酱香型白酒作为中国传统固态发酵蒸馏酒的典型代表,其以独特的“12987”工艺体系为载体,即以1个生产周期内“2次投料、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒”的复杂工序为核心,形成了独特的风味体系和卓越的品质特征[1]。相关研究表明,不同轮次的酱香基酒品质存在显著差异,第4、5、6发酵轮次所对应的3、4、5次基酒相比于其他轮次基酒品质更高[2]。其中,第3、4次基酒在7个取酒轮次中产酒最多,其酱香、花香、水果香较为突出[3]。同时,第3、4次基酒在勾调时使用数量上占据最大比例,且能为酒体“酱香突出、幽雅细腻、醇厚丰满、回味悠长”的核心特征奠定坚实基础[4]。
酱香型白酒发酵分为堆积发酵和窖内发酵,其中高温堆积发酵是酱酒酿造的独特工艺之一,它的核心作用是富集大曲和环境中的微生物,进而促使多种酶类与代谢风味物质生成[5]。这个生产环节为后续的窖内发酵富集重要的微生物、酶类与风味物质及前体,从而赋予酱香型白酒独特的酱香风味[6]。有研究表明,不同轮次高温堆积发酵过程中微生物属的类别具有多样性[7-8],其类别的不同和丰度的高低对酱酒的生产品质有重大影响。黄廷财等[4]发现,Virgibacillus(枝芽孢杆菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)等产酱香微生物在5轮次堆积发酵过程中的平均相对丰度高于4轮次,Lactobacillus(乳杆菌属)在5轮次的平均相对丰度低于4轮次。其中,Lactobacillus的相对丰度在第5轮次呈上升趋势,第4轮次中相对平稳;Bacillus和Virgibacillus的相对丰度在第4、5轮次堆积过程中相对稳定。研究表明,Bacillus和Virgibacillus能代谢合成吡嗪类物质[9],其是形成酱香风味的主体物质。这些微生物属的差异,可能是导致第3、4次基酒风味不同的原因之一。除此之外,酱香型白酒堆积发酵由于在开放的生产环境中进行,其环境因子受外界影响而复杂多变,且微生物与之又存在相互作用,因而形成复杂多样的生态环境。有研究表明,温度、水分和酸度等会影响发酵酒醅的微生物群落结构组成[10]。WANG等[11]研究发现,第4、5轮次的微生物群落与水分质量分数和酸度呈正相关,其中Lactobacillus主要受到淀粉质量分数的调控,Thermomyces(嗜热真菌属)、Thermoascus(嗜热子囊菌属)主要受还原糖质量分数和淀粉质量分数调控。NIU等[12]研究发现,在4轮次堆积过程中,Virgibacillus与温度和还原糖质量分数呈负相关,Monascus(红曲霉属)、Pichia(毕赤酵母属)与淀粉质量分数呈负相关。可见,理化因子在微生物群落演替过程中发挥着重要的作用。随着传统生产模式的改变,机械化、自动化设备逐渐引入生产体系,从而导致生产中形成了较大的堆积堆体,对堆体的微生态造成了一定的影响,呈现醅层微生态的多样性和差异性。因此,基于机械化生产模式下研究第4、5轮次堆积酒醅微生物群落结构差异及其演替与环境因子的显著相关关系,将有利于指导酱酒生产的工艺调节,进一步提升酱酒品质。
基于此,本研究以机械化生产模式下第4、5轮次堆积发酵过程酒醅为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术表征不同醅层的细菌与真菌群落结构,结合顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分析酒醅挥发性风味物质,并运用正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)筛选出关键差异风味物质,Spearman相关性分析揭示了优势菌属与环境因子的相关性,为酱香型白酒堆积发酵的生产调控提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
NaOH、浓盐酸、酒石酸钾钠、无水葡萄糖、CuSO4·5H2O、KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、KCl(均为分析纯),成都市科隆化学品有限公司;2-辛醇溶液(标准品,色谱纯),上海安谱璀世标准技术服务有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9245A电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;CP114电子分析天平,常州奥豪斯仪器有限公司;DL-1万用电炉,北京中兴伟业世纪仪器有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;GCMS-QP2020NXX气质联用仪,日本岛津有限公司;Vortex-2漩涡混匀仪,上海沪析实业有限公司;TG16G医用离心机,盐城市凯特实验仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酒醅样品采集
样品采自泸州某酒厂酱香型白酒生产车间第4、5轮次堆积发酵(下沙为第1堆积轮次)酒醅。本次取样堆体的堆积发酵时间均为5 d,均在第3天后进行翻堆。选取堆积0、1、2、3、4、5 d作为取样时间点,其中,选取具有代表性的样本运送到上海派森诺有限公司进行Illumina MiSeq测序分析。参考GE等[13]的方法对堆积酒醅的空间取样方法进行醅层划分。具体采样方案如图1所示,将堆体划分为外层(W)、中层(Z)、内层(N)和底层(D)共4个醅层,并在堆体的4个方位分别进行取样,所有的样本均为平行取样。样品采集后立即用无菌袋包装,在无菌条件下将每个醅层采集的样品通过四分法混匀。酒醅样本-20 ℃保存,用于理化检测和挥发性风味物质分析;酒醅样本-80 ℃保存,用于高通量测序分析。
图1 堆积过程样品取样位置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the sampling locations during the pile fermentation process
1.3.2 理化指标的检测
使用探针式电子温度计对采样点进行温度监测,每24 h检测1次。参照杨军等[14]的方法对酒醅水分、酸度、淀粉和还原糖含量进行测定。
1.3.3 挥发性风味物质的测定
酒醅预处理:向20 mL顶空瓶依次加入1 g糟醅、2 g NaCl、5 mL蒸馏水和磁力转子、10 μL 0.822 mg/mL 2-辛醇溶液,再用磁力搅拌器水浴加热至60 ℃,插入萃取针头萃取45 min后转移至顶空瓶中待用。GC-MS检测条件以及定性与半定量分析方法参照本课题组方法[14]。
1.3.4 高通量测序
酒醅总DNA提取:将酒醅样品置于研钵在液氮中研磨成粉末,使用FastDNA® Spin Kit For Soil试剂盒进行DNA提取,用NanoDrop 2000检测DNA浓度和纯度,用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。
扩增引物:细菌PCR扩增引物使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′);真菌PCR扩增引物使用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。
扩增程序:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共进行30个循环,然后72 ℃下延伸10 min。
扩增完成后使用20 g/L的琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物,并用DNA凝胶回收试剂盒对产物进行纯化,Tris-HCl洗脱,2%琼脂糖凝胶电泳检测。将回收到的PCR产物送至上海派诺森有限公司进行高通量测序。
1.4 数据处理
利用Excel 2020和Origin 2024等软件进行数据处理,高通量测序数据基于派森诺测序平台(https://www.genescloud.cn/home)进行分析。所有实验均进行3次,结果以“平均数±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 第4、5轮次堆积发酵过程中环境因子的时空变化规律
由图2-a、图2-b可知,第4轮次环境温度在15.8～22.4 ℃进行波动,第5轮次环境温度呈缓慢上升趋势(20.7～24.1 ℃)。随着堆积的进行,第4、5轮次堆体温度均呈现上升趋势,在堆积结束时,外层的温度分别达到了46.3 ℃和48.7 ℃,可能是由于在进行翻堆操作后,堆体内部含氧量上升,使微生物代谢活跃,产生物热增加[15]。如图2-c、图2-d所示,第4轮次堆体水分质量分数呈现上升趋势,堆积结束时达到了51.06%,第5轮次在52.73%～54.36%波动。第4、5轮次酸度整体均呈波动变化,但到堆积后期酸度呈下降趋势,到堆积完成分别为3.20、3.78 mmol/10 g(图2-e、图2-f),这可能是由于堆积后期酸类物质参与酯化反应的速率高于微生物生成酸的速率。如图2-g～图2-j所示,第4、5轮次堆体淀粉质量分数均呈下降趋势;而还原糖质量分数在堆积前期和中期整体呈现上升趋势,可能是微生物分解淀粉生成了还原糖,而在堆积后期酒醅还原糖质量分数下降的主要原因,可能是堆积后期高温抑制淀粉酶活性,导致淀粉分解能力下降[16]以及高温堆积环境促进还原糖发生美拉德反应,生成吡嗪类、呋喃类等风味物质[17]。在堆积过程中,第4、5轮次内不同醅层间温度具有显著性差异(P<0.05),研究发现,堆积结束时2个轮次的外醅层温度显著高于其他醅层(P<0.05),可能是由于堆体内部的热量向外层进行聚集[18]。第4、5轮次水分质量分数在堆积过程中各个醅层间存在显著性差异(P<0.05)。酸度仅在5轮次堆积后期,各醅层间具有显著性差异(P<0.05)。淀粉质量分数在4轮次堆积结束时外层与其余醅层有显著性差异(P<0.05)。第5轮次堆积后期,内层和底层酒醅的还原糖质量分数与外层和中层具有显著性差异(P<0.05)。
2个轮次相比较,在堆积结束时,第5轮次各醅层温度高于第4轮次。第5轮次平均水分质量分数整体高于4轮次,其中5轮次为53.54%,4轮次为50.19%,其主要原因可能是第5轮次堆积酒醅打量水更高且经过多次蒸煮、发酵后,高粱颗粒因淀粉分解和细胞壁破坏形成多孔结构,使水分保留能力提升[19]。第5轮次平均酸度(4.21 mmol/10 g)高于第4轮次(3.46 mmol/10 g)。淀粉质量分数呈现随轮次增加而下降,主要原因是发酵过程中淀粉逐渐被微生物所消耗。第4轮次还原糖质量分数整体高于第5轮次,且在堆积4 d时还原糖的质量分数达到最高值(2.72%),其主要原因可能是翻堆后氧气促进微生物的生命活动,淀粉转化速率较高,使还原糖的质量分数增加。以上结果表明,第4轮次和第5轮次的环境因子整体变化具有相似性,且在轮次内不同醅层的环境因子具有时空差异性特征。
2.2 第4、5轮次堆积发酵酒醅微生物群落结构演替及其差异分析
在酱香型白酒生产过程中,堆积工艺促使酒醅不断富集大曲和环境微生物,引发其微生态发生动态演变[20]。采用扩增子技术解析4、5轮次堆积发酵不同醅层中微生物群落结构,基于微生物属水平的相对丰度绘制群落柱状图,结果如图3所示。
a-4轮次温度;b-5轮次温度;c-4轮次水分;d-5轮次水分;e-4轮次酸度;f-5轮次酸度;g-4轮次淀粉;h-5轮次淀粉;i-4轮次还原糖;j-5轮次还原糖
图2 第4、5轮次堆积酒醅不同醅层环境因子的时空变化规律
Fig.2 Spatiotemporal variations of environmental factors across different layers of fermented grains during the 4th and 5th rounds of pile fermentation
注:不同小写字母表示显著性差异,P<0.05,堆体理化因子趋势图由各醅层均值所绘制。
a-细菌;b-真菌
图3 第4、5轮次堆积发酵酒醅细菌和真菌的微生物群落结构柱形图
Fig.3 Bar plot showing the microbial community composition of bacteria and fungi in stacked fermentation grains during the 4th and 5th rounds of fermentation
由图3-a可知,4轮次和5轮次堆积酒醅优势细菌属(平均相对丰度>1%)均有9种,其中Pseudonocardiaceae(假诺卡氏菌属)为4轮次独有优势细菌属;Pantoea(泛菌属)为5轮次独有优势细菌属。在4轮次堆积0 d时,堆体各醅层相对丰度>10%的极优势细菌属有Kroppenstedtia(克罗彭斯特菌属)和Thermoactinomyces(高温放线菌属),其平均相对丰度为43.76%和17.82%。堆积5 d时,极优势细菌属增加为4种,分别为Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Lactobacillus(乳杆菌属)和Acetobacter(醋杆菌属),其堆体平均相对丰度为17.58%、31.07%、23.95%、12.14%。在5轮次中,堆积0 d和堆积5 d的极优势细菌属的种类与4轮次相同;在堆积0 d时,Kroppenstedtia和Thermoactinomyces平均相对丰度分别为45.23%和19.83%。在堆积5 d时,Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Lactobacillus和Acetobacter的平均相对丰度分别为23.32%、16.59%、11.33%和27.15%。其中Kroppenstedtia和Thermoactinomyces在2个轮次的整个堆积过程中均为极优势细菌属,可推测为堆积发酵过程中起主导作用的细菌属;而传统堆积工艺下2个轮次的主导细菌属为Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus(海洋芽孢杆菌属)[21-22],具有一定的差异。Kroppenstedtia、Thermoactinomyces能够分泌淀粉酶和蛋白酶等酿造过程中的重要酶类,还能够产生酯类、吡嗪类等风味化合物,为酱香型白酒赋予了独特的酱香风味[23-24]。Kroppenstedtia在4、5轮次各醅层中分布较为均匀,其相对丰度都呈现下降趋势,主要原因可能是翻堆后酒醅酸度升高导致其生长和代谢活动受到抑制。Thermoactinomyces在第4、5轮中相对丰度都呈先上升后下降的趋势,在4轮次堆积过程中主要分布在中层和内层,在5轮次堆积过程中主要分布在内层和底层。Acetobacter和Lactobacillus是白酒酿造中的重要微生物,它们能代谢产生酸类物质,并与乙醇等物质合成乙酸乙酯、乳酸乙酯等风味物质[25]。Acetobacter在酒醅外层的平均相对丰度高于其他醅层,可能原因是糟醅外层含氧量较高,利于其生长;而Lactobacillus在4轮次中主要富集于内层;5轮次中主要富集在中层,可能是堆体内部的微氧环境更适合Lactobacillus生长繁殖。Acetobacter和Lactobacillus的相对丰度随着堆积时间的延长,第4、5轮次各醅层都呈现上升趋势,在4、5轮次堆积起始时平均相对丰度均小于1%,堆积过程中相对丰度的上升幅度均大于10%,推测为4、5轮次堆积过程中主要富集的细菌属;但在传统堆积工艺条件下,Acetobacter在4、5轮次堆积过程中相对丰度较低,到堆积结束时没有显著的富集[21-22,26],推测是酒醅升温速率较大,且醅层温度较高所导致[27]。Bacillus在第4、5轮次堆积过程中,各醅层的相对丰度均在5%左右波动。其他优势菌如:Saccharopolyspora(糖多孢菌属)和Staphylococcus(葡萄球菌属)等在4、5轮次各个醅层中相对丰度较低且都呈下降趋势。值得注意的是,在4、5轮次堆积结束时,这些菌属在糟醅外层的分布低于其他醅层,推测在堆积5 d时外层酒醅温度显著高于其他醅层,可能是导致其相对丰度较低的主要原因。
由图3-b可知,第4、5轮次堆积酒醅优势真菌属(平均相对丰度>1%)分别有7种和8种,其中Pichia(毕赤酵母属)为5轮次特有的优势真菌属。在4轮次堆积0 d时,堆体各醅层相对丰度>10%的极优势真菌属有Byssochlamys(丝衣霉菌属)、Thermomyces(嗜热真菌属)和Thermoascus(嗜热子囊菌属),其平均相对丰度为15.15%、47.38%、24.58%。堆积5 d时,极优势真菌属有Thermoascus、Monascus(红曲霉属)和Kazachstania(哈萨克斯坦酵母属),其平均相对丰度分别为17.05%、32.30%、28.24%。在5轮次中,堆积0 d时极优势真菌属与4轮次相同,也为Byssochlamys、Thermomyces和Thermoascus,其平均相对丰度分别为18.77%、36.04%、25.33%。堆积5 d时极优势真菌属相较于4轮次的种类发生了变化,分别为Byssochlamys、Monascus和Kazachstania,其平均相对丰度分别为33.28%、29.33%、14.02%。Thermoascus在4轮次整个堆积过程中均为极优势真菌属,可推测为4轮次的主导真菌属,Byssochlamys在5轮次整个堆积过程中均为极优势真菌属,可推测为5轮次的主导真菌属;而传统堆积工艺下2个轮次的主导真菌属均为Thermomyces,这2种堆积工艺下的主导真菌属不一致[21-22]。Monascus和Kazachstania在4、5轮次堆积起始时平均相对丰度均小于1%,随着堆积的进行,其相对丰度的上升幅度均大于10%,推测为4、5轮次堆积发酵过程中主要富集的真菌属,其中Monascus在4、5轮次中主要富集于外层,Kazachstania在4、5轮次中主要富集于中层。Monascus有较强的酯化力,在发酵过程中能产生多种酶类,对增加酯类化合物的生成具有积极影响[28]。Byssochlamys、Thermomyces、Thermoascus在4、5轮次各醅层堆积0 d时相对丰度较高,它们可能主要来源于高温大曲[29]。Byssochlamys在4轮次各醅层相对丰度都呈现下降的趋势,在堆积5 d时,主要分布在底层糟醅;然而Byssochlamys在第5轮次各醅层相对丰度呈上升趋势,在堆积5 d时,主要分布在内层糟醅,造成这种差异的原因有待进一步研究。Pichia在4轮次中相对丰度较稳定,在5轮次中各醅层呈现上升趋势,其在5轮次中主要富集在中层和外层。Thermomyces和Thermoascus的相对丰度在4、5轮次的各醅层中呈现下降的趋势,这与黄廷财等[4]研究一致。而在传统堆积工艺中Thermomyces和Thermoascus同样呈下降趋势[21-22],其相对丰度下降的主要原因可能在于堆积过程中,酒醅酸度逐渐升高,其微环境不适于这些微生物的生长和繁殖。Pichia在4轮次中相对丰度较稳定,在5轮次中各醅层呈现上升趋势,其在5轮次中主要富集在中层和外层。Aspergillus(曲霉属)和Rasamsonia(罗萨氏菌属)在4、5轮次中整体呈现下降趋势,在2个轮次堆积5 d时,主要富集在中层、内层和底层。
以上研究结果表明,酱香型白酒第4、5轮次的堆积酒醅优势菌属的演替规律具有一定的差异性。随着堆积进行,真菌群落和细菌群落均表现出了时空异质性,且真菌群落变化大于细菌群落;在堆积后期,大部分优势菌属在外醅层的相对丰度较低,主要分布在其余3个醅层,其主要原因可能是受到了温度和酸度等环境因子的影响。值得注意的是,与机械化模式相比,传统堆积工艺下第4、5轮次堆积发酵酒醅中优势霉菌属的种类较少,其总相对丰度占比较低,而优势酵母属种类较多,其总相对丰度占比较高[21-22]。可能在传统堆积发酵中高粱颗粒裂口更充分,淀粉水解产生更多糖类物质,且堆体疏松多孔、含氧量较高,能更好地富集环境中的酵母菌群[30]。
为对比4、5轮次的微生物群落结构差异,利用多级物种差异判别分析方法(Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe)多级物种差异判别分析方法,确定了4轮次和5轮次之间线性判别分析值(linear discriminant analysis,LDA)>2,P<0.05的显著差异微生物。
由图4-A、图4-C、图4-E可知,在4、5轮次的堆积发酵过程中显著差异细菌属(LDA>2,P<0.05)共24种:堆积前期有6种;堆积中期有1种;堆积后期有18种。在堆积过程中,具有显著差异且为优势细菌属的共有6种,分别为:Thermoactinomyces、Acetobacter、Virgibacillus、Bacillus、Saccharopolyspora、Pantoea。由图4-B、图4-D、图4-F可知,在4、5轮次的堆积发酵过程中显著差异真菌属(LDA>2,P<0.05)共13种:堆积前期有9种;堆积中期有1种;堆积后期有6种。在堆积过程中,具有显著差异且为优势真菌属的共有4种,分别为:Byssochlamys、Monascus、Kazachstania和Pichia。从优势菌属来看,在堆积过程中细菌群落较为稳定,而真菌群落的变化较大,其主要原因可能是环境因子对真菌群落的趋同演化作用更为明显。除此之外,在堆积前期时,4、5轮次的差异微生物的数量较多,推测为酒醅营养基质和堆积外环境的不同以及制堆操作过程所造成的影响。在堆积后期时,4、5轮次显著差异微生物的种类增加,可能是由于翻堆操作以及环境因子的差异等因素所导致。
A-细菌前期;B-真菌前期;C-细菌中期;D-真菌中期;E-细菌后期;F-真菌后期
图4 第4、5轮次堆积发酵酒醅通过LEfSe差异判别分析确定的显著差异微生物
Fig.4 Microbial biomarkers identified by LEfSe analysis in stacked fermented grains during the 4th and 5th fermentation rounds
2.3 第4、5轮次堆积发酵酒醅环境因子和微生物群落之间的相关性分析
堆积发酵过程中温度、水分、淀粉等环境因子的变化对微生物群落有显著影响[31]。为了阐明其相互作用关系,本研究选取了平均相对丰度>1%的优势微生物属与环境因子进行Spearman相关性分析,结果如图5所示。
由图5-a、5-b可知,在4轮次堆积过程中,淀粉、水分和还原糖与优势细菌属的相关性强于其他理化因子;5轮次堆积过程中酸度和淀粉与优势细菌属的相关性强于其他理化因子。淀粉在4、5轮次中与Saccharopolyspora呈正相关,这与NIU等[12]在传统工艺中的研究一致,其中,在4轮次中呈高度显著正相关(P<0.001),而淀粉在4轮次中与Lactobacillus呈高度显著负相关(P<0.001);在5轮次中与Lactobacillus和Acetobacter呈显著负相关(P<0.05),可能原因是Lactobacillus和Acetobacter的主要碳源为淀粉降解产生的还原糖[25]。除此之外,在4轮次中,淀粉与Kroppenstedtia、Staphylococcus呈显著正相关(P<0.05)。还原糖在4轮次中与Acetobacter、Thermoactinomyces呈显著正相关(P<0.05)。还原糖与Pseudonocardiaceae、Virgibacillus和Saccharopolyspora呈显著负相关(P<0.05)。水分在4轮次中与Pseudonocardiaceae、Virgibacillus和Saccharopolyspora呈极显著负相关(P<0.01)。酸度在5轮次中与Saccharopolyspora和Staphylococcus呈正相关,其中与Saccharopolyspora呈高度显著正相关(P<0.001)。酸度在5轮次中与Lactobacillus和Acetobacter呈极显著负相关(P<0.01)。由此可推测出,淀粉、水分和还原糖与4轮次优势细菌属的演替呈现显著相关关系;酸度和淀粉与5轮次优势细菌属的演替呈现显著相关关系。
由图5-c、图5-d可知,在4轮次堆积过程中,淀粉和还原糖与优势真菌属的相关性强于其他理化因子;5轮次堆积过程中酸度和淀粉与优势真菌属的相关性强于其他理化因子。淀粉在2个轮次中与Kazachstania均呈负相关,在4轮次中呈高度显著负相关(P<0.001);在5轮次中呈极显著负相关(P<0.01),主要原因可能是Kazachstania在发酵过程中以还原糖为主要碳源,通过酒精发酵将其转化为挥发性风味物质[32]。还原糖在4轮次与Kazachstania、Monascus呈显著正相关(P<0.05),与Thermoascus、Thermomyces呈显著负相关(P<0.05)。酸度在5轮次与Thermoascus、Thermomyces呈高度显著正相关(P<0.001),在张瀚之等[8]的研究中,Thermoascus、Thermomyces与酸度也呈正相关关系。同时,酸度在5轮次与Pichia、Monascus和Kazachstania呈显著负相关(P<0.05)。由此可推测出,淀粉和还原糖与4轮次优势真菌属的演替呈现显著相关关系;酸度和淀粉与5轮次优势真菌属的演替呈现显著相关关系。
a-4轮次细菌属;b-5轮次细菌属;c-4轮次真菌属;d-5轮次真菌属
图5 第4、5轮次优势微生物属与环境因子的Spearman相关性分析
Fig.5 Spearman correlation analysis of dominant microbial genera and environmental factors during the 4th and 5th fermentation rounds
注:*,显著相关,P<0.05;**,极显著相关,P<0.01;***,高度显著相关,P<0.001。
结合以上分析可得,在机械化生产模式下,淀粉、水分和还原糖与第4轮次堆积酒醅微生物演替呈现显著相关关系;酸度和淀粉与第5轮次堆积酒醅微生物演替呈现显著相关关系。结合2.1节分析可知,随着轮次的增加,酒醅平均酸度上升,推测酸度逐渐转化为第5轮次堆积发酵酒醅微生物演替的显著相关关系。值得注意的是,在传统堆积工艺中,第4、5轮次堆积酒醅微生物演替主要与酸度和水分呈显著相关关系[11],其显著相关关系呈现差异的原因,还有待进一步研究和验证。
2.4 第4、5轮次堆积发酵酒醅挥发性风味物质分析
为了探索第4、5轮次堆积发酵过程中的关键挥发性风味物质,本研究对酒醅挥发性风味物质构建了OPLS-DA模型,如图6所示。将P<0.05和变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)>1.0作为筛选关键差异风味物质的标准,从2个轮次分别检测到的90、91种酒醅挥发性风味物质中,共筛选出31种关键差异风味物质,包括15种酯类、5种酸类、1种醇类和10种其他物质,为进一步分析堆积过程中关键差异风味物质在不同轮次中的时空变化,绘制热图,结果如图7所示。
a-OPLS-DA评分图;b-模型检验图
图6 第4、5轮次堆积发酵酒醅挥发性风味物质的OPLS-DA图
Fig.6 OPLS-DA plot of volatile flavor compounds in stacked fermented grains during the 4th and 5th fermentation rounds
图7 第4、5轮次关键挥发性风味物质的聚类热图
Fig.7 Clustered heatmap of key volatile flavor compounds during the 4th and 5th fermentation rounds
注:W-外层;Z-中层;N-内层;D-底层,W4_0-4轮次外层酒醅堆积发酵0 d;W5_0-5轮次外层酒醅堆积发酵0 d。
酯类物质主要是通过微生物代谢途径合成的,其中一小部分来自环境和自发化学反应[33]。酯类物质是4、5轮次之间的主要差异风味成分,其中关键差异酯类物质包括:己酸乙酯、戊酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸甲酯、十六酸丙酯等。由图7可知,棕榈酸甲酯和十六酸丙酯在第4轮次中平均含量高于第5轮次,主要存在于4轮次堆积3 d的底层和外层。己酸乙酯、月桂酸乙酯,戊酸乙酯的平均含量4轮次高于5轮次,在4轮次中主要存在于堆积前期的内层。脂肪酸对白酒的风味至关重要,微生物可以合成低分子脂肪酸,如戊酸、己酸和辛酸,它们是酯类化合物的前体物质[34]。在酱香型白酒第4、5轮次堆积酒醅中异丁酸、戊酸、己酸、辛酸和壬酸为关键差异代谢物。5轮次己酸和辛酸的平均含量高于4轮次,且在5轮次中己酸为含量最高的酸类物质,己酸在底层堆积5 d时达到了3.91 mg/kg。壬酸在4轮次中的平均含量高于第5轮次,其在4轮次堆积3 d时含量达到最高。醇类是协调白酒香气的辅助性物质。苯乙醇是4、5轮次的差异代谢物,苯乙醇在4、5轮次醇类物质中平均含量最高,其中4轮次为3.27 mg/kg,5轮次为4.02 mg/kg,在2个轮次堆积过程中,中层和内层的含量高于其他醅层。除此之外,糠醛在4、5轮次中含量较高,平均含量分别达到了2.52 mg/kg和3.71 mg/kg,其在4轮次中层含量较高,而5轮次在内层含量较高。2-乙酰基呋喃在5轮次中平均含量高于4轮次,在4、5轮次各醅层中分布较均匀。整体来看,4轮次堆积酒醅中酯类物质更为丰富,而5轮次堆积酒醅中酸类、呋喃类及其衍生物更为丰富。
2.5 第4、5轮次堆积发酵酒醅关键差异性风味物质与优势微生物属的相关性分析
在堆积过程中,许多微生物在发酵系统中共存,菌种丰度呈现差异变化、风味化合物的微生物代谢途径也呈动态变化。分析微生物与风味化合物间的关系有助于识别发酵过程中的潜在功能性微生物群,进而调控风味合成过程。基于相关性分析计算第4、5轮次优势微生物属和关键挥发性风味物质间的关联性,选取|r|>0.5且P<0.05的关系绘制成相关性网络图。
由图8-a可知,在4轮次堆积发酵过程中有8个优势细菌属和5个优势真菌属与关键风味物质呈现显著相关性。细菌属主要与酯类和醛类物质呈正相关,其中Virgibacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、Staphylococcus等优势细菌属与糠醛、壬醛和棕榈酸甲酯呈正相关。Thermoactinomyces与壬酸呈正相关。Lactobacillus与己酸丙酯、2-乙酰基呋喃呈正相关,与糠醛和壬醛呈负相关。Acetobacter与2-乙酰基呋喃呈正相关。Thermoascus、Thermomyces与己酸等呈正相关;Thermomyces与糠醛、壬醛、反-2-辛烯醛和棕榈酸甲酯呈正相关。Byssochlamys与棕榈酸甲酯、壬酸和5-甲基呋喃醛呈正相关。
由图8-b可知,在5轮次堆积发酵过程中有8个优势细菌属和7个优势真菌属与关键风味物质呈现出显著相关性。Lactobacillus等产酸菌主要与酸类和酯类物质呈正相关,其中Lactobacillus主要与异丁酸、辛酸、癸酸乙酯、3-苯丙酸乙酯呈正相关,Acetobacter与异丁酸呈正相关,可推测出Lactobacillus对酱香型白酒中酸类和酯类物质的生成具有一定的贡献。Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus等丝状真菌属主要与糠醛、5-甲基呋喃醛等呋喃类衍生物呈正相关,Aspergillus可分泌高活性的木聚糖酶和纤维素酶,其可以分解高粱中的戊聚糖,为糠醛生成提供前体物质[35]。Acetobacter、Lactobacillus等产酸菌与糠醛呈负相关。Monascus与异丁酸、癸酸乙酯、2-乙酰基呋喃显著正相关,Monascus在分泌酯化酶的同时,其在发酵时可以产生醇、醛、酸、酯类物质[28]。研究发现,2个轮次的优势菌属关联的风味物质存在一定差异,推测可能是酱香型白酒的轮次基酒风味不同的原因之一。
a-第4轮次;b-第5轮次
图8 第4轮次和5轮次优势微生物属与关键挥发性风味物质的相关性网络图
Fig.8 Network analysis of predominant microbial genera and key volatile flavor compounds in batch 4 and batch 5
3 结论
本研究以酱香型白酒第4、5轮次堆积发酵酒醅为研究对象,分析2个轮次的酒醅环境因子、微生物群落结构、挥发性风味物质的变化规律及其差异,并揭示优势微生物属与环境因子和挥发性风味物质的相关性。研究发现,酒醅温度、水分和酸度在酱香型白酒第4、5轮次堆积发酵过程中随轮次增加有所上升,还原糖和淀粉随轮次增加有所下降。在第4、5轮次堆积发酵过程中,各醅层温度和水分具有显著性差异(P<0.05),各醅层酸度仅在5轮次堆积后期具有显著性差异(P<0.05)。高通量测序结果表明,Kroppenstedtia、Thermoactinomyces均为4、5轮次堆积过程中的主导细菌属,Acetobacter和Lactobacillus均是第4、5轮次被主要富集的细菌属。Thermoascus为4轮次堆积过程中的主导真菌属,Byssochlamys为5轮次堆积过程中的主导真菌属,Monascus和Kazachstania均是第4、5轮次主要富集的真菌属。堆积发酵过程中,2个轮次之间具有显著差异且为优势细菌属的共6种,分别为:Thermoactinomyces、Acetobacter、Virgibacillus、Bacillus、Saccharopolyspora和Pantoea;具有显著差异且为优势真菌属的共4种,分别为:Byssochlamys、Monascus、Kazachstania和Pichia。除此之外,2个轮次之间的显著差异菌属为非优势菌属。微生物与环境因子相关性分析结果表明,淀粉、水分和还原糖与第4轮次堆积酒醅微生物演替呈现显著相关关系,酸度和淀粉与第5轮次堆积酒醅微生物演替呈现显著相关关系。微生物与风味物质相关性分析结果表明,在4轮次中,Virgibacillus、Kroppenstedtia等细菌属主要与棕榈酸甲酯、糠醛、壬醛等物质呈正相关;Thermoascus、Thermomyces等真菌属主要与己酸等物质呈正相关。在5轮次中,Lactobacillus等细菌属和Monascus等真菌属主要与酸类和酯类物质呈正相关;Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus等真菌属主要与糠醛、5-甲基呋喃醛等呋喃类衍生物呈正相关。研究初步探明了2个轮次的酒醅微生物群落结构、环境因子及挥发性风味物质之间的差异性及互作关系。值得注意的是,在机械化和传统堆积模式下,酒醅微生物演替特征及其显著相关关系的环境因子均存在一定的差异,推测主要与堆积堆体的微生态环境差异有关。未来还需深入解析机械化堆积模式下酱香型白酒堆积发酵环境因子对微生物的驱动机制,以及对酱香型白酒关键风味物质合成的影响,探究机械化与传统堆积模式的微生态特征差异及其对白酒酿造的影响,为进一步优化酱香型白酒发酵调控和提升酱酒品质奠定理论基础。
[1] 许忠平, 梁明锋, 张娇娇, 等.不同地区酱香型白酒风格特征及风味物质构成差异相关性研究[J].中国酿造, 2024, 43(2):35-42.
XU Z P, LIANG M F, ZHANG J J, et al.Correlation between style characteristics and flavor composition of sauce-flavor Baijiu from different regions[J].China Brewing, 2024, 43(2):35-42.
[2] WU J H, CHEN R Y, LI X B, et al.Comprehensive identification of key compounds in different quality grades of soy sauce-aroma type Baijiu by HS-SPME-GC-MS coupled with electronic nose[J].Frontiers in Nutrition, 2023, 10:1132527.
[3] 孙优兰, 骆红波, 王金龙, 等.酱香型白酒不同轮次基酒风味特征分析[J].食品与发酵工业, 2024, 50(17):343-352;I0003-I0005.
SUN Y L, LUO H B, WANG J L, et al.Analysis of flavor characteristics of different rounds base liquor for Jiangxiangxing Baijiu[J].Food and Fermentation Industries, 2024, 50(17):343-352;I0003-I0005.
[4] 黄廷财, 柴丽娟, 时伟, 等.酱香型白酒第2、3轮次堆积发酵有机酸代谢规律与菌群结构及其相关性解析[J].食品科学, 2024, 45(18):106-115.
HUANG T C, CHAI L J, SHI W, et al.Microbial community structure and organic acid metabolism and their correlation in the second and third rounds of stacking fermentation of sauce-flavor Baijiu[J].Food Science, 2024, 45(18):106-115.
[5] WU Q, XU Y.Transcriptome profiling of heat-resistant strain Bacillus licheniformis CGMCC3962 producing Maotai flavor[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(8):2033-2038.
[6] 邓俊, 吴先远, 蒋英丽, 等.堆积糖化方式对酱香型白酒生产的影响[J].酿酒科技, 2021(7):70-75.
DENG J, WU X Y, JIANG Y L, et al.Effects of stacking saccharification methods on the production of Jiangxiang Baijiu[J].Liquor-Making Science &Technology, 2021(7):70-75.
[7] 王欢, 席德州, 黄永光, 等.酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵细菌菌群结构多样性分析[J].食品科学, 2020, 41(2):188-195.
WANG H, XI D Z, HUANG Y G, et al.Bacterial community structure and diversity in different stacking fermentation rounds in mechanized Maotai-flavor liquor brewing[J].Food Science, 2020, 41(2):188-195.
[8] 张瀚之, 席德州, 王欢, 等.酱香型白酒机械化酿造不同轮次堆积发酵酒醅真菌群落结构多样性研究[J].中国酿造, 2021, 40(12):64-69.
ZHANG H Z, XI D Z, WANG H, et al.Diversity of fungal community structure in different rounds fermented grains of stacking fermentation in mechanized brewing of Maotai-flavor Baijiu[J].China Brewing, 2021, 40(12):64-69.
[9] 张颖, 李霄霄, 李景辉, 等.高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的筛选及其对酱香型白酒堆积过程的影响[J].食品工业科技, 2022, 43(2):142-149.
ZHANG Y, LI X X, LI J H, et al.Screening of high-yielding tetramethylpyrazine Bacillus and its effect on the accumulation process of Maotai-flavor liquor[J].Science and Technology of Food Industry, 2022, 43(2):142-149.
[10] NIU J, YANG S Q, SHEN Y, et al.What are the main factors that affect the flavor of sauce-aroma Baijiu[J].Foods, 2022, 11(21):3534.
[11] WANG H, HUANG Y G, HUANG Y L.Microbiome diversity and evolution in stacking fermentation during different rounds of Jiang-flavoured Baijiu brewing[J].LWT, 2021, 143:111119.
[12] NIU J, YAN Y H, ZHANG G H, et al.Temporal and workshop heterogeneity of microbial communities with physicochemical properties and flavor substances during stacked fermentation of sauce-flavor Baijiu[J].Foods, 2025, 14(6):924.
[13] GE D Y, WANG Y R, CAI W C, et al.Correlation analysis of microbial groups and sensory quality in the fourth round of the stacked fermentation of sauce-flavor liquor[J].Food Bioscience, 2024, 59:103958.
[14] 杨军, 敖宗华, 贾俊杰, 等.机械化模式下酱酒不同层次堆积糟醅的理化指标与风味物质的差异分析[J].酿酒科技, 2024(6):17-26.
YANG J, AO Z H, JIA J J, et al.Differences in physicochemical indexes and flavor substances of stacked fermented grains during mechanized production of Jiangxiang Baijiu[J].Liquor-Making Science &Technology, 2024(6):17-26.
[15] LI Y B, QIN X, ZENG X L, et al.Comprehensive analysis of spatiotemporal heterogeneity reveals the effects of physicochemical and biological factors on temperature rise during the Moutai-flavor Baijiu stacking fermentation process[J].Chemical Engineering Journal, 2025, 508:161049.
[16] 胡春红, 李新涛, 卢君, 等.酱香型白酒酒醅堆积过程酵母菌、酶活力及代谢产物变化规律[J].中国酿造, 2024, 43(6):66-73.
HU C H, LI X T, LU J, et al.Changes of yeast, enzyme activity and metabolites of fermented grains of sauce-flavor Baijiu during stacking[J].China Brewing, 2024, 43(6):66-73.
[17] SHAKOOR A, ZHANG C P, XIE J C, et al.Maillard reaction chemistry in formation of critical intermediates and flavour compounds and their antioxidant properties[J].Food Chemistry, 2022, 393:133416.
[18] 万旗钰, 程玉鑫, 黄永光, 等.酱酒1、2轮次窖池不同醅层微生态结构与酸性化合物组成解析及其相关性预测[J].食品科学, 2024, 45(4):88-95.
WAN Q Y, CHENG Y X, HUANG Y G, et al.Fermented grains from different layers of cellar in the first and second rounds of fermentation of Maotai-flavor Baijiu:Analysis of microbial community structure and acid composition as well as correlation between them[J].Food Science, 2024, 45(4):88-95.
[19] 山波, 蒋晓锋, 涂荣坤, 等.不同品种高粱酿造酱香型基酒的品质差异分析[J].食品科学, 2025, 46(4):180-190.
SHAN B, JIANG X F, TU R K, et al.Differences in the quality of Jiang-flavor base Baijiu brewed from different varieties of sorghum[J].Food Science, 2025, 46(4):180-190.
[20] 黄俊秋, 王松涛, 张宿义, 等.酱香白酒第5轮堆积发酵过程菌群演替与有机酸关联分析[J].食品科学, 2025, 46(18):102-114.
HUANG J Q, WANG S T, ZHANG S Y, et al.Correlation analysis between microbial community succession and organic acids in the 5th round of stacking fermentation of sauce-flavor Baijiu[J].Food Science, 2025, 46(18):102-114.
[21] 邹恬杏, 苏伟, 母应春, 等.洞酿酱香酒第四轮次酒醅发酵过程中微生物群落与挥发性代谢物分析[J].中国酿造, 2023, 42(6):64-71.
ZOU T X, SU W, MU Y C, et al.Analysis of microbial community and volatile metabolites during the fourth round fermented grains fermentation of Dongniang sauce-flavor Baijiu[J].China Brewing, 2023, 42(6):64-71.
[22] 林彩霞, 苏伟, 母应春, 等.洞酿酱香酒五轮次酿造过程中微生物与挥发性风味物质的相关性[J].食品工业科技, 2023, 44(21):127-136.
LIN C X, SU W, MU Y C, et al.Study on the correlation between microbe and volatile flavor substances in five rounds of brewing process of Dongniang sauce-flavor Baijiu[J].Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(21):127-136.
[23] 翟威涛, 吴双全, 柴丽娟, 等.酱酒酒醅中普通高温放线菌的筛选及其挥发性物质代谢分析[J].食品科学, 2025, 46(12):118-126.
ZHAI W T, WU S Q, CHAI L J, et al.Screening for Thermoactinomyces vulgaris in fermented grains of sauce-flavor Baijiu and metabolic analysis of volatile compounds[J].Food Science, 2025, 46(12):118-126.
[24] 吴双全, 柴丽娟, 黄廷财, 等.酱香型白酒堆积酒醅中象牙色克罗彭斯特德菌的分离筛选及其代谢特性解析[J].微生物学报, 2024, 64(7):2502-2521.
WU S Q, CHAI L J, HUANG T C, et al.Isolation, screening, and metabolic characterization of Kroppenstedtia eburnea from the fermented grains of Jiang-flavor Baijiu[J].Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(7):2502-2521.
[25] 胡小霞, 黄永光, 涂华彬, 等.酱香型白酒1轮次酿造细菌的菌群结构[J].食品科学, 2020, 41(14):175-182.
HU X X, HUANG Y G, TU H B, et al.Bacterial diversity structure during the first round of pile and pit fermentation of Moutai-flavor Baijiu[J].Food Science, 2020, 41(14):175-182.
[26] 孙利林, 李立郎, 胡萍, 等.酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中真菌多样性分析[J].中国酿造, 2019, 38(11):24-30.
SUN L L, LI L L, HU P, et al.Analysis of fungal diversity in Moutai-flavor Baijiu during the fourth round fermentation[J].China Brewing, 2019, 38(11):24-30.
[27] 唐玉明, 任道群, 姚万春, 等.酱香型酒糟醅堆积过程温度和微生物区系变化及其规律性[J].酿酒科技, 2007(5):54-58.
TANG Y M, REN D Q, YAO W C, et al.The change rules of temeprature and microflora during the stacking of Maotai-flavor fermenting grains[J].Liquor-Making Science &Technology, 2007(5):54-58.
[28] 孙利林, 李立郎, 胡萍, 等.酱香型白酒大曲的微生物菌群结构及风味成分分析[J].现代食品科技, 2020, 36(8):299-306;193.
SUN L L, LI L L, HU P, et al.Analysis of microbial community structure and flavor composition of Maotai-flavor Daqu[J].Modern Food Science and Technology, 2020, 36(8):299-306;193.
[29] 王嘉丽, 杨阳, 何卓, 等.酱香型大曲功能微生物鉴定、强化策略及应用研究进展[J].食品与发酵工业, 2026, 52(4):430-440.
WANG J L, YANG Y, HE Z, et al.Research progress on identification, strengthening strategies and application of functional microorganisms in sauce-flavor Daqu[J].Food and Fermentation Industries, 2026, 52(4):430-440.
[30] 王晓丹, 庞博, 陆安谋, 等.酱香型白酒堆积过程中酵母变化趋势研究[J].食品工业, 2014, 35(12):42-44.
WANG X D, PANG B, LU A M, et al.Study on the yeast change trend in the process of accumulation of Maotai-flavor liquor[J].The Food Industry, 2014, 35(12):42-44.
[31] HAO F, TAN Y W, LV X B, et al.Microbial community succession and its environment driving factors during initial fermentation of Maotai-flavor Baijiu[J].Frontiers in Microbiology, 2021, 12:669201.
[32] 倪冰倩, 夏韩硕, 闵伟红, 等.Pichia kudriavzevii生物强化对酱香型白酒酒醅微生物群落结构及挥发性风味组分的影响[J].食品科学技术学报, 2024, 42(2):93-108;130.
NI B Q, XIA H S, MIN W H, et al.Effect of biofortification with Pichia kudriavzevii on community structure and volatile flavour fractions of fermented grains of sauce-aroma Baijiu[J].Journal of Food Science and Technology, 2024, 42(2):93-108;130.
[33] XU Y Q, LIU X, ZHAO J R, et al.An efficient phthalate ester-degrading Bacillus subtilis:Degradation kinetics, metabolic pathway, and catalytic mechanism of the key enzyme[J].Environmental Pollution, 2021, 273:116461.
[34] WEI Y, ZOU W, SHEN C H, et al.Basic flavor types and component characteristics of Chinese traditional liquors:A review[J].Journal of Food Science, 2020, 85(12):4096-4107.
[35] 黄永光. 酱香型白酒酿造中Aspergillus hennebergii及其分泌酸性蛋白酶的研究[D].无锡:江南大学, 2014.
HUANG Y G.Study on secretome and acid protease of Aspergillus hennebergii from the brewing process of Moutai-liquor[D].Wuxi:Jiangnan University, 2014.