低聚糖通常是由2～10个单糖残基经糖苷键连接而成,相对分子质量一般为300～2 000 Da,聚合度(degree of polymerization, DP)为2～10的一类碳水化合物[1]。低聚糖具有多种生物活性,包括免疫调节、调节肠道菌群、抗炎、抗氧化和降低血糖等[2]。低聚糖在食品工业、医药及养殖业等多个领域具有潜在应用价值。例如,在婴儿奶粉中添加低聚半乳糖能提高其营养价值[3];低聚壳聚糖可作为药物递送系统,用于片剂、胶囊及凝胶等药物的生产[4];饲料中添加低聚果糖可显著提高家畜的日采食量和日增重[5]。
免疫调节潜能在低聚糖生物活性的研究中已被发掘,多数低聚糖不仅能直接激活免疫细胞从而增强机体免疫,还能通过调节免疫细胞减轻机体炎症。例如:低聚壳聚糖可通过调节mTOR信号传导、增强氧化磷酸化、抑制磷酸戊糖途径的激活等多种机制,改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞神经炎症[6]。海藻低聚糖可通过增强巨噬细胞活性和促进细胞因子分泌,发挥免疫调节功能,同时能减少促炎因子的产生,表现出显著抗炎活性[7]。此外,羧甲基低聚壳聚糖能通过增强巨噬细胞活力和吞噬能力及NO的释放调节巨噬细胞免疫功能[8]。
目前,低聚糖的提取方法主要包括酶解法、物理法和化学法。其中,物理法(如超声波法、辐射法等)具有副产物少、环境污染小、效率高等优点,但通常需结合其他方法才能实现对低聚糖的提取[9]。化学法(如酸/碱水解等)尽管效率高、适用性广,但其生产过程中存在破坏多糖结构、产生副产物、造成环境污染等问题。相对于物理法和化学法,酶解法因生产工艺简单、降解过程可控性高、条件温和、生产安全性高等优势,已成为了提取低聚糖的主流策略[10]。此外,多糖被酶降解后不仅能改变相对分子质量和物理化学性质,还能显著提高调节肠道微生物、抗肿瘤和抗氧化等生物活性[11]。例如,天麻多糖经α-淀粉酶酶解为低聚糖后,微观结构由网状变为片状,相对分子质量显著降低,DPPH和ABTS阳离子自由基清除能力显著升高[12]。树莓多糖经糖苷水解酶水解后,其鼠李糖和半乳糖醛酸含量显著提高,且其调节肠道微生物功能显著增强[13]。
树莓(Rubus idaeus L.)是兼具食用与药用价值的植物资源,富含糖类、维生素、矿物质及花青素等多种生物活性成分,具有免疫调节、抗疲劳、抗肿瘤、降血压、抗衰老等多种药理活性[14]。多糖是树莓中重要的生物活性物质之一,且已被系统研究,包括提取工艺、化学结构、生物活性及机理研究等[15]。例如,利用水提醇沉法提取的树莓多糖,分子质量为74.86 kDa,存在→3,6)-β-Galp(1→、→5)-α-Araf(1→)、α-Araf(1→和→3,6)-β-Galp(1→四种糖苷键连接方式,其能通过调节肠道微生物来改善高脂饮食喂养的小鼠肠道健康[16]。然而关于树莓低聚糖的结构及其活性的相关研究鲜有报道。因此,本文采用复合酶法从树莓中提取低聚糖,并对其结构进行初步表征,同时利用小鼠巨噬细胞RAW264.7评价其体外免疫调节活性,旨在为树莓低聚糖的进一步研究与开发利用提供理论基础与实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
树莓(储存条件-20 ℃),青海树莓农业产业化有限公司;纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶,山东隆科特酶制剂有限公司;DEAE-52纤维素柱填料、BCA蛋白含量测定试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;小鼠巨噬细胞RAW264.7,中国科学院细胞库;RAW264.7细胞专用培养基(含质量分数为10%胎牛血清)、RPMI-1640基础培养基(不含胎牛血清),武汉普诺赛生命科技有限公司;NO含量测定试剂盒,南京建成生物工程研究所有限公司;ELISA试剂盒(TNF-α、IL-6、IL-1β),武汉云克隆科技股份有限公司;CCK-8试剂,武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;Trizol试剂、PCR预混试剂(cDNA第一链合成及SuperReal彩色荧光定量),天根生化科技有限公司;相关引物,北京擎科生物技术股份有限公司合成;1×PBS、AB-8大孔吸附树脂,北京酷来博科技有限公司;乙酸酐、Na2SO4、异丙醇、盐酸、NaOH、NaCl,国药集团化学试剂有限公司;碘甲烷、二氯甲烷、二甲基亚砜、NaH,阿达玛斯试剂有限公司;三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),北京伊诺凯科技有限公司;LPS、硼氢化钠,Sigma-Aldrich贸易有限公司;色谱纯级乙酸、甲酸,赛默飞世尔科技有限公司;色谱纯级甲醇,德国默克公司;色谱纯级乙腈,美国天地公司;甲基化试剂盒、分析纯单糖标准品(葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、木糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸),扬州博睿糖生物技术有限公司;标准品普鲁兰(P5 99%、P10 99%、P20 99%、P50≥97%、P100≥99%、P200≥99%、P400≥99%、P800 98%),力森诺科科学仪器(上海)有限公司。
1.2 仪器与设备
Multiskan Sky High酶标仪,上海赛默飞世尔科技公司;BS-100H自动收集器,郑州南北仪器设备有限公司;FT-IR650傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)仪,天津港东科技发展股份有限公司;RID-20A示差检测器、LC-10A高效液相色谱仪,日本岛津公司;R-1001VN旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;UGC-24M氮吹仪,上海力辰仪器科技有限公司;UltiMate 3000高效凝胶渗透色谱仪、Velos LTQ-Orbitrap MS/MS、DionexUtimate 3000高效液相色谱系统、6890-5973气相质谱联用仪、ICS5000离子色谱仪,上海赛默飞世尔科技公司;Herocell 180 CO2培养箱,上海润度生物科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合酶法提取树莓粗多糖
参考张桂娟等[17]的多糖复合酶法提取工艺并稍作修改。具体如下:称取100 g树莓冻果,用破壁机粉碎制成果浆,按料液比1∶8(g∶mL)加入蒸馏水。复合酶液配制:m(纤维素酶)∶m(果胶酶)∶m(木瓜蛋白酶)=1∶1∶0.5,添加复合酶液,酶添加量为树莓果浆质量的1%。36 ℃酶解30 min后直接升温至90 ℃保持20 min以灭活酶。过滤并离心除去树莓果渣,按100 g/L的添加量向滤液中加入AB-8大孔吸附树脂并置于锥形瓶,恒温摇床36 ℃、200 r/min振荡吸附色素2 h,过滤离心,并将滤液浓缩,冷冻干燥,即为树莓粗多糖。
1.3.2 粗多糖的分离纯化
树莓粗多糖300 g(10 mg/mL)经DEAE-52纤维素柱(2.5 cm×20 cm×50 μm)分级纯化,使用300 mL蒸馏水以1 mL/min恒速冲洗,按8 mL/管收集馏分,采用苯酚-硫酸法测定各管糖含量后绘制洗脱曲线,合并馏分,浓缩并冻干,命名为ERP-1。采用苯酚-硫酸法测定ERP-1的多糖含量,使用BCA蛋白含量测定试剂盒测定ERP-1的蛋白质含量。
1.3.3 ERP-1的结构表征
1.3.3.1 ERP-1的分子质量测定
使用高效凝胶渗透色谱(high-performance gel permeation chromatography,HPGPC)法测定。称取标准品(普鲁兰多糖)及ERP-1各5 mg,涡旋溶解配制成5 mg/mL,12 000 r/min离心10 min,上清液经0.22 μm水系滤膜过滤后进行测定。色谱条件:流动相为0.05 mol/L NaCl溶液;色谱柱BRT105-103-101(0.8 cm×30 cm×5 μm);检测器为示差检测器RID-20A;流动相流速0.7 mL/min;恒定柱温40 ℃;单次进样体积25 μL。
1.3.3.2 ERP-1的DP测定
采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass,UPLC-MS/MS)对ERP-1的DP进行分析。称取ERP-1 5 mg置于玻璃安瓿瓶中,加入2 mL TFA(3 mol/L),充N2封管后于80 ℃水解2 h。冷却至室温,准确转移至离心管,N2吹干,加入5 mL超纯水涡旋复溶,12 000 r/min离心10 min,上清液经0.22 μm水系滤膜过滤后待测。色谱条件:色谱柱为BRT oligoC(150 mm×4.6 mm×5 μm);流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液,B为乙腈;梯度程序:0～30 min, 95%～70% A;30～35 min,70%～95% A;35～40 min, 95% A;流速0.3 mL/min;柱温30 ℃;进样体积10 μL。质谱条件为ESI-模式;喷雾电压3.8 kV;毛细管与辅助器加热器温度350 ℃;扫描模式Full MS-ddMS2;分辨率为Full MS 70 000,ddMS2 17 500;自动增益控制目标为Full MS 1×106,ddMS2 2×105;最大注入时间为Full MS 100 ms,ddMS2 50 ms;循环次数3次。
1.3.3.3 FT-IR
通过FT-IR分析ERP-1的官能团。取ERP-1样品2 mg,与200 mg干燥KBr研磨后压片;以KBr为空白对照,在4 000～500 cm-1波数范围内扫描并分析光谱特征。
1.3.3.4 ERP-1的单糖组成测定
使用离子色谱仪(ion chromatography,IC)测定ERP-1的单糖组成。精密称量11种单糖标准品(葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、木糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)和ERP-1各5 mg,加入3 mol/L TFA 2 mL,80 ℃水解2 h。N2吹干,加入5 mL ddH2O复溶,取100 μL以1∶9比例用去离子水稀释,12 000 r/min离心5 min,取上清液直接用于IC检测。色谱条件:Dionex CarbopacTM PA10柱(30 ℃);三元梯度(A:H2O,B:500 mmoL/L NaOH + 50 mmoL/L NaOAc,C:20 mmoL/L NaOH);流速1.0 mL/min;进样体积25 μL;检测器为电化学检测器。
1.3.3.5 ERP-1的甲基化测定
ERP-1经甲基化、水解、乙酰化[18]后经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对确定其连接方式。
取ERP-1(2～3 mg)加入二甲基亚砜,超声波助溶后依次加入甲基化试剂A、B液(NaOH-二甲基亚砜悬液与碘甲烷),30 ℃磁力搅拌60 min。加2 mL ddH2O终止甲基化反应,透析24 h,冻干。取2 mg冻干样与200 mg KBr压片,FT-IR扫描,无3 700～3 200 cm-1 —OH吸收峰即为甲基化完全。完全甲基化样品加1 mL TFA(2 mol/L),120 ℃水解90 min,N2吹干;加2 mL ddH2O溶解,60 mg硼氢化钠室温还原8 h,乙酸中和后,105 ℃烘箱彻底除水。加入1 mL乙酸酐于100 ℃乙酰化1 h,冷却后用10 mL超纯水终止乙酰化反应。产物以3 mL二氯甲烷萃取,蒸馏水洗涤4次,二氯甲烷层经Na2SO4干燥、浓缩至1 mL,0.22 μm有机滤膜过滤,进行GC-MS分析。GC-MS分色谱条件:色谱柱为HP-INNOWAX柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);起始温度140 ℃,以1 ℃/min线性升至230 ℃;进样口及检测器温度250 ℃;载气He流速1 mL/min。
1.3.4 糖组分ERP-1的体外免疫调节活性研究
1.3.4.1 细胞培养及药物配制
细胞培养:采用RAW264.7细胞专用培养基在37 ℃,体积分数为5%的CO2培养箱中培养。当细胞融合度为80%以上时,进行后续实验。
药物配制:向RPMI-1640基础培养基中分别添加ERP-1和LPS,使ERP-1终质量浓度为25、50、100和200 μg/mL,LPS终质量浓度为3 μg/mL。
1.3.4.2 组别设置及干预方式
(1)LPS诱导组:
将RAW264.7细胞专用培养基按1×104个/孔接种到96孔板内。设置为空白组、LPS组、LPS诱导+不同剂量ERP-1干预组,每组6个重复。培养24 h,弃去专用培养基,空白组加入100 μL RPMI-1640基础培养基,其余组加入100 μL 3 μg/mL的LPS,继续培养8 h,弃去除空白组和LPS组外各孔的培养液,分别加入100 μL 25、50、100、200 μg/mL ERP-1(后续结果用L+ERP-1质量浓度表示,如L+25),继续于培养24 h后检测各项指标。
(2)非LPS诱导组:
细胞接种方法同上,设置为空白组、LPS组、不同剂量ERP-1干预组,每组6个重复,CO2培养箱继续培养24 h,弃去培养液,空白组加入100 μL RPMI-1640基础培养基;LPS组加入100 μL 3 μg/mL LPS;ERP-1干预组分别加入100 μL 25、50、100、200 μg/mL ERP-1,继续培养24 h后检测各项指标。
1.3.4.3 细胞活力测定
按照CCK-8试剂操作说明书测定LPS诱导组和非LPS诱导组细胞存活率。
1.3.4.4 NO、IL-6、IL-1β和TNF-α的含量测定
收集细胞培养液,LPS诱导组和非LPS诱导组细胞培养液中NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量测定按照NO含量测定试剂盒和ELISA检测试剂盒说明书操作。
1.3.4.5 iNOS、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达量的测定
将RAW264.7细胞以6×105个/孔的接种量接种至6孔板中,培养条件及干预方式同1.3.4.2节,每组设置3个重复。RAW264.7细胞的总RNA经Trizol试剂提取后,将总RNA逆转录为cDNA(按照cDNA第一链合成预混试剂盒说明操作),进行实时荧光定量PCR扩增(按照SuperReal彩色荧光定量预混试剂盒说明操作),目的基因的相对表达量根据2-ΔΔCt相对定量法计算获得,引物序列见表1。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
目的基因引物序列GADPH-F5′-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3GADPH-R5′-TGCCTGCTTCACCACCTTC-3′TNF-α-F5′-GCCAGGAGGGAGAACAGAAACT-3′TNF-α-R5′-GGCCAGTGAGTGAAAGGGACA-3′IL-6-F5′-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3IL-6-R5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3IL-1β-F5′-GCCACCTTTTGACAGTGATGAG-3′IL-1β-R5′-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3iNOS-F5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3iNOS-R3′-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTG-5
1.4 数据统计与分析
采用GraphPad Prism 9.5软件处理数据,结果以“平均值±标准差”呈现;组间采用单因素方差分析(ANOVA)并采用Tukey法进行多重比较,显著性阈值为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 ERP-1洗脱曲线
树莓粗多糖在DEAE-52纤维素层析柱中经蒸馏水洗脱后,得到单一洗脱峰(图1),合并第22～29号管馏分,浓缩并冻干,即为ERP-1。ERP-1多糖含量为98.2%,蛋白含量为1.2%。
图1 树莓低聚糖洗脱曲线
Fig.1 Raspberry oligosaccharide elution curve
2.2 ERP-1的结构表征
2.2.1 ERP-1相对分子质量
图2显示ERP-1为单一对称峰(保留时间:44.892 min),表明ERP-1为相对分子质量均一的糖组分。根据标准曲线方程计算得ERP-1的重均分子质量(Mw)、数均分子质量(Mn)和峰位分子质量(Mp)分别为574、569、603 Da。
图2 ERP-1的HPGPC图
Fig.2 HPGPC spectrum of ERP-1
2.2.2 ERP-1 DP
如图3所示,ERP-1主要由DP为3～7的寡糖组成,表明其为低DP糖类化合物。DP定性情况见表2。
图3 ERP-1超高效液相色谱-串联质谱负离子模式色谱图
Fig.3 ERP-1 ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry negative ion mode chromatogram
表2 ERP-1的DP定性分析
Table 2 Qualitative analysis of the DP in ERP-1
化合物保留时间/min质荷比名称加和离子峰面积峰面积相对含量/%3Hex7.83503.18Dp3M-H82 149 631.318.074Hex8.44665.23Dp4M-H31 263 699.543.073Hex9.26503.18Dp3M-H107 492 650.110.564Hex10.46665.23Dp4M-H73 842 744.437.254Hex11.86665.23Dp4M-H50 504 390.144.963Hex12.54503.18Dp3M-H96 384 481.449.475Hex13.05827.29Dp5M-H13 993 856.471.376Hex14.23898.35Dp6M-H102 104 748.510.034Hex14.72665.23Dp4M-H76 446 760.787.515Hex15.40827.29Dp5M-H53 448 287.685.255Hex16.55827.29Dp5M-H57 795 200.795.684Hex17.35665.23Dp4M-H101 277 692.89.957Hex19.531151.41Dp7M-H58 331 091.815.73
2.2.3 ERP-1官能团
FT-IR图谱(图4)显示ERP-1具有典型糖类特征。位于3 600～3 200 cm-1波数范围内可观察到糖类的特征伸缩振动吸收峰[19]。 具体如下:3 372 cm-1处显示出典型的O—H伸缩振动吸收峰。2 938 cm-1与2 894 cm-1处检测到C—H的伸缩振动吸收峰。1 643 cm-1 处出现C
O伸缩振动信号[20]。1 417 cm-1处检测到的吸收峰则对应C—O的伸缩振动。CO的对称伸缩振动吸收峰在1 359 cm-1处。1 257 cm-1和1 195 cm-1的吸收峰为O—H变角振动。1 078 cm-1吸收峰表明存在C—O的伸缩振动[21]。
图4 ERP-1 FT-IR图
Fig.4 FT-IR spectrum of ERP-1
2.2.4 ERP-1单糖组成
如图5和表3所示,ERP-1由Glc、Fru、Man组成,物质的量比为0.582∶0.371∶0.048。其中,Glc和Fru占比较高,含量分别为344.19、219.44 μg/mL。
2.2.5 ERP-1糖苷链连接方式
如图6所示,ERP-1存在6种糖苷键连接方式特征吸收峰,根据保留时间分别为:Manf-(2→、Glcf-(2→、Glcp-(1→、Manp-(1→、→4)-Glcp-(1→和→6-Glcp-(1→。在乙酰化还原反应过程中,酮糖性质的Fru发生异构化现象,转化为Man与Glc两种单糖物质,进一步异构化为Glcp-(1→、Manp-(1→[22]。因此推断ERP-1存在5种单糖连接方式:Glc连接方式有Glcp-(1→、→4)-Glcp-(1→和→6-Glcp-(1→三种,物质的量比分别为0.161、0.660、0.041,Man和Fru的连接方式分别为Manp-(1→和Fruf-(2→,物质的量比分别为0.038、0.101。ERP-1的糖苷键连接方式详见表4。
a-混合单糖标准物;b-ERP-1
图5 单糖标准品和ERP-1离子色谱图
Fig.5 Ion chromatograpm of monosaccharide standards and ERP-1
表3 ERP-1单糖组成
Table 3 ERP-1 monosaccharide composition
单糖名称峰面积保留时间/min物质的量比含量/(μg/mL)葡萄糖180.38212.2670.582344.19甘露糖5.87413.2330.04823.55果糖28.98115.2920.371219.44
图6 ERP-1 GC-MS色谱图
Fig.6 GC-MS chromatogram of ERP-1
表4 ERP-1糖苷键连接方式分析
Table 4 Glycosidic linkage analysis of ERP-1
保留时间/min多糖甲基化糖醇乙酰酯质荷比(m/z)物质的量比链接方式24.9991,3,5,6-Me4-Manf/Glcf87,101,129,145,1610.101Fruf-(2→28.8222,3,4,6-Me4-Glcp43,71,87,101,117,129,143,161,2050.161Glcp-(1→30.3322,3,4,6-Me4-Manp43,71,87,101,117,129,145,161,2050.038Manp-(1→43.2492,3,6-Me3-Glcp43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,2330.660→4)-Glcp-(1→47.3582,3,4-Me3-Glcp43,87,99,101,117,129,161,189,2330.041→6-Glcp-(1→
2.3 糖组分ERP-1的体外免疫调节活性研究
2.3.1 ERP-1对RAW264.7细胞存活率的影响
LPS诱导组中(图7-a),经3 μg/mL 的LPS处理后,细胞存活率极显著升高。但经25、50、100和200 μg/mL ERP-1处理后,LPS诱导的RAW264.7细胞的存活率无显著影响(与LPS组相比)。在非LPS诱导组中(图7-b),经3 μg/mL LPS及25、50、100、200 μg/mL ERP-1处理后,细胞存活率均呈显著升高。
a-LPS诱导组细胞存活率;b-非LPS诱导组细胞存活率
图7 ERP-1对RAW264.7细胞存活率的影响
Fig.7 Effect of ERP-1 on the survival rate of RAW264.7 cells
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
2.3.2 ERP-1对RAW264.7细胞培养液中NO、IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响
如图8-a～图8-d所示,LPS诱导组中,经3 μg/mL LPS处理后,RAW264.7细胞培养液中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著升高(与空白组相比),但经25、50、100、200 μg/mL ERP-1处理后,LPS诱导的RAW264.7细胞培养液中NO的含量呈剂量依赖性降低(与LPS组相比)。除25 μg/mL ERP-1对LPS诱导的RAW264.7细胞培养液中IL-1β的含量没显著的影响外,其他浓度的ERP-1均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(与LPS组相比)。在非LPS诱导组中(图8-e～图8-h),经3 μg/mL LPS及25、50、100、200 μg/mL ERP-1处理后,RAW264.7细胞上清液中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高(与空白组相比),其中25、50、100、200 μg/mL ERP-1呈剂量依赖性显著升高RAW264.7细胞培养液中TNF-α的含量。
2.3.3 ERP-1对RAW264.7细胞中iNOS、IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA表达量的影响
如图9所示,LPS诱导组中,3 μg/mL LPS处理后,RAW264.7细胞中iNOS及IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达量显著上升(与空白组相比),但经25、50、100、200 μg/mL ERP-1处理后,上述基因表达量呈显著性降低(与LPS组相比),其中ERP-1剂量依赖性降低TNF-α mRNA的表达量。在非LPS诱导组中,经3 μg/mL LPS及25、50、100、200 μg/mL ERP-1处理后,RAW264.7细胞中NO及IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达量(与空白组相比)。
3 结论与讨论
低聚糖通常指DP为2～10,分子质量为300～2 000 Da的可溶性糖类,其主要由葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖6种最为常见的单糖组成[1]。例如,3种乳糖衍生低聚糖由葡萄糖和半乳糖组成,分子质量分别为666.18、990.26、1 314.43 Da,对应DP分别为4、6、8[23];发酵大豆中低聚糖DP为3～7,由木糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成[24]。本文利用复合酶法从树莓中获得糖组分ERP-1,分子质量为569 Da,DP为3～7,由葡萄糖、果糖和甘露糖组成,是一种典型的低聚糖。ERP-1由占比较高的→4)-Glcp-(1→构成,并存在少量Glcp-(1→、→6-Glcp-(1→、Manp-(1→和Fruf-(2→,该连接方式与文献报道的几种植物源性低聚糖相似,如:由甘露糖和葡萄糖以1,6糖苷键和1,4糖苷键主链构成的甘露低聚糖[25],由葡萄糖以1,4糖苷键主链连接而成的麦芽低聚糖[26],由1,4糖苷键主链连接葡萄糖胺组成的低聚壳聚糖等[27]。
a、b、c、d-LPS诱导组细胞培养液中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量;e、f、g、h-非LPS诱导组细胞培养液中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的含量
图8 ERP-1对RAW264.7细胞培养液中NO、IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响
Fig.8 The effect of ERP-1 on the contents of NO, IL-6, IL-1β, and TNF-α in RAW264.7 cell culture medium
a、b、c、d-LPS诱导组细胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达量;e、f、g、h-非LPS诱导组细胞中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达量
图9 ERP-1对RAW264.7细胞中NO、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达量的影响
Fig.9 Effect of ERP-1 on the mRNA expression levels of NO, IL-6, IL-1β,and TNF-α in RAW264.7 cells
巨噬细胞是先天免疫系统中最重要的免疫细胞之一,其激活被认为是免疫系统激活的关键步骤。研究表明,糖类可以刺激巨噬细胞中细胞因子NO、TNF-α、IL-16、IL-1β等的产生介导免疫反应[28]。NO是由免疫细胞(如巨噬细胞)产生的一种亲脂性自由基,能促进细胞活化并释放炎症因子。TNF-α是巨噬细胞在面对各种刺激反应时产生的主要炎症因子,能诱导其他炎症因子和免疫调节介质的表达[29]。IL-6作为巨噬细胞关键细胞因子,可诱导巨噬细胞进行增殖和分化,显著提高其免疫功能,并促进其他炎症因子的表达[30]。本研究利用小鼠巨噬细胞RAW264.7评估树莓低聚糖ERP-1的免疫调节潜能。结果显示ERP-1能分别显著降低和升高LPS诱导组和非LPS诱导组RAW264.7细胞中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β及相应mRNA表达量。ERP-1的上述免疫调节模式与已报道的多种活性低聚糖高度吻合。如:西番莲果实中3种异源半乳聚糖PFP2、PFP3和PFP4能以浓度依赖的方式促进RAW264.7巨噬细胞中NO、TNF-α和IL-6的生成,增强巨噬细胞免疫[31]。λ-卡拉低聚糖酶解低聚糖λ-COS-1和λ-COS-2能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、NO、TGF-β1、IL-10的分泌[32]。
糖类的生物活性与其化学结构密切相关,分子质量、DP、单糖组成及连接方式又决定其化学结构。研究表明通过降低糖类分子质量、能使糖类空间变松散从而暴露更多活性基团,有利于增强其抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗炎等生物活性[33]。如天麻多糖经α-淀粉酶水解后其分子质量从3.737×104 Da降至9.652×103 Da,抗氧化活性显著增强[12]。ERP-1分子质量仅为569 Da,这可能有利于ERP-1活性基团与RAW264.7细胞充分接触并发挥Glc、Man、Fru、Ara其生物活性。此外,单糖组成在糖类生物活性的发挥中起关键作用。Glc、Man、Fru、Ara等已被证明能与免疫细胞上对应的补体受体3和Toll样受体等结合,激活细胞免疫。很多天然植物糖类如甘草多糖等都由Glc、Man、Fru、Ara等组成,且具有明显的免疫调节活性[34]。ERP-1由Glc、Fru、Man组成,这可能是ERP-1具有免疫调节活性的重要因素。糖苷键连接方式是影响糖类化学结构进而影响其生物活性的必要因素。→4)-Glcp-(1→已被证实能够刺激小鼠巨噬细胞并诱导NO、TNF-α等细胞因子产生,增强巨噬细胞免疫活性。ERP-1主要由占比较高→4)-Glcp-(1→构成,该结构与此类活性糖链相似,这可能是ERP-1发挥免疫调节活性的重要原因之一[35]。如,番石榴低聚糖也具有与ERP-1类似的→4)-Glcp-(1→和→6-Glcp-(1→等连接方式,番石榴低聚糖能通过降低TNF-α、NO等炎症因子缓解铁死亡介导的RAW264.7细胞炎症反应[36]。目前关于DP与糖类活性之间关系的研究相对缺乏。由此推测,ERP-1可能是通过类似上述糖类中的糖苷键连接方式、单糖组成及分子质量之间的协同作用,具备与已知免疫活性糖类相似的结构特征及生物活性,合理推测其在调节免疫方面具有潜在优势。
综上,ERP-1是一种具有免疫调节活性的低聚糖,基于上述结构-功能关联及活性数据的支撑,ERP-1有望作为功能性食品原料或天然免疫调节剂进入食品及药用开发的后续研究阶段。
[1] CHEN Y J, SUI X, WANG Y, et al.Preparation, structural characterization, biological activity, and nutritional applications of oligosaccharides[J].Food Chemistry:X, 2024, 22:101289.
[2] ENDO A, HIRANO K, OSE R, et al.Impact of kestose supplementation on the healthy adult microbiota in in vitro fecal batch cultures[J].Anaerobe, 2020, 61:102076.
[3] DINLEYICI M, BARBIEUR J, DINLEYICI E C, et al.Functional effects of human milk oligosaccharides (HMOs)[J].Gut Microbes, 2023, 15(1):2186115.
[4] MORIN-CRINI N, LICHTFOUSE E, TORRI G, et al.Applications of chitosan in food, pharmaceuticals, medicine, cosmetics, agriculture, textiles, pulp and paper, biotechnology, and environmental chemistry[J].Environmental Chemistry Letters, 2019, 17(4):1667-1692.
[5] BIN LIM C, MUNIYAPPAN M, SANSHUI G, et al.PSIV-11 effects of dietary supplementation of Quillaja saponin or fructooligosaccharide and a mixture of both on the growth performance, nutrient digestibility, fecal microbial, and gas emissions in growing pigs[J].Journal of Animal Science, 2022, 100(Supplement_2):151.
[6] CHEN H L, CAI M Y, HE Y, et al.Chitosan oligosaccharide attenuates neuroinflammation by regulating microglial immunometabolic reprogramming via the mTOR signaling pathway[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025, 73(38):24076-24091.
[7] PRADHAN B, ROUT L, KI J S.Immunomodulatory and anti-inflammatory and anticancer activities of porphyran, a sulfated galactan[J].Carbohydrate Polymers, 2023, 301:120326.
[8] JIANG Z W, WANG S N, HOU J, et al.Effects of carboxymethyl chitosan oligosaccharide on regulating immunologic function and inhibiting tumor growth[J].Carbohydrate Polymers, 2020, 250:116994.
[9] 王婷.柑橘果胶低聚糖的酶法制备及生物活性研究[D].南京:南京林业大学, 2023.
WANG T.Enzymatic preparation and biological activity study of citrus pectin oligosaccharides[D].Nanjing:Nanjing Forestry University, 2023.
[10] 杨子祥, 李金梦, 宋琨燕, 等.海洋寡糖酶法制备研究进展[J].食品工业科技, 2023, 44(18):458-467.
YANG Z X, LI J M, SONG K Y, et al.Research progress on preparation of marine oligosaccharides by enzymatic method[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18):458-467.
[11] 冀晓龙, 郭建行, 田静源, 等.植物多糖降解方法及降解产物特性研究进展[J].轻工学报, 2023, 38(3):55-62.
JI X L, GUO J H, TIAN J Y, et al.Research progress on degradation methods and product properties of plant polysaccharides[J].Journal of Light Industry, 2023, 38(3):55-62.
[12] 胡云飞, 周德, 曾青兰, 等.天麻多糖酶解工艺优化、结构表征及其抗氧化活性分析[J].食品工业科技, 2025, 46(4):205-214.
HU Y F, ZHOU D, ZENG Q L, et al.Optimization of enzymatic hydrolysis process, structural characterization and antioxidant activity analysis of Gastrodia elata polysaccharide[J].Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(4):205-214.
[13] LUO Y, TANG R L, HUANG Y G.Differences in structure, antioxidant capacity and gut microbiota modulation of red raspberry pectic polysaccharides extracted by different methods[J].Food Research International, 2025, 211:116474.
[14] 李戈, 张烁.树莓果肉多糖提取工艺优化及其抗疲劳作用[J].食品研究与开发, 2023, 44(11):112-120.
LI G, ZHANG S.Extraction process optimization of raspberry (Rubus idaeus L.)pulp polysaccharide and anti-fatigue activity of the polysaccharide[J].Food Research and Development, 2023, 44(11):112-120.
[15] 陆杰, 杨永晶, 尹星星, 等.树莓多糖组分RPP-6的分离、结构表征及其体外免疫和抗氧化活性研究[J].西北农业学报, 2024, 33(3):477-489.
LU J, YANG Y J, YIN X X, et al.Isolation, structural characterization, immunoregulatory and antioxidant activity of raspberry polysaccharide RPP-6 in vitro[J].Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2024, 33(3):477-489.
[16] LUO H Q, YING N, ZHAO Q H, et al.A novel polysaccharide from Rubus chingii Hu unripe fruits:Extraction optimization, structural characterization and amelioration of colonic inflammation and oxidative stress[J].Food Chemistry, 2023, 421:136152.
[17] 张桂娟, 陈继凌, 陶荟竹.龙牙楤木多糖复合酶法提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品与机械, 2021, 37(8):185-192.
ZHANG G J, CHEN J L, TAO H Z.Optimization of polysaccharide extraction process from Aralia elata(Miq.) Seem by complex enzymes and the research of its antioxidant activity[J].Food &Machinery, 2021, 37(8):185-192.
[18] 尹星星, 杨永晶, 陆杰, 等.树莓多糖组分RPP-5的结构特征与免疫活性研究[J].食品与发酵工业, 2024, 50(9):139-147.
YIN X X, YANG Y J, LU J, et al.Structural characteristics and immunomodulatory activity of raspberry polysaccharide RPP-5[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(9):139-147.
[19] BU Y K, YIN B F, QIU Z C, et al.Structural characterization and antioxidant activities of polysaccharides extracted from Polygonati rhizoma pomace[J].Food Chemistry:X, 2024, 23:101778.
[20] KANG S N, YOU H J, LEE Y G, et al.Production, structural characterization, and in vitro assessment of the prebiotic potential of butyl-fructooligosaccharides[J].International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(2):445.
[21] BANDYOPADHYAY B, MANDAL V, MANDAL N C.Partial characterization of novel inulin-like prebiotic fructooligosaccharides of Sechium edule (Jacq.) Sw.(Cucurbitaceae) tuberous roots[J].Journal of Food Biochemistry, 2021, 45(6):e13764.
[22] 胡娜. 党参多糖/纳米硒复合物的制备及其体外抗肝癌作用研究[D].武汉:湖北中医药大学, 2023.
HU N.Preparation of codonopsis pilosula polysaccharide/ nano-selenium complex and its in vitro anti-liver cancer effect[D].Wuhan:Hubei University of Chinese Medicine, 2023.
[23] HU H Y, HU G G, ZHANG M, et al.Synthesis of novel lactose-derived oligosaccharides by two-step enzymatic reactions and structural characterization of the oligomers[J].Food Research International, 2025, 208:116177.
[24] SONG J, LEE H, PARK I, et al.Analysis of oligosaccharides in Korean fermented soybean products by the combination of mass spectrometry and gas chromatography[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2023, 71(1):760-769.
[25] LIAO J L, YAN B W, LAI C H, et al.The state-of-the-art preparation, purification and biological activities of mannan oligosaccharides[J].Industrial Crops and Products, 2025, 225:120594.
[26] PAN S H, DING N, REN J Y, et al.Maltooligosaccharide-forming amylase:Characteristics, preparation, and application[J].Biotechnology Advances, 2017, 35(5):619-632.
[27] BENCHAMAS G, HUANG G L, HUANG S Y, et al.Preparation and biological activities of chitosan oligosaccharides[J].Trends in Food Science &Technology, 2021, 107:38-44.
[28] SUN Y, ZHANG Z P, CHENG L, et al.Polysaccharides confer benefits in immune regulation and multiple sclerosis by interacting with gut microbiota[J].Food Research International, 2021, 149:110675.
[29] PAN Q T, SUN Y L, LI X Y, et al.Extraction, structural characterization, and antioxidant and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Notarchus leachii freeri eggs[J].Bioorganic Chemistry, 2021, 116:105275.
[30] LI L H, YU R, CAI T G, et al.Effects of immune cells and cytokines on inflammation and immunosuppression in the tumor microenvironment[J].International Immunopharmacology, 2020, 88:106939.
[31] SONG Y, WEN P, HAO H L, et al.Structural features of three hetero-galacturonans from Passiflora foetida fruits and their in vitro immunomodulatory effects[J].Polymers, 2020, 12(3):615.
[32] WANG Z Y, ZHANG A, CHEN L, et al.Preparation and anti-inflammation activity of λ-carrageenan oligosaccharides degraded by a novel λ-carrageenase Car3193[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 293:139282.
[33] KHEDMAT L, IZADI A, MOFID V, et al.Recent advances in extracting pectin by single and combined ultrasound techniques:A review of techno-functional and bioactive health-promoting aspects[J].Carbohydrate Polymers, 2020, 229:115474.
[34] 张彩璇, 淑英, 李杨, 等.多糖的精制及环磷酰胺减毒增效机制研究进展[J].食品科学, 2024, 45(7):322-331.
ZHANG C X, SHU Y, LI Y, et al.Research advances in the refining of polysaccharides and the mechanism for its effect on reducing the toxicity and enhancing the efficacy of cyclophosphamide[J].Food Science, 2024, 45(7):322-331.
[35] SHI L F, HAO G X, CHEN J, et al.Structural characterization and immunostimulatory activity of a water-soluble polysaccharide from abalone (Haliotis discus Hannai Ino) muscle[J].Food Science and Human Wellness, 2023, 12(2):495-502.
[36] KUANG W Y, WANG C N, XIA X W, et al.Structural characterization and anti-inflammatory effects of oligosaccharides in Psidium guajava Linn[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025, 73(20):12474-12487.