食物过敏是由食物过敏原引起的一种不良的免疫反应,属于严重的公共卫生问题[1]。食物过敏反应涉及皮肤、呼吸、胃肠道、心血管及神经系统等多器官临床症状,严重时可危及生命。联合国粮农组织将甲壳类水产品等八类高致敏风险食品列为“八大食物过敏原”,90%以上过敏反应由这些食物引发[2]。在甲壳类水产品中,南美白对虾(Litopenaeus vannamei)作为全球主要养殖虾类之一,因肌肉组织中富含有优质蛋白质和多种矿物质被消费者广泛认可[3]。然而,虾类中含有多种过敏原蛋白,其中原肌球蛋白(tropomyosin,TM)被确认为其主要致敏成分,作为甲壳类水产品主要泛过敏原,可与72%～98%患者血清免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E特异性结合[4]。南美白对虾过敏原TM带来的安全风险限制了消费并危及公众健康,亟需发展高效消减其致敏性的技术。
当前降低过敏原的技术中,烹饪等传统物理方法可通过热变性改变过敏原的构象表位,但依赖外部热传导易导致受热不均,对热稳定性强TM效果有限;高压处理能通过破坏非共价键导致过敏原聚集,但设备成本高且可能引发脂质氧化等副反应[5];而冷等离子体、超声波、高压脉冲电场等新兴技术虽可通过空化效应或自由基氧化等效应改变表位,但普遍存在能耗高、对复杂食品基质适应性较差的问题[2,6-7]。相比之下,欧姆加热(ohmic heating,OH)因低能耗和高效整体加热成为新兴技术,其利用食品自身导电性使电能转化为热量,从而高效、快速、均匀地加热食物[8]。此外,OH是一种节能的食品加工方式,其热转换效率达90%以上,LI等[9]通过计算发现,在加热相同体积的蛋白溶液时,OH的加热速度约为传统水浴加热的19.2倍,同时能耗仅为水浴加热的1/121.6。OH的优势不仅在于高效节能,也体现在有效消减食品致敏性方面。OH已成功降低牛奶和牛肉致敏性[10-11],在水产品中也被证实OH可有效消减鳗鱼胶原蛋白和小清蛋白致敏性[9,12],但尚未见其在甲壳类水产品中的应用。
本研究系统评估了不同OH处理时间对南美白对虾TM免疫反应性及其构象变化的影响,以揭示OH处理诱导的蛋白结构变化规律。研究成果旨在为构建水产品过敏原的OH消减技术体系提供理论依据,并为开发低致敏性虾制品及探索OH技术与其他加工方法的协同增效作用拓宽技术路径,具有重要的理论参考与实践价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南美白对虾于2025年6月15日至7月14日期间购自中国上海市浦东新区芦潮港海鲜市场。虾的平均长度和平均质量分别为(12.55±0.15)cm和(11.75±0.20)g。
新西兰兔抗南美白对虾TM的IgG多克隆抗体,上海友科生物科技有限公司;虾过敏患者血清,PlasmaLab International;Tris-HCl、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾,上海傲益生物科技有限公司;三色预染蛋白Marker、2×蛋白上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、电泳缓冲液、SDS-PAGE预制胶(4%～20%),苏州艾伯朗克生命科技有限公司;柠檬酸钠、8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)、二硫苏糖醇,上海麦克林生物科技有限公司;山羊抗人IgE-HRP、山羊抗兔IgG-HRP,上海赫澎生物科技有限公司;脱脂乳粉,光明乳业股份有限公司;盐酸,上海吉至生化科技有限公司。所用试剂均为分析纯试剂。
1.2 仪器与设备
H1850R医用离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;Multiskan Go全自动酶标仪,美国赛默飞世尔科技有限公司;DYCZ-25垂直电泳仪,北京六一生物科技有限公司;TDGC-2kVA接触调压器,浙江德力西电气有限公司;DSC8500差式扫描量热仪、MP220 pH仪,上海梅特勒托利多国际贸易有限公司;F-4600荧光分光光度计,日立高技术公司;ZS90粒度分析仪,马尔文仪器有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计、AUW220D精密电子天平,日本岛津公司;DZF-6090减压干燥仪,上海徐爽电子公司;LA8080日立全自动氨基酸分析仪,日本东京日立制造所。
1.3 实验方法
1.3.1 虾TM的提取
根据HU等[13]的方法,略作修改,提取南美白对虾TM。将虾肉在预冷的PBS中均浆(1∶4,g∶mL),在4 ℃下以10 000×g 离心10 min,以除去肌浆蛋白。向沉淀物加入2倍体积的PBS,磁力搅拌使其充分溶解。随后,将沉淀分散在6倍体积的冷丙酮(-20 ℃)中,4 ℃ 下继续搅拌30 min,然后在4 ℃下以10 000×g 离心10 min后,收集沉淀。将蛋白沉淀转移至滤纸上,分散并置于通风橱中充分干燥。将沉淀物分散到Tris-HCl缓冲液中,并在4 ℃下搅拌12 h。离心后,用1 mol/L HCl溶液调节至pH 4.5进行等电点沉淀,磁力搅拌30 min后转移到4 ℃静置4 h。将收集的沉淀物再次溶解在PBS中,采用1 mol/L NaOH溶液将溶液pH值调整为7.6后,在搅拌下滴加饱和硫酸铵溶液,使饱和度达到41%,继续搅拌1 h。将混合物于4 ℃静置4 h,随后在4 ℃条件下以15 000×g离心15 min,收集沉淀。用超纯水复溶后,移入截留分子质量为10 kDa的透析袋中,于4 ℃下透析48 h。将透析后的蛋白溶液,沸水浴加热10 min,冷却后于4 ℃以15 000×g离心15 min,收集上清液经滤纸过滤,获得纯化的TM样品。最终样品经冷冻干燥后,于-80 ℃保存备用。
1.3.2 OH和水浴加热处理
将冻干后的TM用超纯水(Milli-Q)配制为TM溶液(1 mg/mL)。将TM溶液转移至由聚丙烯材料与绝缘胶带制成的欧姆加热室(尺寸20.0 mm×20.0 mm×20.0 mm,壁厚5.0 mm),两端安装钛电极板(尺寸20.0 mm×110.0 mm,厚度0.1 mm),电极间距20.0 mm。在120 V电压、50 Hz频率下进行OH处理,热电偶置于反应室中心监测温度变化。样品加热至100 ℃后分别维持10、30、50、70、90、110、130 min。
水浴加热组中,取样品置于8 mL玻璃管中,经100 ℃水浴处理70 min。随后,立即将玻璃管转移至冰水浴中冷却。冷却后,保存于4 ℃备用。
1.3.3 SDS-PAGE
参照YANG等[1]的方法进行电泳,略有修改。将TM与还原性蛋白上样缓冲液(2×)混合后,在100 ℃水浴加热5 min。将10 μL样品和5 μL marker加至SDS-PAGE预制胶(4%～20%)的上样孔中。将凝胶置于电泳槽内,加入电泳缓冲液使其完全浸没凝胶。在200 V恒定电压下电泳40 min。电泳结束后,对凝胶进行染色,并用去离子水脱色至条带清晰,最后进行凝胶成像分析。
1.3.4 ELISA
实验基于SONG等[14]的方法并加以改进。使用0.1 mol/L包被液[含0.16% Na2CO3、0.29% NaHCO3(均为质量分数),pH 9.6]将样品稀释至10 μg/mL充分混匀。将TM样品(10 μg/mL)包被于96孔板,4 ℃过夜。用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline with tween-20,PBST)溶液洗涤3次,每次30 s,加入5%的脱脂奶粉200 μL,37 ℃封闭2 h。分别加入100 μL虾过敏患者血清(1∶40,体积比,PBST稀释)/兔多克隆抗体(1∶40 000,体积比,PBST稀释),37 ℃孵育2 h后洗涤酶标板。加入100 μL山羊抗人IgE-HRP/山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000,体积比,PBST稀释),37 ℃孵育1.5 h后,进行洗板。加入100 μL四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)底物避光显色25 min,50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应,使用酶标仪测定450 nm吸光度值。
1.3.5 圆二色光谱(circular dichroism,CD)分析
将TM样品质量浓度调节至0.5 mg/mL,测定其190～260 nm的CD光谱,随后利用CDNN软件对蛋白质的二级结构组成进行定量分析。
1.3.6 内源和外源荧光光谱分析
按照ZHAO等[15]描述的方法,将TM样品质量浓度调节至0.5 mg/mL。使用荧光分光光度计,在激发波长280 nm下,于290～390 nm收集固有荧光发射数据;在外源荧光测量之前,将每份样品(2.0 mL)与25 μL 8.0 mmol/L ANS溶液避光孵育5 min。在激发波长380 nm下,于400～600 nm收集ANS荧光发射数据。激发和发射狭缝宽度均设定为5 nm。
1.3.7 紫外-可见分光光谱分析
使用紫外-可见分光光度计,将TM样品质量浓度调节至0.5 mg/mL,以超纯水作空白,测量260～360 nm处的吸光度。
1.3.8 粒径和电导率分析
TM样品溶液(0.5 mg/mL)的粒径和电导率在热平衡温度25 ℃下通过马尔文粒度分析仪测定。
1.3.9 差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)
使用差示扫描量热仪测量TM的热变性温度及热焓值。将TM样品精确称量5 mg至铝制坩埚中并密封,以空坩埚作为对照。实验条件为温度为20～200 ℃,恒定升温速率10 ℃/min。
1.3.10 总氨基酸含量测定
准确称取TM样品(20 mg),置于含有15 mL 6 mol/L HCl溶液的水解管中,加入4滴苯酚。将水解管抽真空10 min,然后在(110±1)℃下加热22 h。将溶液冷却至室温(25 ℃),转移至50 mL容量瓶中定容。取出1 mL水解产物并转移至干燥皿中。使用减压干燥器在50 ℃和0 MPa下进行减压干燥。干燥后,加入1 mL超纯水,并将混合物干燥。取2 mL柠檬酸钠溶液(pH 2.2)溶于干燥皿中,经0.22 μm滤膜过滤,转移至待测样品瓶中。采用超高速氨基酸自动分析仪进行测量。
1.4 统计分析
实验重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS Statistics 20.0软件进行统计分析。对不同处理组的数据进行比较时,使用单因素方差分析(ANOVA)结合邓肯多重比较检验进行事后分析,显著性水平设定为P<0.05。利用Origin 2024软件进行图表绘制。
2 结果与分析
2.1 蛋白纯度分析
为验证TM的分离纯化效果并评估其作为研究对象的适用性,本研究通过SDS-PAGE对不同提取阶段的蛋白组分进行分析(图1)。去除肌浆蛋白后,肌原纤维蛋白粗提物显示多条条带,可能包括肌球蛋白重链(约245 kDa)、肌动蛋白(约43 kDa)及TM(约34 kDa)等[16]。经等电点沉淀后约245 kDa条带消失,表明肌球蛋白重链在该步骤被有效去除,但样品中仍残留肌动蛋白等杂蛋白。最终的纯化TM(经过硫酸铵沉淀并去除热敏蛋白后)仅显示约34 kDa的单一主条带,这与杨玉莹等[17]的研究一致,证实获得了高纯度的TM蛋白,可用于后续OH处理。
泳道M:Marker,泳道1～3依次为肌原纤维蛋白、经等电点沉淀后的蛋白、纯化TM。
图1 不同提取步骤下TM的SDS-PAGE
Fig.1 SDS-PAGE of TM under different extraction steps
2.2 IgG/IgE结合能力分析
为了探究OH处理对南美白对虾TM致敏性的影响,本研究采用多克隆抗体和虾过敏患者的血清,通过ELISA分析了TM的IgG/IgE结合能力。与对照组(100.00%)相比,OH处理10、30、50 min后,TM的IgG结合能力分别降至94.07%、89.08%和84.60%,至70 min时显著降至73.24%(图2-a)。同样,其IgE结合能力亦同步下降至93.03%、88.99%、83.68%,并于70 min时降至70.21%(P<0.05)(图2-b)。结果表明,70 min是OH处理降低TM致敏性的关键时间节点。此后继续加热至130 min,IgG、IgE结合能力的下降趋势趋于稳定。综合考虑致敏性降低效果与能耗,在本实验条件下,70 min为最优处理时间。与之相比,传统水浴加热(70 min)则使其IgG、IgE结合能力小幅上升至105.67%和101.3%。这种差异主要源于二者加热机理的不同:水浴加热依赖于由表及里的热传导,其相对缓慢的升温过程可能仅引起蛋白质的部分变性,反而暴露出潜在抗原表位;而OH处理通过内部快速的焦耳热效应,能实现更均匀、高效的内部加热,可能使TM的二级和三级结构发生更彻底、不可逆的变性、聚集或降解,从而破坏其构象表位和线性表位[9]。此外,IgG结合能力的检测通常反映抗原的整体免疫原性,而IgE结合能力则反映I型超敏反应。二者呈现出的同步下降趋势,有力地证明OH处理降低了其一般免疫原性和特异性致敏性。
a-IgG 结合能力;b-IgE 结合能力
图2 不同OH处理时间下TM的IgG和IgE结合能力
Fig.2 IgG-and IgE-binding capacity of TM under different OH treatment times
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)。
LI等[12]通过OH处理鳗鱼小清蛋白时,同样发现经OH处理后,小清蛋白的IgG、IgE结合能力显著下降。上述结果表明,随着OH处理时间的延长,蛋白质与特异性抗体结合的变化趋势可能归因于蛋白质构象的变化。因此,在OH处理过程中,探索TM构象演变与致敏性之间关系的机制至关重要[13]。
2.3 SDS-PAGE分析
为了探究OH处理过程中分子质量的变化,本研究采用SDS-PAGE检测不同OH处理时间下TM的条带变化。图3显示,随着OH处理时间的延长,TM条带逐渐弥散、强度减弱,但分子质量并未发现明显变化。该现象可能由于OH处理过程中产生的焦耳加热和电场效应,主要是破坏TM分子内的非共价键相互作用,而对共价键没有明显的影响[18]。因此,后续对OH处理后TM的二、三级结构进行测定分析,探究OH对TM结构的影响。
图3 不同OH处理时间下TM的SDS-PAGE
Fig.3 SDS-PAGE profile of TM under different OH treatment times
2.4 CD光谱分析
本研究通过CD光谱检测了不同OH处理时间下TM的二级结构变化。如图4-a所示,CD光谱呈现1个正峰和2个负峰,表现出TM典型的α-螺旋结构特征[19]。图4-b显示,对照组TM的二级结构以α-螺旋为主,其含量为96.56%,这与SUN等[20]对南美白对虾TM的研究结果大致相同,共同支持了TM天然构象以α-螺旋为主导的结论。随着OH处理时间的延长,TM在208 nm和222 nm处的负峰强度下降。相较于未处理组,α-螺旋含量下降至51.00%。这可能是由于电场驱动下的快速均匀加热促使TM的α-螺旋结构部分解折叠,同时分子内氢键断裂和重排,进而可能导致了β-折叠和β-转角结构的形成[21]。
a-CD光谱;b-二级结构含量
图4 不同OH处理时间下TM的CD光谱和二级结构含量
Fig.4 CD spectra and secondary structure content of TM under different OH treatment times
上述变化表明,TM在加热过程中发生了从有序向无序结构的转变,其结构稳定性下降。使得TM致敏表位被破坏或遮盖,从而降低其致敏性。亢帅等[22]在研究美拉德反应处理对四角蛤蜊TM的影响时也观察到类似现象,即α-螺旋结构减少伴随致敏性下降。
2.5 内源和外源荧光光谱分析
内源性荧光是指蛋白质中的芳香族氨基酸在280 nm光激发下所产生的荧光,其变化可有效反映蛋白质三级结构的变化[23]。如图5-a所示,在0～90 min的加热时间下,TM的内源荧光强度呈现逐渐下降趋势,从未处理组的2 250降至90 min处理组的1 113。这一变化主要源于OH处理的热效应与电场效应破坏了维持蛋白质的氢键和疏水相互作用,导致蛋白质去折叠和空间构象展开,原本包埋于疏水内部的色氨酸发生碰撞猝灭,从而引起荧光强度降低[24]。值得注意的是,当OH处理时间进一步延长至130 min时,荧光强度并未持续下降,反而回升至1 416。该现象可能与蛋白质聚集行为有关,蛋白质分子形成聚集体,使色氨酸残基被重新包埋于疏水核心区域,脱离猝灭环境,导致荧光强度恢复[2]。这一聚集过程也与后续粒径检测中观察到的粒径随加热时间延长而增加的结果相一致。此外,荧光发射峰发生蓝移(从307 nm移至304 nm),表明氨基酸微环境的局部疏水性可能增强,外源荧光分析中观察到的表面疏水性增加也支持这一点。
a-内源荧光;b-外源荧光
图5 不同OH处理时间下TM的内源荧光和外源荧光
Fig.5 Intrinsic and extrinsic fluorescence spectra of TM under different OH treatment times
基于ANS与蛋白质疏水基团结合后荧光强度显著增强的特性,可通过荧光光谱法表征蛋白质表面的疏水性及其构象变化[25]。如图5-b所示,未处理组在520 nm处显示出一个低强度的特征峰,这表明ANS难以接触其天然构象中高度折叠的疏水核心区。随着OH处理时间的延长至90 min,最大荧光强度从未处理组的394显著上升至505(P<0.05),同时最大吸收峰发生红移(518 nm到528 nm)。这种变化可能是由于OH处理提供的热效应为破坏维持蛋白质高级结构提供了所需的热能,从而加速了其天然的α-螺旋结构的解体[26]。这一结构展开过程使原本包埋在分子内部的疏水性氨基酸残基大量暴露出来,为ANS探针提供了更多的结合位点,从而导致荧光强度急剧上升。本研究前期观察到的α-螺旋含量显著降低和内源荧光强度减弱,为这一分子解折叠的机制提供了有力的佐证。
ZHAO等[15]采用木糖对南美白对虾TM进行糖基化时,发现内源性荧光强度显著下降,表明蛋白质三级结构发生展开,同时在ANS外源荧光光谱中发现荧光强度增加并伴随红移,表明疏水基团掩盖,且其免疫分析进一步证实此类构象改变可降低TM的IgE结合能力,该结构变化与本研究OH处理所观察到的现象一致,这共同说明蛋白质三级结构的变化通过破坏其原有空间构象,特别是IgE抗体识别的构象表位,从而构成致敏性显著下降的分子基础。
2.6 紫外吸收光谱分析
紫外吸收光谱可表征蛋白质微环境的变化,可用于研究溶液状态下蛋白质的空间构象。如图6所示,未经处理的TM在290 nm处有最大吸收峰,这主要归因于蛋白质分子中芳香族氨基酸残基的π→π*跃迁。然而,经过OH处理后,所有处理组的最大吸收峰均发生了显著的蓝移,移动至约275 nm处,并且随着OH处理时间的延长,吸收峰强度呈现出明显的下降趋势。这种现象表明,经OH处理后,作为生色团的芳香族氨基酸残基其微环境发生改变,极性增大[27]。同时,蛋白质发生解折叠而伸展,进而通过增强的疏水相互作用与共价交联导致了分子间聚集体的形成,这种聚集在一定程度上掩蔽了部分生色团,降低了总体的吸光度。另一方面,长时间的高温和电场作用可能引起芳香族氨基酸侧链的氧化或降解,从而减少了有效生色团的数量。后续的氨基酸检测中,氨基酸含量降低也可以论证这一观点。
图6 不同OH处理时间下TM的紫外吸收光谱
Fig.6 UV absorption spectra of TM under different OH treatment times
2.7 粒径分析
蛋白粒径是指蛋白质分子聚集形成颗粒的大小,蛋白质的功能特性受蛋白粒径的影响[28]。如图7所示,随OH处理时间的延长,TM溶液的平均粒径呈现出持续增大的趋势,从初始的2 152 nm增长至130 min后的2 563 nm,这表明OH处理诱导了TM分子发生聚集。这种现象的原因可能在于OH作为一种高效的内部加热技术,快速且均匀的热效应剧烈地破坏了维持TM天然构象的非共价键。大量的热能输入导致TM的α-螺旋结构发生解旋和伸展,这与在CD光谱观察到的α-螺旋二级结构含量显著降低的结果吻合。赵康妤等[29]在通过热处理菜籽蛋白同样发现,加热会导致大量蛋白分子聚集形成大的蛋白聚集体,此结论与本研究结论一致。蛋白质在聚集的过程中,通过空间位阻效应,有效掩蔽或破坏了TM分子表面的线性及构象表位,最终降低了致敏性。
图7 不同OH处理时间下TM的粒径
Fig.7 Particle size of TM under different OH treatment times
2.8 电导率分析
本研究采用电导率检测,探究OH处理过程中电物理特性的变化。如图8所示,随OH处理时间延长,电导率从未处理组的0.64 s/m上升至130 min处理组的0.73 s/m,表明蛋白溶液离子迁移能力增强,可能因电场作用下分子极性基团暴露或部分结构展开导致了导电网络形成[30]。LI等[9]在通过OH处理鳗鱼鱼皮胶原蛋白时,也观测到了类似的现象,并同样发现蛋白致敏性下降的趋势。
图8 不同OH处理时间下TM的电导率
Fig.8 Conductivity of TM solution under different OH treatment times
2.9 DSC检测
通过分析热变性温度和热焓值,从热力学的角度阐明了TM的结构修饰。如图9所示,热变性温度在加热10 min后降至101.98 ℃,暗示短时OH处理可能先破坏了TM的低稳定性结构域,导致部分结构解折叠,使其热稳定性暂时降低[31]。随着加热时间延长(20～130 min),热变性温度回升至156.68 ℃(90 min)并最终达到151.86 ℃(130 min),热焓值也波动性增加,最高至199.5 J/g(130 min),这表明,电场与热的综合作用提高了TM的热稳定性。这可能源于OH处理诱导蛋白分子重排,形成新的、更稳定的高级聚集体结构,这促使蛋白质分子形成更大的聚合物从而提高了整体热稳定性[29]。该过程已通过实验中样品粒径随OH处理时间延长而增大的现象得到验证。
图9 不同OH处理时间下TM的DSC谱图
Fig.9 DSC thermograms of TM under different OH treatment times
2.10 总氨基酸检测
总氨基酸检测是为了更好地理解TM的一级结构和线性表位的修饰。如图10-a所示,与未处理组相比,OH处理10 min时所有氨基酸含量均出现显著下降,至30 min时再次显著下降(P<0.05),而30～130 min期间的下降幅度较小。这种下降可能是由于在加热初期(0～30 min)OH处理持续的热效应和电场效应导致氨基酸的分解和内部脱水,导致部分氨基酸聚合成多聚体或形成共聚物。经过长时间的高温处理,这些物质分解成氮氧化物、二氧化碳和水[12]。如图10-b所示,OH处理显著影响了所有类型的氨基酸,这可能与高温下含氮化合物的变化有关。氨基酸的氨基和羧基可能发生位置异构化以生成异构体,而脱氨和脱羧基可以将氨基酸转化为挥发性化合物,如碳氢化合物、醛和胺[1]。
a-各氨基酸含量的变化;b-不同类型氨基酸的变化(1-总氨基酸;2-必需氨基酸;3-非必需氨基酸;4-非极性氨基酸;5-极性不带电荷的氨基酸;6-酸性氨基酸;7-碱性氨基酸)
图10 不同OH处理时间下TM的总氨基酸含量的变化
Fig.10 Changes in total amino acid content of TM under different OH treatment times
此外,OH处理130 min后,TM的谷氨酸含量相较于未处理组由8.77 g/100 g显著降低至3.34 g/100 g。LIU等[32]的研究表明,在TM中鉴定出的7个致敏性关键氨基酸残基中,有5个是谷氨酸。本研究中谷氨酸含量的显著下降,为证明OH处理可通过破坏或掩盖这些关键致敏表位、从而降低TM的IgG/IgE结合能力提供了直接的证据。此外,天冬氨酸和亮氨酸作为另外2种关键氨基酸,其含量也呈现显著下降趋势(P<0.05),进一步说明OH处理可能通过影响多种氨基酸残基的结构完整性,共同导致TM过敏原性的降低[33]。
3 结论
本研究证实,OH处理能有效改变南美白对虾TM的结构并降低致敏性。通过综合运用SDS-PAGE、CD光谱、内源/外源荧光光谱、紫外光谱、粒径分析、DSC及氨基酸分析等技术对处理前后的TM进行系统分析。结果表明,随着OH处理的时间延长,TM的IgG和IgE结合能力呈下降趋势,在70 min时分别降至未处理组的73.24%和70.21%,值得注意的是,延长处理时间至130 min,其结合能力未出现显著进一步下降,因此,70 min可被视为本实验条件下的最优处理时长。蛋白结构分析中,OH处理引起其α-螺旋结构发生解折叠,内源荧光发生猝灭,表面疏水性增加,蛋白质分子发生展开和聚集,导致粒径增大。同时,全部氨基酸组分的含量均下降,其中谷氨酸、天冬氨酸与亮氨酸等关键氨基酸的减少,为其线性表位被破坏提供证据。这些结构变化导致TM致敏表位的掩蔽或破坏,从而显著降低了其与IgE和IgG的结合能力。本研究为OH技术应用于水产品过敏原的控制奠定了理论基础,对今后开发低致敏性虾制品以及探索OH技术与其他方法的联合处理提供了重要参考。
[1] YANG C Y,LI X M,DENG Y,et al.Effects of high voltage pulsed electric field on structural properties and immune reactivity of arginine kinase in Fenneropenaeus chinensis[J].Food Chemistry,2024,449:139304.
[2] DASANAYAKA B P,LI Z X,MOHAMMED AHMED A M,et al.Different antibody reactivity and its implications in allergen detection in processed fish[J].ACS Food Science &Technology,2024,4(3):700-710.
[3] 张亚瑾.南美白对虾的射频解冻均匀性及品质研究[D].上海:上海海洋大学,2022.ZHANG Y J.Study on the radio frequency thawing uniformity and quality of Litopenaeus vannamei[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2022.
[4] RUETHERS T,TAKI A C,JOHNSTON E B,et al.Seafood allergy:A comprehensive review of fish and shellfish allergens[J].Molecular Immunology,2018,100:28-57.
[5] JIANG H,ZHANG Z Y,WANG Y T,et al.Effects of high hydrostatic pressure treatment on the antigenicity,structural and digestive properties of whey protein[J].LWT,2023,178:114628.
[6] ZHONG H Y,TANG C D,LI J L,et al.Ultrasound-assisted cold plasma treatment reduces resistance to in vitro digestion of tropomyosin and allergenicity of tropomyosin digestion products[J].Food Chemistry,2025,473:143049.
[7] JIANG S S,HUANG Y T,WANG T,et al.Ultrasound assisted glycation decreased the potential allergenicity through changing epitope and structures of Ses i 3[J].Food Research International,2025,204:115932.
[8] 蒋蝉聪.南极磷虾虾砖的通电解冻特性和鰤鱼的通电加热模拟研究[D].上海:上海海洋大学,2021.JIANG C C.Study on ohmic thawing characteristics of Antarctic krill shrimp(Euphausia superba)bricks and ohmic heating simulation of yellowtail(Seriola quinqueradiata)[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2021.
[9] LI X M,DENG Y,QIU W Q,et al.Alteration of collagen thermal denaturation,structural and the abrogation of allergenicity in eel skin induced by ohmic heating[J].Food Chemistry,2022,391:133272.[10] PEREIRA R N,RODRIGUES R M,RAMOS 
L,et al.Electric field processing:Novel perspectives on allergenicity of milk proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018,66(43):11227-11233.
[11] TIAN X J,WU W,YU Q Q,et al.Quality and proteome changes of beef M.longissimus dorsi cooked using a water bath and ohmic heating process[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies,2016,34:259-266.
[12] LI X M,DENG Y,QIU W Q,et al.Effects of different ohmic heating treatments on parvalbumin structure and reduction of allergenicity in Japanese eel(Anguilla japonica)[J].Food Chemistry,2024,432:137257.
[13] HU X F,WANG H,HU Y M,et al.Modulating allergenicity of prawn tropomyosin(Penaeus chinensis)via pulsed electric field-induced conformational changes[J].Food Chemistry,2025,463(Pt 3):141376.
[14] SONG Y N,LI Z X,LIN H,et al.Effect of malondialdehyde treatment on the IgE binding capacity and conformational structure of shrimp tropomyosin[J].Food Chemistry,2015,175:374-380.
[15] ZHAO J L,WANG J,XU L L,et al.Insights into the mechanism underlying the influence of glycation with different saccharides and temperatures on the IgG/IgE binding ability,immunodetection,in vitro digestibility of shrimp(Litopenaeus vannamei)tropomyosin[J].Foods,2023,12(16):3049.
[16] 冯洁,费雨萱,周锦均,等.真空低温烹饪对南美白对虾肌原纤维蛋白结构的影响[J].食品科学,2025,46(20):268-276.FENG J,FEI Y X,ZHOU J J,et al.Effect of sous vide on the structure of myofibrillar protein from Penaeus vannamei[J].Food Science,2025,46(20):268-276.
[17] 杨玉莹,李言初,刘家彤,等.超声联合高压CO2处理对虾原肌球蛋白结构和致敏性的影响[J].食品科学,2025,46(16):295-303.YANG Y Y,LI Y C,LIU J T,et al.Effect of combined ultrasound and high pressure CO2 treatment on the structure and allergenicity of shrimp tropomyosin[J].Food Science,2025,46(16):295-303.
[18] SEREECHANTARERK C,HONGSPRABHAS P,CHANPUT W,et al.Effects of ohmic heating on structural and physicochemical changes of whey proteins[J].Agriculture and Natural Resources,2021,55(3):464-472.
[19] YUAN F Z,LV L T,LI Z X,et al.Effect of transglutaminase-catalyzed glycosylation on the allergenicity and conformational structure of shrimp(Metapenaeus ensis)tropomyosin[J].Food Chemistry,2017,219:215-222.
[20] SUN Q F,XIA F,LI M S,et al.Effects of glycosylation combined with phosphate treatment on the allergenicity and structure of tropomyosin in Litopenaeus vannamei[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2024,72(32):18181-18191.
[21] SAIN M,MINZ P S,JOHN H,et al.Effect of ohmic heating on food products:An in-depth review approach associated with quality attributes[J].Journal of Food Processing and Preservation,2024,2024:2025937.
[22] 亢帅,何欣蓉,李东晓,等.美拉德反应对四角蛤蜊原肌球蛋白免疫结合活性的影响[J].食品科学,2023,44(16):16-24.KANG S,HE X R,LI D X,et al.Effect of Maillard reaction on tropomyosin immunoreactivity in Mactra veneriformis[J].Food Science,2023,44(16):16-24.
[23] LYU L T,LIN H,LI Z X,et al.Changes of structure and IgE binding capacity of shrimp(Metapenaeus ensis)tropomyosin followed by acrolein treatment[J].Food &Function,2017,8(3):1028-1036.
[24] 卢忆,戴妍,杜新,等.欧姆加热不同电压与终温对羊肉蛋白质降解及肉品品质的影响[J].现代食品科技,2015,31(11):196-202;318.LU Y,DAI Y,DU X,et al.Effect of different voltages and end-point temperatures on protein degradation in lamb meat and meat quality during ohmic heating[J].Modern Food Science and Technology,2015,31(11):196-202;318.
[25] 杨欢欢,席俊,范雨函,等.烘烤对花生过敏原Ara h 3抗原性及蛋白结构的影响[J].中国油脂,2025,50(10):38-44.YANG H H,XI J,FAN Y H,et al.Effect of roasting on antigenicity and protein structure of peanut allergen Ara h 3[J].China Oils and Fats,2025,50(10):38-44.
[26] 丛海花,崔保威,张紫薇,等.新型电物理加工对多尺度蛋白质结构的影响研究进展[J].食品科学,2023,44(13):261-271.CONG H H,CUI B W,ZHANG Z W,et al.Research progress on the effect of new electrophysical processing on multiscale protein structure[J].Food Science,2023,44(13):261-271.
[27] RODRIGUES R M,VICENTE A A,PETERSEN S B,et al.Electric field effects on β-lactoglobulin thermal unfolding as a function of pH—Impact on protein functionality[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies,2019,52:1-7.
[28] 王涛,王丹琳,何静,等.不同热处理对脱脂驼乳乳蛋白结构和理化性质的影响[J].食品科学,2024,45(24):195-201.WANG T,WANG D L,HE J,et al.Effects of different heat treatments on the structure and physicochemical properties of proteins from skimmed camel’s milk[J].Food Science,2024,45(24):195-201.
[29] 赵康妤,杨萍,马俊坤,等.超声协同热处理对菜籽蛋白结构及溶解性的影响[J].食品科学,2025,46(1):100-107.ZHAO K Y,YANG P,MA J K,et al.Effect of ultrasonic-assisted thermal treatment on the structure and solubility of rapeseed protein[J].Food Science,2025,46(1):100-107.
[30] 姚黄兵.脉冲电场解冻猪里脊肉的效果及品质研究[D].无锡:江南大学,2024.YAO H B.Study on the effect and quality of pulsed electric field thawing on pork loin[D].Wuxi:Jiangnan University,2024.
[31] ZHANG M,ZHU S R,LI Q,et al.Effect of thermal processing on the conformational and digestive properties of myosin[J].Foods,2023,12(6):1249.
[32] LIU M,HAN T J,HUAN F,et al.Effects of thermal processing on the allergenicity,structure,and critical epitope amino acids of crab tropomyosin[J].Food &Function,2021,12(5):2032-2043.
[33] 张自业.基于糖基化修饰消减秀丽白虾原肌球蛋白致敏性及免疫脱敏机理研究[D].无锡:江南大学,2019.ZHANG Z Y.Study on desensitization mechanism and reduction of allergenicity of Exopalaemon modestus tropomyosin based on glycation modification[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.