抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类能在亚零度环境中抑制冰晶生长、调控冰晶形态的特殊蛋白[1]。它们广泛存在于处在寒冷环境中的生物中,如极地鱼类[2-3]、昆虫[4]、植物[5]、微生物[6]等。AFPs通过其冰结合位点不可逆地结合冰晶表面,引起局部冰面曲率增加,从而降低冰点并抑制冰晶进一步生长[7],对生物在低温胁迫下的生存具有关键作用。
鱼类AFPs多为Ⅰ型或Ⅲ型结构[8],植物AFPs则常含多个亲水性冰结合结构域[9],虽热滞活性较低,但具有极强的冰晶重结晶抑制活性。HUANG等[10]的研究表明,南极鳗鱼的多结构域Ⅲ型AFPs通过抑制脂质过氧化、保持膜的完整性,能显著提升烟草对非冰冻低温的耐受性。部分植物AFPs还具有抗菌功能。生物体内的AFPs通过抑制冰晶的破坏性生长、稳定细胞膜结构及调节渗透平衡,显著增强了动植物对零下低温的耐受性[11]。基于其独特的冰晶调控能力,AFPs已在食品工业与生物医学领域展现出应用潜力,如改善冷冻肉制品持水性、提高细胞冻存存活率等[12-13]。
天然AFPs提取成本高、产量低,因此,利用重组表达系统实现其规模化制备成为研究热点。毕赤酵母表达系统具有生长快、易高密度发酵、能完成真核蛋白翻译后修饰等优点,是异源表达AFPs的理想宿主。本研究选取冬小麦AFP(GaAFP,NCBI 登录号:AAX81542.1)与银鳕鱼AFP(DmAFP,NCBI 登录号:AAC60131.1)为研究对象,旨在构建其在毕赤酵母中的高效表达体系,优化发酵工艺,并评价其在食品冷冻保鲜中的应用效果,以期为AFP的产业化开发提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌DH5α用于质粒克隆与扩增。毕赤酵母GS115与X-33在实验室-80 ℃保存。表达载体pPIC9K(带G418抗性)、pPICZαA(带博来霉素抗性)及含有已合成好目标基因的重组质粒pPIC9K-GaAFP、pPICZαA-DmAFP,上海迪赢生物科技有限公司;限制性内切酶Sac I、博来霉素、G418抗生素、卡那霉素、标准蛋白质分子质量标准(DL2000,DL15000,彩虹预染低分子质量Marker),碧云天生物技术有限公司;引物合成及测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,序列见表1;Bradford法蛋白浓度测定试剂盒,上海雅酶生物医药科技有限公司;所用培养基成分,如酵母提取物、蛋白胨、无氨基酵母氮源等均为生化试剂纯,上海生工生物有限公司。
表1 PCR引物设计
Table 1 Primer sequences designed for PCR
引物名称引物序列(5′-3′)PCR产物预期大小/bp5′AOX1GACTGGTTCCAATTGACAAGC4973′AOX1GCAAATGGCATTCTGACATCCGaAFP-FTAGTCAGCAAGCGAATGG466GaAFP-RGAGGTGGAAGACGAGGTADmAFP-FTGAACTTAGCGGCAACTG515DmAFP-RTGTGGCAGCGAATCTCAG
注:AOX1:醛氧化酶1。
1.2 仪器与设备
BSA124S分析天平,德国赛多利斯公司;Bio-Rad Gene Pulser Xcell电转仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪,美国BIO-RAD公司;HYL-A全温摇瓶柜,太仓强乐实验设备有限公司;SQ810C高压灭菌锅,日本YAMATO公司;差示扫描量热仪,瑞士METTLER TOLEDO公司;低场核磁共振成像仪,上海纽迈电子科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 重组表达载体的构建与验证
将重组质粒pPIC9K-GaAFP与pPICZαA-DmAFP以及空载体pPIC9K、pPICZαA分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单菌落接种于含相应抗生素(pPIC9K系列:25 μg/mL卡那霉素;pPICZαA系列:25 μg/mL博来霉素)的LB液体培养基中,于37 ℃、200 r/min振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取质粒。用限制性内切酶Sac Ⅰ在37 ℃下对提取的质粒进行单酶切线性化处理1 h,回收线性化产物。以线性化质粒为模板,使用载体通用引物对(5′AOX1/3′AOX1)进行PCR扩增,反应体系为25 μL,程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min/kb,30个循环;72 ℃ 10 min。同时,将线性化后的空载体与重组载体进行2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳,验证插入片段大小。
1.3.2 毕赤酵母的电击转化和阳性转化子筛选
取80 μL制备好的毕赤酵母GS115或X-33感受态细胞,与20 μL经Sac Ⅰ线性化并纯化的质粒DNA(约1 μg)轻柔混匀,转入预冷的电击杯中。使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell电转仪,在电压2 000 V、电容25 μF、电阻200 Ω的条件下进行电击。电击后立即加入1 mL预冷的山梨醇溶液(1 mol/L)混匀,转移至无菌离心管,30 ℃静置复苏1～2 h。取适量菌液涂布于含1 mol/L山梨醇的YPD固体平板上,30 ℃培养3～4 d直至菌落出现。
挑取生长良好的转化子单菌落,分别点种于MD(最小葡萄糖)培养基和MM(最小甲醇)培养基平板上,30 ℃培养2～3 d。通过观察在2种培养基上的生长情况,筛选甲醇利用表型为Mut+(在MD和MM上均能生长)的克隆。为进一步筛选多拷贝整合菌株,将Mut+阳性克隆分别接种于含梯度浓度抗生素的YPD平板上(对于GS115转化子:G418质量浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL;对于X-33转化子:博来霉素质量浓度为1.0、2.0、4.0 mg/mL),30 ℃培养3～4 d,挑选能在高浓度抗生素平板上生长的菌落作为高拷贝候选菌株。
1.3.3 高产重组菌株的发酵筛选
将上述筛选出的高拷贝候选菌株,分别接种于24孔板中,每孔装有2 mL BMGY培养基,28 ℃、225 r/min振荡培养至OD600nm值≈5～6。离心弃上清液,用等体积BMMY培养基重悬菌体,并添加0.5%(体积分数)甲醇诱导表达。每24 h补加一次甲醇至相同终体积分数,共诱导72 h。发酵结束后,离心收集上清液,采用差示扫描量热仪测定浓缩液的热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)。每种构建选取THA值最高的5个菌株,进一步进行250 mL摇瓶规模发酵验证(BMGY生长,BMMY诱导,甲醇终体积分数1%,诱导48 h),最终确定表达活性最高的菌株GS115-pPIC9K-GaAFP(编号Ga-5)和X33-pPICZαA-DmAFP(编号Dm-2)用于后续所有研究。
1.3.4 重组蛋白的诱导表达条件优化
将筛选出的高产菌株Ga-5和Dm-2分别进行摇瓶发酵,系统优化诱导表达条件。基础发酵流程:接种于50 mL BMGY,28 ℃培养至OD600nm值=5～6,离心收集菌体,重悬于50 mL BMMY中开始诱导。分别考察以下单因素:甲醇体积分数设置0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% 6个梯度,诱导48 h;调节BMMY培养基初始pH值为5.5、6.0、6.5、7.0,在各自最适甲醇体积分数下诱导48 h;在最适甲醇体积分数和pH下,分别于诱导12、24、36、48、60、72 h取样。
每次实验均设置空载体转化菌株作为阴性对照。取样后离心获得发酵上清液,采用Bradford法测定总蛋白浓度,并以牛血清白蛋白制作标准曲线;同时测定上清液的THA。
1.3.5 重组抗冻蛋白的纯化与鉴定
将优化条件下大规模发酵获得的上清液,先经0.45 μm滤膜过滤,再用10 kDa超滤离心管浓缩。浓缩后的样品上样至预先用结合缓冲液(20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,pH 7.4)平衡好的镍离子亲和层析柱。用10倍柱体积的结合缓冲液洗去未结合杂蛋白,随后用洗脱缓冲液(20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑,pH 7.4)进行阶段洗脱,收集洗脱峰。洗脱液用PBS透析去除咪唑,浓缩后备用。纯化前后的样品进行12%(质量分数)SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色,验证蛋白纯度和分子质量,并进行THA测定。
1.3.6 重组抗冻蛋白的应用性能评价
1.3.6.1 对冷冻鸡胸肉持水性的影响
参照肖书剑[14]的方法,将新鲜鸡胸肉切成2 cm×2 cm×2 cm的均匀肉块,随机分为6组:空白对照组:浸泡于0.9%(质量分数)NaCl溶液;试验组Ⅰ～Ⅳ:分别浸泡于12.5、25、37.5、50 mg/L纯化后的重组AFP溶液与市售抗冻蛋白溶液中。所有组均在4 ℃下浸渍3 h,取出后用滤纸吸干表面水分,装入无菌包装袋,-20 ℃冷冻保存3 d。测定前于4 ℃冰箱解冻12 h。
测定蒸煮损失参照DU等[15]的方法。将解冻后肉块称重(m1),置于食品级自封袋中,80 ℃水浴加热至中心温度达70 ℃,取出吸干水分后称重(m2)。计算如公式(1)所示:
蒸煮损失率
(1)
测定解冻损失参照WANG等[16]的方法。精确称量冷冻前肉块质量(m3)和解冻后吸干表面水分的肉块质量(m4),按公式(2)计算解冻损失率:
解冻损失率
(2)
1.3.6.2 对马铃薯冻融后水分分布的影响
将新鲜马铃薯洗净去皮,切成直径20 mm、厚5 mm的圆片。随机分为6组:空白对照组:浸泡于0.9% NaCl溶液;试验组A、B:分别浸泡于12.5、37.5 mg/L重组DmAFP溶液;试验组C、D:分别浸泡于12.5、37.5 mg/L重组GaAFP溶液;阳性对照组:浸泡于37.5 mg/L市售AFP溶液。
抽真空干燥参考SUN等[17]的方法,将马铃薯片与溶液放入真空干燥器,在0.09 MPa真空度下维持30 min,进行真空浸渍。浸渍后取出吸干表面水分,置于-20 ℃冷冻3 d,期间每24 h取出在室温(24 ℃)下解冻40 min,完成一次冻融循环。冻融结束后,采用低场核磁共振成像仪进行分析。将样品用特氟龙膜包裹置于25 mm核磁管中,设置参数:谱仪频率20 MHz,视场60 mm×60 mm,重复时间500 ms,回波时间20 ms,扫描4次[18]。通过质子密度加权成像观察水分分布,图像以伪彩色显示,颜色强度代表质子信号强度(含水量)。
1.4 数据统计与分析
所有实验均独立重复3次数据以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA),并用Duncan’s多重比较检验组间差异,P<0.05视为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 重组表达载体的验证
重组表达载体pPIC9K-GaAFP和pPICZαA-DmAFP的质粒构成如图1-A所示。以线性化质粒为模板的PCR产物电泳结果(图1-B)显示,在约500 bp处出现特异性条带,与含有AOX1启动子和终止子区域的预期片段大小相符,初步证明载体构建正确。
泳道M1-2 000 bp DNA分子质量标准;泳道M2-15 000 bp DNA分子质量标准;泳道1-pPIC9K-GaAFP PCR产物;泳道2-pPICZαA-DmAFP PCR产物;泳道3-pPICZαA单酶切产物;泳道4-pPICZαA-DmAFP单酶切产物;泳道5-pPIC9K单酶切产物;泳道6-pPIC9K-GaAFP单酶切产物。
A-重组表达载体构建;B-重组表达载体PCR产物凝胶电泳;C-pPICZαA线性化质粒凝胶电泳;D-pPIC9K线性化质粒凝胶电泳
图1 重组表达载体的构建及PCR、单酶切鉴定
Fig.1 Construction of recombinant expression vector and their identification by PCR and single enzyme digestion
泳道M1-2 000 bp DNA分子质量标准;泳道1-rDmAFP基因组PCR产物;泳道2-rGaAFP基因组PCR产物。
A-线性化质粒PCR产物凝胶电泳;B-热滞活性测定;B-rDmAFP菌株筛选;C-rGaAFP菌株筛选
图2 产高热滞活性rAFPs的重组毕赤酵母鉴定与筛选
Fig.2 Identification and screening of recombinant P.pastoris strains producing rAFPs with high thermal hysteresis activities
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
进一步通过Sac Ⅰ单酶切验证(图1-C～图1-D),空载体pPICZαA和pPIC9K的条带大小分别与预期的3 593 bp和9 276 bp一致;而重组载体pPICZαA-DmAFP和pPIC9K-GaAFP的条带大小分别增加至约4 516 bp和10 113 bp,与插入的目的基因(GaAFP:约837 bp;DmAFP:约1 029 bp)理论大小吻合,确证重组载体构建成功。
2.2 产高THA重组抗冻蛋白(rAFPs)毕赤酵母的鉴定与筛选
将线性化重组质粒电击转化毕赤酵母后,提取高拷贝抗性筛选阳性克隆的基因组DNA进行PCR验证。如图2-A所示,以基因组为模板,使用基因特异性引物扩增,在463 bp(GaAFP)和522 bp(DmAFP)处得到清晰条带,而空载体对照无此条带,证明目的基因已成功整合至毕赤酵母基因组中。
通过24孔板初筛和摇瓶复筛,对所有转化子的发酵上清液THA进行了测定。结果显示,所有重组菌株的上清液均能检测到THA,而空载体菌株则无,表明重组蛋白成功表达并分泌至胞外且具有功能。如图2-B所示,在摇瓶发酵48 h后,菌株Dm-2(产DmAFP)和Ga-5(产GaAFP)发酵上清液的THA显著高于其他同类型转化子(P<0.05),因此被选定为后续研究的工程菌株。
2.3 重组蛋白的纯化及SDS-PAGE鉴定
利用C末端融合的6His标签[19],通过镍柱亲和层析纯化了发酵上清液中的重组蛋白。SDS-PAGE结果如图3所示。泳道2和5分别为Ga-5和Dm-2菌株发酵上清液,可见多条杂蛋白条带。经镍柱纯化后(泳道3和6),分别在略大于25 kDa和约40 kDa处观察到单一、清晰的主条带,与预测的GaAFP(27.3 kDa)和DmAFP(42.7 kDa)分子质量一致。该结果表明6His标签成功插入且纯化工艺有效,获得了高纯度的重组抗冻蛋白,纯化后的GaAFP与DmAFP THA分别为1.46 ℃与1.75 ℃(2 mg/mL),THA显著提高,可用于后续应用研究。
泳道M3-180 kDa蛋白分子质量标准;泳道1、4-空白对照;泳道2-Ga-5发酵上清液;泳道3-纯化后的rGaAFP;泳道5-Dm-2发酵上清液;泳道6-纯化后的rDmAFP。
图3 rGaAFP和rDmAFP的SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of rGaAFP and rDmAFP
2.4 诱导表达条件优化
2.4.1 甲醇体积分数
甲醇既是诱导剂也是碳源,其体积分数显著影响外源蛋白表达,体积分数过低则诱导不充分,过高则可能产生甲醇毒性,抑制菌体生长和蛋白表达[20]。如图4所示,随着甲醇体积分数从0.5%增加到3.0%,2株 菌的总蛋白表达量和THA均呈先升后降的趋势。对于X33-pPICZαA-DmAFP菌株,甲醇体积分数为2.0%时,总蛋白含量和THA均达到峰值;对于GS115-pPIC9K-GaAFP菌株,最适甲醇体积分数为1.5%。
A-总蛋白含量测定;B-THA测定
图4 甲醇体积分数对发酵上清液的总蛋白含量和THA的影响
Fig.4 Effect of methanol volume fraction on total protein content and THA in the fermentation supernatant
2.4.2 pH 值的影响
培养基pH值影响菌体代谢酶活性、营养物质的解离状态和相应成分的利用速率以及蛋白稳定性[21-22]。如图5所示,在pH 5.5～7.0,2种蛋白的表达效率对pH响应不同。DmAFP在pH 6.5时表达量最高,而GaAFP在pH 6.0时表现最佳(图5-A)。THA的变化趋势与总蛋白含量基本一致(图5-B),表明在此pH范围内蛋白正确折叠和功能活性得以保持。
A-总蛋白含量测定;B-THA测定
图5 pH 值对发酵上清液的总蛋白含量和THA的影响
Fig.5 Effects of pH on total protein content and THA in the fermentation supernatant
2.4.3 诱导时间的影响
诱导时间是平衡蛋白积累与菌体衰亡的关键。如图6所示,在12～72 h内,总蛋白含量和THA均随时间延长先快速增加后趋于平缓或下降。2种重组蛋白均在诱导48 h时达到最高表达水平和THA。继续延长诱导时间,可能由于营养耗竭、蛋白降解[23]或甲醇累积毒性,导致THA下降。
A-总蛋白含量测定;B-THA测定
图6 诱导表达时间对发酵上清液的总蛋白含量和THA的影响
Fig.6 Effects of induction time on total protein content and THA in the fermentation supernatant
综合以上优化结果,确定DmAFP的最佳诱导条件为:甲醇2.0%、pH 6.5、诱导48 h,在此条件下蛋白产量达129.7 mg/L,THA为0.92 ℃;GaAFP的最佳条件为:甲醇1.5%、pH 6.0、诱导48 h,蛋白产量达115.4 mg/L,THA为0.83 ℃。
2.5 重组抗冻蛋白的应用效果
2.5.1 对冷冻鸡胸肉持水特性的影响
持水能力是衡量冷冻肉品质的关键指标。如图7所示,与空白对照组相比,经不同质量浓度rAFPs或市售AFP处理的鸡胸肉,其解冻损失率和蒸煮损失率均显著降低(P<0.05)。损失率随rAFPs添加量的增加呈现先下降后略有回升的趋势,其中37.5 mg/L rAFPs处理组效果较优。这表明rAFPs能更有效地抑制冷冻过程中大冰晶的形成,减轻对肌纤维和细胞膜的机械损伤,从而在解冻和加热时减少汁液流失,提升持水性[24]。添加量过高可能引起溶液渗透压等物化性质的改变[25],反而不利于保护效果。
A-解冻损失率测定;B-蒸煮损失率测定
图7 抗冻蛋白对冷冻鸡胸肉持水性的影响
Fig.7 Effects of antifreeze proteins on the water-holding capacity of frozen chicken breast
A-空白对照组;B-市售AFP处理;C、D-12.5、37.5 mg/L DmAFP处理;E、F-12.5、37.5 mg/L GaAFP处理
图8 不同处理方式下马铃薯切片中水分分布情况
Fig.8 Moisture distribution in potato slices with different treatment conditions
2.5.2 对马铃薯冻融后水分分布的影响
低场核磁共振成像能够直观显示样品内部水分的空间分布。如图8伪彩色图像所示,颜色由蓝到红代表水分(氢质子)信号由弱到强[26]。空白对照组(图8-A)的红色区域面积最小,且分布不均匀,表明冻融后水分丢失严重,分布散乱。经市售AFP处理(图8-B)后,红色区域有所增加。而经12.5、37.5 mg/L DmAFP(图8-C～图8-D)或GaAFP(图8-E～图8-F)处理的马铃薯切片,其红色高水分区域面积显著增大,且分布更加均匀致密,尤以37.5 mg/L处理组最为明显。这直观地证明,AFPs处理能有效抑制冻融过程中冰晶生长和重结晶,减少细胞因冰晶挤压而破裂失水,从而更好地保持组织内部水分的完整性和均匀性,且融化冰晶中的水分在解冻过程中更容易被细胞基质或蛋白质重新吸收[27],与鸡肉持水性实验结果相互印证。
3 结论与讨论
本研究通过基因合成、载体构建、电击转化和多重筛选,成功获得了高效表达GaAFP和DmAFP的毕赤酵母工程菌株。通过对甲醇体积分数、pH和诱导时间的系统优化,建立了2种重组蛋白的高效发酵工艺,使GaAFP和DmAFP的产量分别达到115.4 mg/L和129.7 mg/L,并表现出0.83 ℃和0.92 ℃的THA,纯化后可达1.46 ℃和1.75 ℃(2 mg/mL)。应用研究表明,纯化后的重组AFP能显著改善冷冻鸡胸肉的持水性,降低解冻和蒸煮损失,并能有效维持马铃薯切片在冻融后的水分含量和均匀分布,其效果优于市售同类产品。本研究为利用毕赤酵母系统规模化生产高活性AFPs提供了完整的技术方案,并证实了其在食品冷冻保鲜领域的良好应用潜力,为后续产业化开发奠定了坚实基础。
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