高温大曲作为酱香型白酒生产的糖化发酵剂,其发酵工艺研究近年来引起广泛关注[1]。高温大曲以小麦或大麦为原料,在自然发酵环境中,最高温度可达60～70 ℃,通过排潮、通风和温湿度调控等工艺,富集耐热微生物群落,形成丰富的菌系、酶系和风味物质前体[2]。高温大曲固态发酵涉及复杂的微生物代谢网络和环境交互,其工艺参数直接影响微生物群落演替和挥发性风味物质生成[3]。随着白酒产业对高品质、标准化产品需求的增加,大曲工艺优化成为研究热点,通过排潮、通风和温湿度控制等工艺,提升大曲品质稳定性和风味多样性。
高温大曲工艺的核心在于通过曲房环境调控微生物群落演替[4]。曲房依赖自然通风和人工经验调控,排潮不均和通风不足常导致发酵温度波动,进而影响微生物的代谢活性[5-6]。优化曲房通风可提高发酵温度的均匀性[3],显著增加功能微生物的丰度,从而提升淀粉和蛋白质的降解效率。这些工艺改进不仅稳定微生物群落结构,还间接促进挥发性风味物质的合成,如酯类和醇类,为白酒的复合香气奠定基础[7]。微生物群落动态是高温大曲工艺研究的核心,高通量测序技术进一步揭示,不同类型高温大曲(如白曲、黑曲、黄曲)的理化性质和微生物组成差异显著。温度和湿度变化导致微生物多样性和代谢物变异,影响酶活性,形成不同类型大曲[2, 8]。过程工艺对风味物质的形成也有重要影响,时空异质性分析表明,发酵堆积过程中的升温模式影响微生物群落和理化参数,大曲微生态的分化对大曲的风味特征产生影响[9],工艺优化通过调控微生物互作,改善大曲风味特征[10]。
高温大曲工艺研究已有相关报道,但针对排潮通风等工艺参数对理化、微生物和风味的系统性影响仍需深入探索。本研究以QF1和QF2为研究对象,结合高通量测序与HS-SPME-GC-MS技术,系统比较工艺优化对过程参数、微生物群落结构和挥发性风味物质的影响,旨在揭示排潮通风对大曲品质的调控机制,为白酒产业标准化发展提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高温大曲,贵州某酒业制曲车间改造曲房与原始曲房;3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、NaOH、无水葡萄糖、浓硫酸、乙酸、NaCl,上海国药集团化学试剂有限公司;FastDNATMSPIN Kit for Soil DNA Extraction 试剂盒,美国MP公司。
1.2 仪器与设备
FJT651-L温度传感器、FJC653-L环境传感器,武汉奋进智能机器有限公司;MPS2复合自动进样系统,德国Gerstel公司;7890B气相色谱、KT-2001冷喷调制器,美国Agilent Technologies公司;固相微萃取三相头,美国Sigma-Aldrich公司;NanoDrop 2000微量分光光度计, 赛默飞世尔科技中国公司。
1.3 实验方法
1.3.1 曲房改造
原始曲房门侧位置无开窗和孔洞,顶部天花板为不锈钢,排潮困难。为加强空气对流与排潮效果,按照图1方案进行曲房改造。开窗可增强空气对流,木制杉板替换掉不锈钢天花板,可减少水滴回落至曲堆,提高排潮效果。
a-正视图;b-俯视图
图1 曲房改造示意图
Fig.1 Diagram of fermentation room renovation
1.3.2 样品采集
大曲从入仓(0 d)至曲房发酵完成共40 d,分别在一翻(8 d)、二翻(16 d)和出仓(40 d)时进行样品采集,按照七点取样法取样(图2),样品保存在-80 ℃冰箱备用。
a-大曲生产流程;b-取样位点
图2 大曲生产流程与取样位点示意图
Fig.2 Schematic diagram of Daqu production process and sampling sites
1.3.3 理化参数检测
通过温度探针传感器全程监测取样点位置(图2)大曲发酵过程曲心温度,同时在曲房内部放置传感器监测曲房温度和湿度[11]。参考QB/T 4527—2011《酿酒大曲通用分析方法》检测大曲含水量、酸度、还原糖含量、淀粉含量。
1.3.4 挥发性风味物质检测
采用HS-SPME-GC-MS技术检测大曲发酵出仓样品挥发性风味物质。HS-SPME预处理与GC-MS条件参考王高伟等[12]的方法。
1.3.5 微生物群落测序与分析
采用FastDNATMSPIN Kit for Soil DNA Extraction 试剂盒提取微生物基因组 DNA,经1%琼脂糖凝胶电泳检测质量,使用微量分光光度计测定其浓度与纯度。添加梯度拷贝数标准品混合物至样本 DNA,细菌以 16S rRNA 基因 V3-V4 区引物、真菌以 ITS2 区引物进行高保真 PCR 扩增,引入 Index 标签后构建测序文库,经 Qubit 定量与纯化后,采用 Illumina NovaSeq6000平台进行 2×250 bp 双端测序(南京基序智谷生物科技有限公司)。原始数据经 QIIME2 软件过滤、降噪及去嵌合体后,以内参标准品的已知拷贝数为横坐标、其对应的测序序列数为纵坐标构建标准曲线,基于标准曲线计算扩增子序列变体(amplicon sequence variants,ASV)绝对拷贝数,通过 Mothur 软件结合 SILVA/UNITE 数据库进行分类鉴定。
1.4 数据处理
使用Excel和GraphPad prism软件进行数据分析和图片绘制。采用联川生物云平台绘制Mantel检验相关性网络热图。
2 结果与分析
2.1 不同结构曲房发酵过程温湿度变化
大曲温度变化是反映制曲发酵进程的核心指标[13]。入仓后大曲温度快速升高,与QF1相比,QF2大曲升温速率更快(图3-a)。发酵第7 d时到达顶温,QF2大曲顶温63.29 ℃,QF1大曲顶温60.18 ℃,曲房改造后大曲顶温提高5.17%,且高温持续时间增长。第0～7天,QF2平均变化速率5.85 ℃/d,标准差较低(平均2.85),温度上升更均匀;QF1平均变化速率5.25 ℃/d,标准差较高(4.57),波动更大。可能由于曲房改造后改善了通风效果,供氧充足,导致产热更高效。一次翻曲大曲温度短暂下降后再次升温,并均达到55 ℃以上,二者差异不明显。在9～15 d,QF2温度略低,表明改造优化了空气对流。第21天开始进入温度下降阶段,直至第40天大曲出仓,QF2出仓温度27.81 ℃,QF1出仓温度24.84 ℃,平稳下降可能减少有害菌生长,减少微生物污染风险[14]。
a-大曲温度;b-曲房温度;c-曲房湿度
图3 发酵过程大曲温度与曲房温湿度变化
Fig.3 Changes in Daqu temperature and fermentation room temperature and humidity during fermentation
曲房温度和湿度是大曲发酵的环境基础[4]。QF2整体温度平均29.50 ℃,略高于QF1曲房温度(28.30 ℃),平台阶段更高,下降阶段更稳定(图3-b)。第0～20天,QF1与QF2湿度基本一致(图3-c),20 d后,QF2湿度显著低于QF1,表明曲房通过改造后,提高了排潮效率,降低了过高湿度导致的霉变风险[15]。这可能是由于通风窗的对流效率提高,另外木质材料本身具有的吸湿与透气特性也有效缓冲了发酵顶层的水汽凝结,避免了不锈钢材质常见的冷凝水滴落现象。QF2通过优化热湿环境,为高温大曲优质发酵提供了更科学的环境支撑,为后续发酵过程中微生物群落的演替及风味前体物质的积累提供更有利的环境条件。
2.2 大曲理化指标变化
对QF1和QF2大曲的理化指标(酸度、还原糖含量、含水量、淀粉含量)进行了比较,包括一翻、二翻和出仓阶段(图4)。一翻时,QF1与QF2的酸度基本无差异(图4-a),然而在二翻时,QF2的酸度低于QF1,酸度差异进一步扩大,表明改造曲房在后期发酵减少了酸积累。可能由于QF2较低的湿度和更稳定的曲房温度抑制了乳酸菌等产酸微生物的过度繁殖,减少了酸化趋势[16]。从一翻至出仓,还原糖含量和淀粉含量均处于下降趋势(图4-b、图4-c),QF1与QF2变化相似,大曲在发酵过程中,经过霉菌和酵母的糖化作用,淀粉水解为还原糖[7]。QF2含水量低于QF1(图4-d),这是由于曲房经改造后,通风效果增加,整体湿度降低,更低的含水量改善了大曲的干燥性和贮存稳定性,降低了高湿度下的水分残留导致的霉变风险[15]。
曲房改造通过稳定温度和降低湿度波动,对大曲的理化特征进行了优化,尤其是酸度和含水量。酸度是判断成熟度的关键指标,过高的酸度会导致风味失衡,改造后的酸度优化可能提升白酒的酯类生成,改善酱香风味[17]。改造后出仓大曲含水量降低,提高贮存期稳定性。
a-酸度;b-还原糖含量;c-淀粉含量;d-含水量
图4 发酵过程大曲理化指标变化
Fig.4 Changes in physicochemical indicators of Daqu during fermentation
注:S1-一翻;S2-二翻;S3-出仓;ns表示不显著;****表示差异极显著(P<0.000 1)。
2.3 大曲微生物群落结构
大曲发酵过程中,微生物的组成和丰度对大曲品质起着关键作用。曲房环境的改变会影响微生物的生长与代谢,进而影响大曲的风味品质[18]。基于高通量测序绝对定量结果可见,曲房环境的改变显著重塑了微生物群落(图5)。细菌方面(图5-a),QF1与QF2虽然均以Saccharopolyspora为第一优势属,但在功能菌群的结构上存在明显差异。QF2构建了以Saccharopolyspora (35.31%)、Thermoactinomyces (29.65%)及Bacillus (16.27%)为核心的优势细菌群落。QF1虽然Saccharopolyspora相对丰度较高 (44.55%),但其Bacillus相对丰度极低(仅0.10%),且Thermoactinomyces (13.78%)丰度显著低于QF2,反而富集了较多的考克氏菌属(Kocuria,21.78%)。这表明QF1的环境选择压力不足,导致非核心功能菌群在发酵体系中占据了竞争优势[16]。结果表明,曲房改造的关键作用在于解除了环境对Bacillus和 Thermoactinomyces的生长抑制,从而构建了酶系更丰富的细菌群落。真菌方面(图5-b), QF2呈现出极高的单一优势度,以Thermomyces (54.91%)为绝对主导,辅以Thermoascus (18.64%)。而QF1菌群较为分散,以Thermoascus(31.96%)、Thermomyces(42.42%)及曲霉属(Aspergillus,17.93%)为主。这表明QF2的高温环境更精准地富集了以Thermomyces为核心的高效糖化真菌群落[19]。
Saccharopolyspora和Thermoactinomyces是高温大曲中重要的耐热细菌,广泛参与底物降解[9]。Bacillus在QF2中的特异性富集(18.27% vs 0.10%)是改造成功的关键标志。Bacillus属不仅能产生丰富的淀粉酶和蛋白酶,还能合成有机酸和醇类物质,为酯类香味物质的生成提供前体[10,20-21]。结合理化数据分析,QF2中高相对丰度的Bacillus与Thermomyces共同促进了淀粉和蛋白质的水解,为风味合成提供了充足前体。相反,QF1因缺乏 Bacillus 且 Kocuria 成为优势菌,导致底物转化效率低,限制了风味品质的提升[9, 20]。
a-细菌;b-真菌
图5 大曲微生物菌群结构
Fig.5 Microbial community structure of Daqu
2.4 大曲挥发性风味物质检测
基于HS-SPME-GC-MS技术检测发现,QF2挥发性风味物质总量(499 155 μg/kg)高于QF1(393 194 μg/kg)(图6-a)。总量的提升表明曲房改造优化了代谢环境,有效促进了风味物质的合成与积累[19]。差异主要体现在酸类和醇类的显著富集,这不仅反映了微生物代谢活性的增强,更为后续白酒发酵提供了充足的酯类前体(如乙酸、乳酸及高级醇),有利于形成协调的复合酯香[2]。
主成分分析(principal component analysis,PCA)进一步揭示了样品的风味特征差异(图6-b)。PC1(40.84%)和PC2(22.63%)累计解释了63.47%的方差,有效区分了QF1与QF2。其中,QF2与芳香族类、醇类、吡嗪类物质高度关联,而QF1则更倾向于醛酮类、酚类及内酯/呋喃类。关键标志物分析显示(图6-c～图6-e),QF2中4-乙烯基愈创木酚和四甲基吡嗪含量高于QF1。4-乙烯基愈创木酚作为赋予大曲“木香、焦香”的典型化合物,其积累得益于特定的微生态协同机制,高相对丰度的Thermomyces促进原料中阿魏酸前体的释放[22],随后经Bacillus脱羧转化为4-乙烯基愈创木酚[10]。这种“真菌解构-细菌转化”的协同机制是QF2强化该类风味物质的关键原因[2]。四甲基吡嗪作为“酱香”标志物,在QF2中的富集与前文所述的Bacillus相对丰度增加一致。相比之下,三甲基吡嗪在两组间差异不明显,推测其合成途径相对稳定,受环境调控影响较小[6]。
a-各类风味物质含量;b-大曲风味PCA;c-4-乙烯基愈创木酚含量;d-四甲基吡嗪含量;e-三甲基吡嗪含量
图6 大曲挥发性风味物质检测
Fig.6 Detection of volatile flavor compounds in Daqu
2.5 两种曲房理化参数与微生物群落和风味物质关联分析
大曲发酵过程中的理化参数(酸度、还原糖、含水量和淀粉)是微生物代谢活动的综合反映,同时也影响微生物的生长与群落构建,进而影响风味物质形成。为深入解析曲房结构影响大曲品质的微观机制,研究分析了理化参数与微生物群落(图7)和风味物质(图8)的关联性。
2.5.1 理化参数与微生物群落关联分析
Mantel检验及Spearman相关性分析(图7)结果表明QF2环境改造对“微生态协同”存在影响。在QF2中,优势菌属Bacillus与酸度和含水量呈现负相关趋势。QF2改造优化的发酵环境,成功解除了高酸度对Bacillus的生长抑制,为其提供了最佳生态位[10,16]。相比之下,QF1中淀粉含量与葡萄球菌属(Staphylococcus)呈极显著正相关,表明较高淀粉含量往往伴随着Staphylococcus的滋生,这些微生物可能对最终风味的贡献有限甚至产生负面影响[23],证实了原始曲房因环境胁迫导致的发酵低效性[16]。
进一步分析发现,QF2优化的理化环境促使了细菌与真菌之间形成紧密的代谢耦合关系。Spearman相关性矩阵显示,核心细菌Bacillus与核心真菌Thermomyces呈现极显著正相关。这表明在QF2中,Thermomyces高效降解淀粉产生的还原糖,可能直接促进了Bacillus的增殖与代谢[19, 22];而Bacillus代谢产生的吡嗪等风味前体又反过来优化了微生态稳定性[21]。这种“真菌糖化-细菌产香”的协同效应,正是QF2品质优于QF1的核心微生物学机制[9, 20]。
2.5.2 理化参数与风味物质关联分析
运用Mantel检验及Spearman 相关性分析展示了理化参数与风味物质的关联性(图8)。QF2(图8-a)淀粉含量与酚类物质呈显著正相关,说明QF2较高的淀粉保留量提供了充足底物,促进微生物转化生成4-乙烯基愈创木酚等酚类风味[3,24]。酸度与醛酮类呈正相关趋势,说明低酸环境抑制了异味生成。同时,含水量与酯类前体醇呈负相关,表明QF2提供的适宜水分活度有利于功能菌合成高级醇等关键前体[25]。在QF1中(图8-b),风味物质的积累主要受酸度主导。QF1酸度与醛酮类呈显著正相关。结合已有文献报道,高酸环境会改变微生物群落演替方向,导致风味代谢网络发生偏移并积累异味物质[16]。QF1酸度与吡嗪类、酚类也呈显著正相关。正如WU等[17]的研究表明,在酸度失控状态下,微生物群落代谢难以定向调控,从而导致风味组分失衡。此外,含水量与酸类呈显著正相关,也验证了高湿环境加剧了酸类物质的过量积累[23]。图8结果表明,QF1和QF2的风味代谢驱动因素不同。QF2依赖于充足底物(淀粉),环境干扰较少,有利于优质前体合成[25]。而QF1则被酸度捆绑,高酸虽然伴随着部分风味物质积累,但更显著地导致了异味和挥发酸含量超标,破坏了发酵微生态平衡[16-17]。
a-QF1;b-QF2
图7 理化参数与大曲微生物群落相关性
Fig.7 Correlation between physicochemical parameters and microbial communities in Daqu
a-QF2;b-QF1
图8 理化参数与大曲风味物质相关性
Fig.8 Correlation between physicochemical parameters and Daqu flavor substances
3 结论
曲房物理结构改造(开窗与天花板材质替换)通过增强通风排潮,有效优化了高温大曲的发酵微环境。大曲顶温升高、高温期延长、后期湿度显著降低。定向富集了耐高温功能微生物群落,其中细菌以Saccharopolyspora、Thermoactinomyces和Bacillus为绝对优势属,真菌则以Thermomyces为主导。这些优势菌群通过高效的酶系活动,促进了淀粉降解,使得出仓大曲的酸度和含水量分别降低了11.43%、8.96%,提升了贮存稳定性。微生物代谢活动的增强使挥发性风味物质总量提高了26.95%,其中关键风味物质四甲基吡嗪和 4-乙烯基愈创木酚含量显著提升,风味轮廓得到优化。本研究为物理环境设计调控发酵微生态提供了实证依据,对推动高温大曲生产从经验依赖走向精准可控的标准化、智能化发展具有参考意义。未来进一步可结合物联网传感器与智能控制技术,推动高温大曲工艺智能化转型,促进中国白酒产业可持续发展。
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