谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种非致病性革兰氏阳性菌,已被美国食品药品监督管理局认定为安全菌株(generally recognized as safe, GRAS)[1-2]。该菌株对渗透压及多种化学物质(包括代谢产物)具有高耐受性且有生长速率快、碳源利用谱广等突出优势[3-5],因此被广泛应用于氨基酸、有机酸及植物天然产物等产品的生物制造[6-8]。

谷氨酸棒杆菌是谷氨酸的天然生产菌株[9],其中生物素亚适量型和温度敏感型已实现谷氨酸的工业化生产应用。采用生物素亚适量型菌株生产谷氨酸时,需精准控制培养基中生物素的添加量:生物素不足会导致菌体生长与代谢异常,而生物素过量则会影响谷氨酸的胞外分泌[10]。相比之下,温度敏感型(以下简称温敏型)的菌株可在生物素过量条件下发酵,通过调控培养温度即可有效控制菌体生长及谷氨酸的合成与分泌过程,谷氨酸产量高且生产稳定性更好,已成为当前谷氨酸工业化生产的主要菌种[11]。

自1958年谷氨酸在日本首次实现商业化生产以来,降低其工业化生产成本始终面临挑战。其中,利用农业废弃物或副产物替代传统碳源、氮源是重要的研究方向。JYOTHI等[12]、AMIN等[13]分别尝试以木薯淀粉、甘蔗渣作为碳源生产谷氨酸。陈晓妮等[14]、刘立锋[15]则分别探索了以玉米浆、豆粕水解液作为氮源的生产工艺,并已实现谷氨酸工业化生产应用。

尽管玉米浆与豆粕水解液的应用降低了原料成本,但也导致新问题的产生:由于谷氨酸发酵种子罐接种量低(0.08%～0.1%),玉米浆中含有的大量芽孢增加了种子罐染菌风险,同时豆粕水解液、玉米浆中存在的批次间稳定性会直接影响种子质量。这些新问题会导致谷氨酸减产或因种子染菌导致发酵失败,从而增加工业化生产成本。酵母浸粉是以纯培养的酵母为原料加工而成的有机氮源,具有营养丰富均衡、质量稳定等优点,已广泛用于氨基酸的工业化生产[16],但目前尚未见其应用于谷氨酸发酵的报道。本研究旨在探讨酵母浸粉替代豆粕水解液或玉米浆作为温敏型谷氨酸棒杆菌种子罐培养基氮源的可行性。本研究旨在通过识别影响温敏型谷氨酸棒杆菌生长的关键营养组分,实现酵母浸粉在谷氨酸发酵种子罐中的低浓度添加应用以解决经济性问题,同时提高谷氨酸发酵种子质量和生产稳定性。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

1.1.1 菌种

温度敏感型谷氨酸棒杆菌,菌种编号GTS190,安琪酵母股份有限公司菌种室保藏。

1.1.2 培养基

活化固体培养基(g/L):葡萄糖5, 酵母浸粉15,生物素10 μg /L,KH2PO4 1,尿素 3,琥珀酸0.5,琼脂粉20。灭菌前pH值调至7.0,121 ℃灭菌20 min。

液体培养基(g/L):葡萄糖40,酵母浸粉2,KH2PO4 4,MgSO4 2,FeSO4 0.015,MnSO4 0.015,琥珀酸1,生物素0.001。灭菌前pH值调至7.0,121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器设备与试剂

T&J-Intelli-Ferm Q 5 L×6型平行生物反应器,迪必尔生物工程有限公司;FP-1100C型高通量微生物生长曲线分析系统,杰灵仪器制造(天津)有限公司;Sp-750型分光光度计,上海比郎仪器有限公司;SW-CJ-1C型双人单面超净工作台,苏州净化设备有限公司;1290型高效液相色谱,美国安捷伦科技公司。

酵母浸粉系列、玉米浆,安琪酵母股份有限公司;豆粕水解液,山东阳成生物科技有限公司;KH2PO4及其他无机盐,国药集团。

1.3 实验方法

1.3.1 种子液制备

菌种在试管斜面活化培养24 h后,使用接种环刮取一环,转接至摇瓶液体培养基,500 mL摇瓶装液量70 mL,200 r/min、32 ℃培养至OD562值达到12.5。

1.3.2 高通量微生物生长曲线分析系统培养

灭完菌的液体培养基,在超净工作台中使用移液枪吸取500 μL到蜂窝板中,接种种子液5 μL,设置温度32 ℃,转速800 r/min,波长562 nm,每30 min检测1次OD值。每组测试方案点3个孔,生长曲线取平均值。

1.3.3 发酵罐培养

5 L发酵罐装2.5 L液体培养基,接种种子液2 mL。培养温度32 ℃,培养过程中流加碱液维持pH 值为7.0,初始通气2 L/min,转速300 r/min,设置溶氧值30% 串联转速,压强0.02 MPa,定时取样测定离线pH,OD562值,并留样用于铵根、肽、氨基酸的检测。

1.3.4 检测与分析方法

采用培养基消耗分析技术研究谷氨酸棒杆菌培养过程中不同来源氮的消耗率,不同来源氮包括NH4+、氨基酸、不同分子质量肽。由于部分营养组分可能消耗量低,消耗率使用各营养组分的质量而非质量分数来计算,以减少培养过程中水分蒸发造成的误差。培养基中铵根、氨基酸的质量分数均采用国标方法测定,有机氮的质量为总氮质量与铵根氮、谷氨酸质量的差值,不同分子质量肽的质量是基于有机氮质量与不同分子质量肽相对分布百分比的乘积计算而来。具体参数检测和计算方法如下:

培养基中铵根氮质量计算如公式(1)所示:

mH/g=cH×F1×M

(1)

式中:mH,铵根氮质量,g;cH,铵根的质量分数,g/kg,参照GB/T 5009.234—2016《食品安全国家标准 食品中铵盐的测定》中的方法进行检测;F1,铵根中氮质量分数,取值77.78%;M,发酵液质量,kg,不同取样点发酵罐称量系统实时显示的质量。

培养基中有机氮质量计算如公式(2)所示:

mY/g=(cN-cG×F2)×M-mH

(2)

式中:mY,有机氮质量,g;cN,总氮的质量分数,g/kg,参照GB/T 5009.5—2025《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的方法进行检测;cG, 谷氨酸的质量分数,g/kg,参照GB/T 5009.124—2016《食品安全标准 食品中氨基酸的测定》中的方法进行检测;F2,谷氨酸中氮的质量分数,取值9.51%。

培养基中不同分子质量肽的质量按公式(3)计算:

mPP/g=X×F3×mY

(3)

式中:mPP,不同分子质量肽的质量,g;X,不同分子质量肽的相对分布,%,检测方法参考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中附录A;F3, 氮折算为蛋白质的系数,取值为6.25。

培养基中游离氨基酸的质量按公式(4)计算:

mA/g=CA×M

(4)

式中:mA,游离氨基酸质量,g;CA, 游离氨基酸质量分数,参照GB/T 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》中的方法检测。

消耗率均按公式(5)计算:

(5)

式中:w,消耗率,%;m初始,不同来源氮在培养基中的初始质量,g;m放罐,不同来源氮在培养基中放罐时的质量,g。

OD值使用分光光度计检测。

1.4 数据统计与分析

所有试验均重复3次,实验数据采用Origin 9.0绘图及显著性分析(Turkey检验)。显著性分析结果采用字母分组法,标注有相同字母的为不显著,字母完全不同的为显著。P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对谷氨酸棒杆菌生长的影响

在5 L发酵罐上,使用玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902培养温敏型谷氨酸棒杆菌,添加量分别为40、40、5 g/L,培养过程中流加氨水维持pH值为(7.0±0.1)。从生长曲线上分析,0～17 h为迟滞期,17～22 h为对数生长期。3个测试组中,酵母浸粉FM902组生长速率最慢,其次为玉米浆组,豆粕水解液组生长速率最快(图1-a)。分析不同培养阶段的平均生长速率(图1-b),酵母浸粉FM902、玉米浆组在迟滞期和对数生长期差异均不显著,但均显著低于豆粕水解液组(P<0.05,下同)。实验结果表明,氮源对谷氨酸棒杆菌不同生长阶段生长速率的影响是一致的,后续研究的不再区分不同生长阶段。鉴于豆粕水解液作为氮源时温敏型谷氨酸棒杆菌的生长速率优于玉米浆,后续实验以40 g/L豆粕水解液为对照。

为了研究酵母浸粉FM902与豆粕水解液、玉米浆在营养组成上的差异,比较了3种氮源的肽分子质量分布数据,结果如表1所示。统计学分析表明:分子质量≤180 Da的二肽和氨基酸比例,玉米浆、酵母浸粉FM902均显著低于豆粕水解液;400～180 Da肽的比例,酵母浸粉FM902与豆粕水解液差异不大,显著高于玉米浆;1 000～400 Da、2 000～1 000 Da肽的比例,酵母浸粉FM902、玉米浆均显著高于豆粕水解液;分子质量≥2 000 Da 肽的比例,酵母浸粉FM902与豆粕水解液差异不大,均显著低于玉米浆。

2.2 培养基消耗分析

对比玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902培养温敏型谷氨酸棒杆菌的生长速率及肽分子质量分布数据可以推测,400～180 Da、≤180 Da的二肽和氨基酸在培养基中的浓度可能是关键性的影响因素。为了精确定量培养过程中NH4+的浓度的变化,在液体培养基的基础上额外添加2 g/L(NH4)2SO4溶液,同时培养过程中使用NaOH替代氨水调节pH值以排除流加氨水对NH4+消耗分析的干扰。

按照调整的工艺,玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902培养谷氨酸棒杆菌的生长曲线如图2所示:豆粕水解液组生长速率最快,其次为玉米浆组,酵母浸粉FM902组生长速率最慢。培养工艺调整前后生长曲线的趋势、不同实验组之间的对比结果是一致的。

培养基中铵根氮主要来源为(NH4)2SO4、氨水,有机氮主要为玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902中的氨基酸、多肽、蛋白质。分析培养基中有机氮的质量变化趋势与消耗率时,培养过程中大量合成的谷氨酸来源氮未计算,以更真实反映细胞对其他来源有机氮的利用偏好性。

培养基中铵根氮、有机氮的质量变化曲线如图3-a所示,各测试组中有机氮质量始终高于铵根氮,但有机氮的消耗速率明显低于铵根氮。玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902测试组铵根氮的消耗率分别为91.30%、87.52%、94.24%,有机氮的消耗率分别为37.65%、36.44%、31.72%,其中有机氮中分子质量≤180 Da肽的消耗率分别为14.64%、10.75%、12.88%;400～180 Da肽分别为56.10%、51.30%、51.82%;1 000～400 Da肽分别为52.22%、20.32%、58.80%;2 000～1 000 Da肽分别为33.39%、3.89%、52.83%;分子质量≥2 000 Da肽分别为24.28%、5.86%、29.69%(图3-b)。实验结果显示:不同测试组谷氨酸棒杆菌对铵根氮的利用率均是最高的,对400～180 Da肽利用率均超过50%;生长速率最快的豆粕水解液组,其他分子质量肽的消耗率均低于25%;生长速率最慢的酵母浸粉FM902组,1 000～400 Da、2 000～1 000 Da肽的消耗率>50%,与400～180 Da肽的消耗率差异不大。

分子质量≤180 Da的组分主要为游离氨基酸,进一步分析不同测试组培养基中游离氨基酸的质量消耗率(表2)。玉米浆组、豆粕水解液组、酵母浸粉FM902测试组总游离氨基酸的消耗率均为负值,消耗率为负值的氨基酸主要是谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸,玉米浆、豆粕水解液组的甘氨酸、丙氨酸消耗率也为负值。消耗率为负值的氨基酸均不是关键性的限制性氨基酸。值得注意的是,生长速率受到限制的玉米浆组大部分游离氨基酸的初始浓度是高于豆粕水解液组的,仅丝氨酸的消耗率均超过90%。而生长速率更慢的酵母浸粉FM902组消耗率超过90%的氨基酸还包括苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸。从氨基酸的消耗率数据推断,丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、组氨酸可能是影响温敏型谷氨酸棒杆菌生长速率的限制性氨基酸。

2.3 培养基中铵和400～180 Da肽浓度对生长的影响

不同测试组氨根氮的消耗率最高,进一步验证培养基中铵的浓度对温敏型谷氨酸棒杆菌生长的影响。实验组以5 g/L酵母浸粉FM902为有机氮源,分别额外添加0、2、5、10 g/L (NH4)2SO4,对照组添加5 g/L (NH4)2SO4不添加酵母浸粉FM902,培养过程均使用NaOH调节pH。结果显示(图4),相较于5 g/L酵母浸粉FM902,额外添加2、5 g/L (NH4)2SO4,菌体生长速率随着铵浓度的提高而加快,但(NH4)2SO4添加量提高到10 g/L时菌体基本不生长,而只添加5 g/L (NH4)2SO4的对照组菌体也不生长。实验结果表明,铵不是影响温敏型谷氨酸棒杆菌生长的决定性因素,但添加酵母浸粉的情况下,培养基中铵的浓度维持在一定水平有利于菌体生长速率的提高,过高的铵浓度抑制菌体生长。后续的实验,直接使用氨水调节pH,培养基中不再额外添加(NH4)2SO4。

小麦蛋白胨FP220中400～180 Da肽含量显著高于酵母浸粉FM902[17]。使用小麦蛋白胨FP220与酵母浸粉FM902按照不同批次搭配使用,验证提高培养基中400～180 Da肽的浓度对菌体生长的影响。对照组使用5.0 g/L酵母浸粉FM902,测试组分别使用1.0、1.5、2.0 g/L小麦蛋白胨FP220搭配4.0、3.5、3.0 g/L酵母浸粉FM902,均使用氨水调节pH。生长曲线对比结果如图5所示:相较于对照组,添加1.0、1.5、2.0 g/L小麦蛋白胨均能提高菌体的生长速率,但提升效果不明显。当单独添加5.0 g/L小麦蛋白胨FP220时,菌体基本不长。实验结果表明,400～180 Da肽不是温敏型谷氨酸棒杆菌生长速率的决定性因素。

2.4 培养基中氨基酸浓度对生长的影响

由2.2节中氨基酸的消耗分析结果可以推断,培养基中游离氨基酸的种类和浓度可能对谷氨酸棒杆菌的生长速率起着关键作用。在5 g/L酵母浸粉FM902的基础上,分别额外添加20种不同的氨基酸,添加质量浓度均为0.3 g/L,确保培养基中各氨基酸的浓度是富余的,使用高通量微生物生长曲线分析系统评估不同氨基酸对温敏型谷氨酸棒杆菌对生长的影响,结果如图6所示。胱氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、赖氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天门冬氨酸、异亮氨酸、谷氨酸对谷氨酸棒杆菌的生长具有明显的促进作用,其他氨基酸则有明显的抑制作用或促进作用不明显(结果未显示)。结合2.2节中酵母浸粉FM902测试组氨基酸消耗率数据,分析丝氨酸、异亮氨酸、组氨酸、胱氨酸可能是影响谷氨酸棒杆菌生长的限制性氨基酸。

在3.8 g/L酵母浸粉FM902的基础上,搭配添加丝氨酸、异亮氨酸、组氨酸、胱氨酸各0.3 g/L,维持总添加量5.0 g/L不变。对照组分别为5 g/L酵母浸粉FM902和40 g/L豆粕水解液。从生长曲线看(图7-a),酵母浸粉FM902搭配复合氨基酸后,生长速率明显加快,但仍较豆粕水解液慢。从平均生长速率对比结果看(图7-b),酵母浸粉FM902搭配添加氨基酸的测试组,与酵母浸粉FM902、豆粕水解液均存在显著性差异。实验结果表明,丝氨酸、异亮氨酸、组氨酸、胱氨酸显著影响温敏型谷氨酸棒杆菌的生长速率,是限制性营养组分。

2.5 酵母浸粉提高温敏型谷氨酸棒杆菌生长速率

酵母浸粉FM902搭配添加丝氨酸、异亮氨酸、组氨酸、胱氨酸后,温敏型谷氨酸棒杆菌的生长速率仍显著低于豆粕水解液组(图7-a)。可能原因是,除氨基酸外还存在其他限制性的营养组分,而酵母浸粉FM902缺乏这些限制性营养组分,或搭配添加氨基酸后这些营养组分在培养基中的浓度降低了。进一步对不同型号酵母浸粉进行筛选,游离氨基酸和水解氨基酸的统计学分析结果显示(表3):酵母浸粉FM308中丝氨酸、胱氨酸、组氨酸的含量均显著高于酵母浸粉FM902,异亮氨酸含量两者无显著性差异;在2.4节研究中,具有促进温敏型谷氨酸棒杆菌生长的天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸,在酵母浸粉FM308中的含量也显著高于酵母浸粉FM902;作为阴性对照,在酵母浸粉FM526中,上述这些关键性氨基酸的含量显著低于酵母浸粉FM902。需要说明的是,水解氨基酸是指酵母浸粉中以氨基酸或者肽形式存在的氨基酸总和。

使用5 g/L酵母浸粉FM902、酵母浸粉FM526、酵母浸粉FM308,2 g/L酵母浸粉FM308及40 g/L豆粕水解液分别培养温敏型谷氨酸棒杆菌,结果如图8-a所示。5 g/L酵母浸粉FM308测试组生长速率最快,其次是40 g/L豆粕水解液和2 g/L酵母浸粉FM308组,次之是5 g/L酵母浸粉FM902组,5 g/L酵母浸粉FM526组生长速率最慢。各实验组的平均生长速率统计学分析数据表明(图8-b),2 g/L酵母浸粉FM308与40 g/L豆粕水解液组不存在显著性差异,5 g/L酵母浸粉FM526组显著低于其他各实验组。实验结果表明,氨基酸是影响温敏型谷氨酸棒杆菌生长的限制性营养组分。酵母浸粉FM308更适合温敏型谷氨酸棒杆菌的种子培养,考虑在工业规模谷氨酸生产中的性价比,比较经济的添加量为2 g/L。

3 结论与讨论

本文为了探讨酵母浸粉替代豆粕水解液或玉米浆作为氮源用于谷氨酸种子培养的可行性,评估了不同来源氮对温敏型谷氨酸棒杆菌生长速率的影响,对关键的限制性营养组分进行了识别和验证,基于研究结果筛选得到了适合谷氨酸种子培养的酵母浸粉。

培养基营养组分消耗分析结果显示,使用玉米浆、豆粕水解液、酵母浸粉FM902培养温敏型谷氨酸棒杆菌时呈现相同的氮利用规律,即无机铵利用率最高,有机氮中400～180 Da肽的利用率高。进一步验证铵对谷氨酸棒杆菌生长的影响,以5 g/L(NH4)2SO4搭配5 g/L酵母浸粉FM902时培养基中的铵根氮的理论质量为2.65 g,远高于2.2节中豆粕水解液组初始铵根氮质量1.75 g,但菌体生长速率和生物量均远低于豆粕水解液组,说明铵不是限制性营养组分。使用不同浓度小麦蛋白胨FP220搭配酵母浸粉使用,验证培养基中400～180 Da肽浓度的影响,结果发现提高400～180 Da肽浓度有利于菌体生长速率的提高,但提高不明显,而单独添加5 g/L小麦蛋白胨FP220,菌体基本不生长。这与丁永志等[17]在解脂耶氏酵母培养研究中的结果类似,富含400～180 Da肽的蛋白胨只有与酵母浸粉搭配使用时,才能提高菌体生长速率,且蛋白胨的浓度需要控制在一定范围内。研究结果表明,400～180 Da肽浓度不是限制性营养组分。

培养基中游离氨基酸的利用率分析以及不同种类氨基酸的促生长实验结果表明,胱氨酸、丝氨酸、组氨酸、异亮氨酸是影响温敏型谷氨酸棒杆菌生长的关键氨基酸。这可能是由于温敏型谷氨酸棒杆菌从头合成这些氨基酸存在经济性不高的问题,偏好直接从培养基中吸收。KALETA等[18]在研究大肠杆菌时发现,合成半胱氨酸、异亮氨酸、组氨酸会消耗更多的ATP,合成代价高。推测温敏型谷氨酸棒杆菌可能与大肠杆菌类似,但目前未见相关研究的报道。值得注意的是,使用酵母浸粉FM902培养温敏型谷氨酸棒杆菌时,菌体对1 000～400、2 000～1 000 Da肽有更高的利用率,而进一步搭配小麦蛋白胨FP220提高400～180 Da肽的浓度,菌体生长速率有提高,可能的原因是菌体通过吸收肽来补充影响菌体生长速率的限制性氨基酸。

酵母浸粉FM902搭配丝氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸作为氮源时,谷氨酸棒杆菌的生长速率仍显著低于豆粕水解液,表明仍有其它关键性的营养组分未能识别。但通过筛选发现,酵母浸粉FM308中影响菌体生长速率的显著性氨基酸含量显著高于酵母浸粉FM902。培养测试结果显示,2 g/L酵母浸粉FM308即能达到40 g/L豆粕水解液相同的生长速率,从经济性上分析也具有应用可行性。这对于谷氨酸工业化生产解决种子质量波动和染菌问题从而提高生产稳定性具有重要的意义。

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Application of yeast extract in seed culture of temperature-sensitive Corynebacterium glutamicum

DING Yongzhi1,2*, LIU Denghui1,2,HU Yue1,2, LU Huifang1,2,WU Yexu1,2,LI Xin3*

1(Technical Center for National Enterprise,Angelyeast Co.Ltd., Yichang 443000, China)2(The Hubei Provincial Key Laboratory of Yeast Function, Yichang 443000, China)3(School of Life and Health Sciences, Hubei University of Tcchnology, Wuhan 430068, China)

ABSTRACT In industrial glutamic acid production, Corynebacterium glutamicum temperature-sensitive strains serve as the primary microbial hosts.Conventional nitrogen sources like soybean meal hydrolysate or corn steep liquor have been used during seed culture.However, inconsistent seed quality and frequent contamination often reduced production stability.This study evaluated the feasibility of replacing these nitrogen sources with yeast extract in the seed culture of temperature-sensitive C.glutamicum.Through spent medium analysis, the requirements for ammonium, peptides of varying molecular weights, and specific amino acids during bacterial growth were assessed.Different nitrogen sources were compared for their effects on growth rates.Key limiting nutrients were identified, leading to the selection of a suitable yeast extract.Results showed that serine, cystine, histidine, and isoleucine acted as limiting amino acids.Yeast extract FM308, rich in these amino acids, supported effective seed culture at an optimal concentration of 2 g/L.This approach shows significant potential for improving seed quality and reducing contamination in industrial glutamic acid fermentation.

Key words yeast extract;temperature-sensitive Corynebacterium glutamicum;amino acids;spent media analysis

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.044428

引用格式：丁永志,刘登辉,胡悦,等.酵母浸粉在温度敏感型谷氨酸棒杆菌种子培养中的应用研究[J].食品与发酵工业,2026,52(15):55-62.DING Yongzhi, LIU Denghui, HU Yue, et al.Application of yeast extract in seed culture of temperature-sensitive Corynebacterium glutamicum[J].Food and Fermentation Industries,2026,52(15):55-62.

第一作者：硕士,工程师(丁永志工程师和李欣讲师为共同通信作者,E-mail: dingyz@angelyeast.com;20131029@hbut.edu.cn)

基金项目：湖北省自然科学基金计划项目(2024AFD152)

收稿日期：2025-09-05 ,改回日期：2025-12-17