province, China[J].Foodborne Pathogens and Disease, 2021, 18(2):139-146.
[2] 赵伟.胆盐胁迫下副溶血性弧菌的异质性研究[D].上海:上海海洋大学,2022.
ZHAO W.Study on the heterogeneity of Vibrio parahaemolyticus under bile salt stress[D].Shanghai:Shanghai Ocean University, 2022.
[3] 檀利军, 胡钰梅, 陈博文, 等.姜黄素介导的光动力技术对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭效果[J].食品科学, 2022, 43(3):83-91.
TAN L J, HU Y M, CHEN B W, et al.Inactivation of curcumin-mediated photodynamic technology on Vibrio parahaemolyticus and Shewanella putrefaciens[J].Food Science, 2022, 43(3):83-91.
[4] SONG Z Y, ZHANG R, JI S Y, et al.The effect of bile salts stress on the biology and transcriptome characteristics of Vibrio parahaemolyticus under low salt environment[J].Archives of Microbiology, 2026, 208(4):196.
[5] YANG Y, ZHOU Y, CHEN L, et al.Combining bile salt with gentamicin:A promising strategy against Vibrio parahaemolyticus and Escherichia coli[J].Current Microbiology, 2025, 83(1):74.
[6] KELLY S M, LANIGAN N, O’NEILL I J, et al.Bifidobacterial biofilm formation is a multifactorial adaptive phenomenon in response to bile exposure[J].Scientific Reports, 2020, 10:11598.
[7] LOPES A A, VENDRELL-FERN
NDEZ S, DESCHAMPS J, et al.Bile-induced biofilm formation in Bacteroides thetaiotaomicron requires magnesium efflux by an RND pump[J].mBio, 2024, 15(5):e03488-e03423.
[8] 管健,王玉桂,丁昊,等.胆汁酸对肠道微生态的调控研究进展[J].科学通报,2026,71(16):3625-3633.
GUAN J, WANG Y, DING H, et al.Researchprogress on the regulation of intestinal microecology by bile acids[J] Chinese Science Bulletin,2026,71(16):3625-3633.
[9] ZHOU Y, GU X, JI S Y, et al.Antibiofilm mechanism of mouse gastrointestinal stimulation against Vibrio parahaemolyticus under bile salt culture[J].Microbial Pathogenesis, 2025, 200:107339.
[10] 张布克, 史俊, 潘迎捷, 等.不同寡营养条件下副溶血性弧菌的生长异质性[J].食品科学, 2021, 42(14):54-61.
ZHANG B K, SHI J, PAN Y J, et al.Growth heterogeneity of Vibrio parahaemolyticus under different oligotrophic conditions[J].Food Science, 2021, 42(14):54-61.
[11] 王扬眉.人工模拟胃液下副溶血性弧菌的生长异质性研究[D].上海:上海海洋大学,2020.
WANG Y M.Heterogeneity of Vibrio parahaemolyticus under artificial gastric fluids[D].Shanghai:Shanghai Ocean University, 2020.
[12] KUMAR R, NG T H, CHANG C C, et al.Bile acid and bile acid transporters are involved in the pathogenesis of acute hepatopancreatic necrosis disease in white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Cellular Microbiology, 2020, 22(1):e13127.
[13] TAN L J, LI H H, CHEN B W, et al.Dual-species biofilms formation of Vibrio parahaemolyticus and Shewanella putrefaciens and their tolerance to photodynamic inactivation[J].Food Control, 2021, 125:107983.
[14] LI L, LU B B, FAN Q K, et al.Synthesis and self-assembly behavior of pH-responsive star-shaped POSS-(PCL-P(DMAEMA-co-PEGMA)) 16 inorganic/organic hybrid block copolymer for the controlled intracellular delivery of doxorubicin[J].RSC Advances, 2016, 6(66):61630-61640.
[15] SONG X Y, MA Y J, FU J J, et al.Effect of temperature on pathogenic and non-pathogenic Vibrio parahaemolyticus biofilm formation[J].Food Control, 2017, 73:485-491.
[16] HAMAMOTO A, BANDOU C, NAKANO M, et al.Differences in stress response after UVC or UVA irradiation in Vibrio parahaemolyticus[J].Environmental Microbiology Reports, 2010, 2(5):660-666.
[17] 谷鑫, 潘迎捷, 赵勇, 等.胆盐胁迫下不同毒力基因型副溶血性弧菌混合生物被膜异质性[J].上海海洋大学学报, 2025, 34(3):674-685.
GU X, PAN Y J, ZHAO Y, et al.Study on the heterogeneity of mixed biofilms of Vibrio parahaemolyticus with different virulence genotypes under bile salts stress[J].Journal of Shanghai Ocean University, 2025, 34(3):674-685.
[18] 江春铃. 不同毒力基因型副溶血性弧菌混合生物被膜的研究[D].上海:上海海洋大学, 2023.
JIANG C L.Research of mixed biofilms of Vibrio parahaemolyticus of different virulence genotypes[D].Shanghai:Shanghai Ocean University, 2023.
[19] KUMAR R, TUNG T C, NG T H, et al.Metabolic alterations in shrimp stomach during acute hepatopancreatic necrosis disease and effects of taurocholate on Vibrio parahaemolyticus[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:631468.
[20] 高艳, 逄波, 阚飙.霍乱弧菌对肠道中胆盐胁迫作用的反应调节[J].疾病监测, 2011, 26(6):484-487.
GAO Y, PANG B, KAN B.Response and regulation of Vibrio cholerae to bile stress in intestinal tract[J].Disease Surveillance, 2011, 26(6):484-487.
[21] 俞文英, 韩乔, 宋雪迎, 等.冷激条件下预形成副溶血性弧菌生物被膜的发展变化[J].微生物学报, 2020, 60(1):36-48.
YU W Y, HAN Q, SONG X Y, et al.Fate of pre-formed Vibrio parahaemolyticus biofilm under cold shock[J].Acta Microbiologica Sinica, 2020, 60(1):36-48.
[22] 刘冰宣.水产品中副溶血性弧菌生长异质性的研究[D].上海:上海海洋大学,2017.
LIU B X.On the study of the growth variability of Vibrio parahaemolyticus in aquatic product[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2017.
[23] 高璐, 欧阳敏, 张辉, 等.胁迫生长条件下副溶血性弧菌的生物特性分析[J].食品科学, 2018, 39(6):177-182.
GAO L, OUYANG M, ZHANG H, et al.Biological characteristics of Vibrio parahaemolyticus during growth in adverse environment[J].Food Science, 2018, 39(6):177-182.
[24] SANCHEZ L M, CHENG A T, WARNER C J A, et al.Biofilm formation and detachment in Gram-negative pathogens is modulated by select bile acids[J].Plos One, 2016, 11(3):e0149603.
[25] BIA
UCHA A, GOSPODAREK-KOMKOWSKA E, KWIECI
SKA-PIR
G J, et al.Influence of selected factors on biofilm formation by Salmonella enterica strains[J].Microorganisms, 2020, 9(1):43.
[26] 唐杰峰, 陈博文, 陈璐, 等.姜黄素介导的光动力技术对牡蛎汁中副溶血性弧菌生物被膜的清除[J].食品与发酵工业, 2024, 50(17):31-38.
TANG J F, CHEN B W, CHEN L, et al.Inactivation effects of curcumin-mediated photodynamic technology on Vibrio parahaemolyticus biofilm formed in oyster juice[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(17):31-38.
[27] LI Y F, TAN L, GUO L X, et al.Acidic electrolyzed water more effectively breaks down mature Vibrio parahaemolyticus biofilm than DNase I[J].Food Control, 2020, 117:107312.
[28] 史俊, 胡钰梅, 杜明, 等.不同寡营养条件下副溶血性弧菌的异质性比较[J].生物加工过程, 2023, 21(3):334-345.
SHI J, HU Y M, DU M, et al.Comparison of heterogeneity of Vibrio parahaemolyticus under different oligotrophic conditions[J].Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2023, 21(3):334-345.