副干酪乳酪杆菌SMN-LBK及其复合制剂缓解小鼠便秘症状的研究

便秘是一种常见的功能性胃肠道疾病,其症状为排便困难、频率少、大便干燥和排便不完全等。全球成人便秘发病率约为15.3%[1],便秘不仅导致生活质量下降,还与消化、呼吸、神经和心血管系统疾病有关[2]。目前,药物是治疗便秘的常用方法,但这种治疗伴随着副作用的风险,如泻药会造成水电解质紊乱、损伤肾功能以及药物依赖与心理并发症等[3]。因此,选择膳食干预策略是改善便秘的一种重要手段。

肠道微生物与便秘、腹泻等多种疾病的发生和发展密切相关,研究发现肠道菌群紊乱会导致便秘的发生[4]。研究表明,采用微生态制剂治疗慢性功能性便秘具有积极的临床疗效,其中益生菌、益生元、合生元在缓解便秘的相关疾病中发挥着巨大潜力[5]。益生菌具有调节和改善肠道菌群,增强肠屏障、免疫力和抗炎作用等多种功能。多糖能被肠道中特定的微生物发酵产生短链脂肪酸,有利于维持宿主肠道健康。联合膳食多糖与益生菌共同干预是改善健康的有效策略之一,雪莲果粉和益生菌(含有动物双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)联合作用显著降低了高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠的体重和上皮脂肪损失,同时也改善了空腹血糖、甘油三酯、炎症标志物和胰岛素信号的水平[6]。开心果皮多糖和乳酸片球菌复合使用已被证明可以通过调节TNF-α、IL-1β、IL-10的表达水平及其相关的抗氧化酶活性提高罗非鱼的生长速度和存活率[7]。副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)作为常见的益生菌,已被报道具有改善宿主的肠道环境、维持菌群结构平衡、促进肠道蠕动、调节免疫因子等优点[8-9]。副干酪乳酪杆菌SMN-LBK是从酸马奶中分离的一种革兰氏阳性菌,具有良好的耐酸、耐胆盐以及耐乙醇胁迫的能力[10],但其功能特性尚有待探究。

本研究旨在探究副干酪乳酪杆菌SMN-LBK及其与沙棘多糖复合制剂对缓解便秘的潜在益处。首先评估了副干酪乳酪杆菌SMN-LBK改善便秘的潜力,然后利用联合沙棘多糖制备复合制剂并探究其对便秘小鼠的粪便相关指标、小肠推进率、胃肠调节肽、结肠病理状况,肠道菌群及其代谢的影响,为开发新型缓解便秘的具备药食同源特性的功能性产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

副干酪乳酪杆菌SMN-LBK(保藏于中国典型培养物保藏中心,序列号:CCTCC M 2017429),石河子大学食品学院新疆特色微生物种质资源保藏中心;MRS培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;盐酸洛哌丁胺、匹可硫酸钠、阿拉伯胶、活性炭粉,上海麦克林生化科技股份有限公司;沙棘原浆,金华山食品有限公司;乙腈,美国赛默飞世尔科技公司;甲酸,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;甲酸铵,美国Sigma-Aldrich公司;ELISA试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;粪便基因组DNA提取试剂盒,北京全式金生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;SPX-150B-Z恒温生化培养箱、YXQ-70A立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;5425R台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;ENO酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;SCIENTZ-18 N冷冻干燥机,宁波新芝生物科技有限公司;Thermo Scientific Vanquish超高效液相色谱质谱仪,美国赛默飞世尔科技公司;7890B气相色谱仪,美国安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 副干酪乳酪杆菌SMN-LBK菌液的制备

使用MRS培养基培养副干酪乳酪杆菌SMN-LBK,培养条件:37 ℃培养16 h,然后于8 000 r/min离心10 min,收集菌体沉淀。利用无菌生理盐水重复洗涤3次后,重悬,然后按照体积比1∶1重悬于60%(体积分数)的新鲜甘油中,冻藏于-80 ℃的冰箱里备用,使用前通过平板计数法确定活菌数。

1.3.2 副干酪乳酪杆菌SMN-LBK复合制剂的制备

取一定的沙棘汁在5 000 r/min下离心10 min去除沙棘果渣、果油,用1.0 mol/L NaHCO3溶液调节沙棘原浆pH至6.0,与水混合制备10%(体积分数,下同)的沙棘多糖稀释液,75 ℃下杀菌15 min,获得沙棘多糖溶液。然后将10%的沙棘多糖溶液与培养后获得的副干酪乳酪杆菌SMN-LBK菌泥按照体积比1∶1混合均匀。在此基础上,将高温灭菌后的冻干保护剂(海藻糖10%、蔗糖15%、脱脂奶粉16%、山梨醇4%,质量分数)按照体积比1∶1混合与上述混合物混合,然后通过真空冷冻干燥机制备得到复合制剂。贮存于-80 ℃冰箱内备用。使用前通过平板计数及稀释的方法,使得灌胃小鼠所用复合制剂中副干酪乳酪杆菌SMN-LBK的活菌数为1×108 CFU。

1.3.3 动物实验设计

实验期间,所有小鼠均饲喂于屏障环境中,饲养环境严格控制:温度(25±2)℃、湿度(50±5)%,光照/黑暗各12 h,饲养期间小鼠自由进食进水,各组小鼠均饲喂标准饲料,所有动物实验均符合石河子大学生物伦理委员会所制定的伦理学标准(批件号:A2025-570、A2023-086)。

为了探究副干酪乳酪杆菌SMN-LBK是否具有缓解小鼠便秘的潜力,参考文献[11]的方法,将32只(6周龄)健康雄性无病原体(SPF)BALB/c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)适应一周后,随机分成4组(n=8/组):空白对照组(Control)、便秘模型组(Model)、阳性对照组(匹可硫酸钠,SP),副干酪乳酪杆菌组(SMN-LBK)。本实验共21 d,前7 d为适应期,第8天开始干预,第8～14天,Control组、Model组和SP组灌胃0.2 mL无菌生理盐水,SMN-LBK组灌胃0.2 mL(1×108 CFU)的副干酪乳酪杆菌SMN-LBK菌液。第15～21天进行造模,期间Control组灌胃0.2 mL无菌生理盐水,Model组、SP组、SMN-LBK组灌胃0.2 mL(10 mg/kg体重)的盐酸洛哌丁胺溶液。1 h后,Control组、Model组灌胃0.2 mL无菌生理盐水,SP组灌胃0.2 mL(0.52 mg/kg体重)匹可硫酸钠,SMN-LBK组继续灌胃0.2 mL(1×108 CFU)的副干酪乳酪杆菌SMN-LBK菌液。干预结束后收集小鼠粪便,-80 ℃冻存备用。第22天对小鼠进行处死,处死前各组小鼠禁食16 h,收集血清、结肠和盲肠等样本,-80 ℃冻存备用。

为了探究复合制剂缓解小鼠便秘效果,将32只(6周龄)健康雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠(河南斯克贝斯生物科技有限公司),适应一周后,随机分成4组(n=8/组):空白对照组(Control)、便秘模型组(Model)、阳性对照组(匹可硫酸钠,SP)和复合制剂组(sSMN-LBK)。本实验共15 d,前7 d为适应期,第8～15天为干预期。干预期间,Control组每天灌胃0.2 mL无菌生理盐水,Model组、SP组、复合制剂干预组均先灌胃0.2 mL(10 mg/kg体重)洛哌丁胺溶液,1 h后,Control组、Model组分别灌胃0.2 mL无菌生理盐水,SP组灌胃0.2 mL(0.52 mg/kg体重)匹可硫酸钠悬液,sSMN-LBK组灌胃0.2 mL(1×108 CFU)复合制剂溶液,共处理8 d。干预结束后收集小鼠粪便,于-80 ℃冻存备用,第16天处死小鼠,处死前各组小鼠禁食16 h,收集血清、结肠和盲肠等样本,-80 ℃冻存备用。

1.3.4 粪便含水率

定期收集小鼠粪便颗粒并称重,然后将粪便在烘箱中105 ℃烘干,直至30 min内恒重,粪便含水率的计算如公式(1)所示:

式中:W1,粪便湿重,g;W2,粪便干重,g。

1.3.5 首粒黑便时间及5 h粪便颗粒数

墨汁配制:将80 mL蒸馏水与10 g阿拉伯胶混合,煮沸至溶液透明,加5 g活性炭粉末,煮沸3次,放于室温下冷却,添加蒸馏水至100 mL,并在4 ℃冰箱中储存,使用前摇匀。

于实验结束前1 d,从灌墨汁开始,记录每只小鼠首粒排黑便时间、5 h内排黑便粒数。

1.3.6 小肠推进率

实验结束前一天晚上禁食过夜,Control组和Model组用墨汁灌胃,其余各组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁,30 min后对小鼠进行安乐死,剪取自幽门到回盲肠的肠管,小肠推进率的计算如公式(2)所示:

式中:L1,肠管长度为小肠总长度,cm;L2,从幽门到墨汁前沿为墨汁推进长度,cm。

1.3.7 小鼠血清及组织的采集

小鼠处死后收集血液,常温下通过3 000 r/min下离心15 min获得血清,-80 ℃冻存备用;结肠组织分为2部分,一部分于液氮中快速冷冻,收集后于-80 ℃冻存备用;另一部分保存至40 g/L的多聚甲醛溶液中,用于结肠组织病理学分析。

1.3.8 结肠组织学观察

将固定好的结肠组织取出,进行石蜡包埋、切片,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色。然后利用病理切片扫描仪观察结肠组织的病理学变化。

1.3.9 血清胃肠调节肽

按说明书用ELISA试剂盒测定兴奋性胃肠激素胃泌素(gastrin,Gas)、胃动素(motilin,MTL)、抑制性胃肠激素生长抑素(somatostatin,SS)及血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)水平。

1.3.10 肠道微生物的多样性及组成

利用粪便DNA提取试剂盒提取小鼠粪便DNA,对DNA的V3～V4区域使用通用引物(338F～806R)进行扩增。扩增产物使用磁珠纯化,纯化后的PCR产物进行Illumina PE250文库构建及测序(武汉百奥维凡生物科技有限公司)。测序完成后,利用Qiime2平台对其进行物种注释并分析肠道菌群的变化。通过Chao1、Shannon和Simpson指数表征肠道菌群α多样性的变化;利用主成分分析(principal component analysis,PCA)方法探究肠道菌群β多样性的变化;同时结合线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析不同组之间的差异菌群,并利用PICRUSt2(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states 2)对小鼠的肠道菌群基因功能进行预测[12]。

1.3.11 小鼠肠道菌群代谢产物的变化分析

代谢物数据采用公共数据库及自建标准品库等谱图数据库进行物质鉴定。具体方法见电子版增强出版方法1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.045179,下同)。代谢物结果采用R软件包Ropls[13]分别对数据进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)降维分析。用置换检验方法对模型进行过拟合检验。根据统计检验计算P值、OPLS-DA降维方法计算变量投影重要度(variable importancein projection,VIP)值,评估不同代谢物含量对样本分类判断的影响程度。当P值<0.05和VIP值>1.5时,认为代谢物分子具有统计学显著差异。采用MetaboAnalyst软件包对筛选的差异代谢物进行功能通路富集分析,并采用KEGG Mapper可视化工具进行差异代谢物与通路图的浏览。

1.3.12 短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)测定

称取盲肠内容物30 mg,加入1 500 μL超纯水和100 μL 250 g/L偏磷酸溶液。12 000 r/min离心15 min,使用0.22 μm水系针式过滤器过滤后获得上清液,上机测定。详见电子版增强出版方法2。

1.4 统计分析

实验结果以“平均值±标准差”表示,利用Graphpad prism 9.0作图并进行组间差异分析(单因素方差分析及Dunnett法事后多重比较检验),P<0.05被认为具有统计显著性。

2 结果与分析

2.1 副干酪乳酪杆菌SMN-LBK改善了小鼠便秘症状

为探究副干酪乳酪杆菌SMN-LBK对便秘小鼠症状的影响,通过体质量变化、5 h粪便颗粒数、首次黑便时间和小肠推进率进行评估。实验期内Model组小鼠在实验期间体质量下降,而其他组小鼠体质量增加;其中SP组和SMN-LBK组小鼠干预的第14天的体质量显著高于第1天的体质量(图1-a)。在体质量变化率方面,与Model组相比,其他组小鼠的体质量变化率显著提高(图1-b),说明副干酪乳酪杆菌SMN-LBK的膳食干预,有效地逆转了盐酸洛哌丁胺诱导的便秘小鼠的体质量减轻。为进一步评估副干酪乳酪杆菌SMN-LBK对便秘小鼠排便功能及肠蠕动能力的影响,测定了便秘小鼠5 h粪便颗粒数、首粒黑便时间和小肠推进率。与Control组相比,Model组小鼠5 h粪便颗粒数显著降低(图1-c),首粒黑便时间显著延长(图1-d)以及小肠推进率显著降低(图1-e),说明Model组小鼠便秘症状明显。SP和副干酪乳酪杆菌干预后,显著缓解了小鼠的便秘症状,小鼠5 h粪便颗粒数显著增加,首粒黑便时间显著缩短以及小肠推进率显著提高。使用3种乳酸菌联合发酵牛奶,可以缩短首次排黑便时间、增加5 h粪便颗粒数、提高小肠推进率等,有效的缓解了小鼠的便秘症状[14],这与本研究结果一致。

2.2 副干酪乳酪杆菌SMN-LBK调节了血清中VIP、MTL、SS和Gas的水平

胃肠道调节肽水平的高低对动物体内的肠道转运具有重要作用,抑制性神经递质VIP可松弛胃肠平滑肌、减慢蠕动;生长抑素SS广泛抑制胃肠分泌与运动;减少其他兴奋性激素释放;MTL兴奋性肽,能强烈收缩胃体及小肠,启动移行性复合运动;Gas刺激胃酸分泌并协同MTL增强胃肠蠕动[15]。为了评估胃肠道调节肽的变化,测定了血清VIP、MTL、SS和Gas的水平。结果表明,Model组小鼠血清中VIP水平与其他组小鼠相比无显著性变化,而SP和副干酪乳酪杆菌干预后,血清VIP水平下降,但无统计学显著性(图2-a)。与Model组小鼠相比,阳性药物SP和副干酪乳酪杆菌干预后显著降低了小鼠血清中SS的水平(图2-b)。此外,Model组小鼠血清中MTL及Gas水平较Control组均有所下降,阳性药物干预后,显著提高了小鼠血清中MTL和Gas的水平;而副干酪乳酪杆菌干预后也可显著提高血清中Gas的水平,同时也有利于提高MTL的水平,但无统计显著性(图2-c和图2-d)。综合说明,副干酪乳酪杆菌SMN-LBK干预可有效调节便秘小鼠的胃肠激素水平,有助于改善肠道动力功能。

2.3 副干酪乳酪杆菌SMN-LBK缓解了小鼠的结肠炎症

为探究副干酪乳酪杆菌SMN-LBK对便秘小鼠结肠病理症状的影响,通过HE染色观察小鼠结肠组织病理改变的情况。与Control组相比,Model组肠组织中可见局灶性糜烂,肠腺结构破坏,可见少量纤维结缔组织增生取代原有的肠腺结构,同时存在淋巴细胞浸润的情况(图2-e)。与Model组相比,SMN-LBK组肠组织中黏膜层向肠腔内突起形成皱襞,皱襞和杯状细胞数量丰富;固有层内肠腺数量丰富,排列密集,说明SMN-LBK干预后小鼠结肠结构完整,无显著炎症浸润,SMN-LBK的摄入可以有效保护肠道屏障的完整性。

2.4 复合制剂改善了小鼠的便秘症状

为了评估复合制剂是否具有缓解小鼠便秘症状的作用,本研究测量了小鼠的首粒排黑便时间、肠道推进率、粪便含水率及体质量的变化。与Control组相比,Model组小鼠的首粒排黑便时间显著延长(图3-a),SP组、sSMN-LBK组则显著缩短了小鼠的首粒排黑便时间。同时,与Control组相比,Model组小鼠的小肠推进率显著下降,而肠道蠕动缓慢是便秘的重要促成因素[16]。而阳性药物和复合制剂均可显著提高小鼠的小肠推进率(图3-b),其中sSMN-LBK组对小鼠小肠推进率有较好的促进作用。这些结果表明复合制剂具备调节小鼠的肠道蠕动及改善便秘的潜力。

通过分析小鼠的粪便含水率发现,与Control组相比,Model组小鼠的粪便含水率显著降低,阳性药物和复合制剂的处理则显著提高了便秘小鼠的粪便含水率(图3-c)。宋晓妍等[17]以黑茶和实验室保藏的植物乳植杆菌BC299以及商品化益生菌复配制备了益生菌复配黑茶及益生菌发酵黑茶,均能显著增加便秘小鼠粪便含水率,与本研究结果类似。同时评估了干预期间小鼠体质量的变化。各组小鼠体质量有不同程度的增加,且干预后,Model组小鼠的体质量显著大于SP组(图3-d),而与Control组和sSMN-LBK组无显著差异(P>0.05)。通过比较体质量变化率发现,Control组和sSMN-LBK组的体质量变化率无显著性差异(图3-e),表明复合制剂的干预对便秘小鼠的体质量无显著影响。综合来说,复合制剂具有提高小鼠粪便含水率的作用,从而有利于改善小鼠的便秘症状。

2.5 复合制剂的干预对血清中MTL、Gas、SS和VIP水平的影响

与Control组相比,Model组小鼠血清中SS和VIP水平显著升高而MTL、Gas的水平显著降低,复合制剂干预后显著逆转了胃肠道调节的水平(图4)。与副干酪乳酪杆菌单独作用相比,复合制剂调节胃肠道调节肽的能力存在差异。综合说明,复合制剂可通过调节兴奋性胃肠激素和抑制性胃肠激素的分泌水平,促进胃肠转运,有助于缓解便秘症状。

2.6 复合制剂缓解了小鼠的结肠炎症

Control组小鼠结肠组织的细胞排列规则,结构清晰完整,黏膜层和平滑肌层组织良好,而Model组小鼠的结肠组织细胞有一定的损伤,排列不规则,黏膜层和肌层厚度显著降低(图4-e)。复合制剂干预后,小鼠结肠黏液层厚度有所恢复,细胞状态改善并趋于正常化。复合制剂显著改善了便秘小鼠的结肠病理症状,有助于改善肠道炎症。

2.7 复合制剂重塑了小鼠肠道菌群的多样性及组成

为了分析复合制剂对便秘小鼠肠道菌群的影响,利用16S rRNA测序技术分析小鼠肠道菌群。结果发现,与Control组相比,Model组小鼠肠道菌群的α多样性指标(图5-a);而复合制剂干预后,小鼠肠道菌群的Simpson指数与Model组相比显著升高(P<0.05),说明复合制剂有助于提高小鼠肠道菌群的α多样性。通过PCoA分析发现,各组小鼠的微生物群落在空间上有一定的区分,说明各组小鼠肠道菌群结构存在较大的差异(图5-b)。进一步分析各组小鼠肠道菌群的组成变化发现,在门水平上,肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)组成,三者之和超过96%(图5-c)。与Control组相比,Model组Bacteroidetes、变形菌门(Proteobacteria)、脱硫菌门(Desulfobacterota)相对丰度升高,而Firmicutes相对丰度降低;复合制剂处理后,sSMN-LBK组小鼠肠道中则提高了Firmicutes和Verrucomicrobiota的相对丰度,降低了Bacteroidetes和Proteobacteria的相对丰度。在属水平上,与Control组相比,Model组小鼠肠道中梭菌纲UCG-014(Clostridia UCG-014)、毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae NK4A136)、未培养的颤螺旋菌科(Oscillospiraceae uncultured)、未培养的毛螺菌科(Lachnospiraceae uncultured)、另枝菌属(Alistipes)和Candidatus Saccharimonas的相对丰度降低(图5-d),而普雷沃氏菌科UCG-001(Prevotellaceae UCG-001)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、阿克曼菌属(Akkermansia)、理研菌科RC9(Rikenellaceae RC9 gut group)、真杆菌属([Eubacterium]coprostanoligenes group)、胃厌氧菌目(Gastranaerophilales)、副拟杆菌属(Parabacteroides)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的相对丰度升高。复合制剂则提高了有益菌Lachnospiraceae NK4A136 group、Oscillospiraceae uncultured、Lachnospiraceae uncultured、乳杆菌属(Lactobacillus)和Colidextribacter的丰度,降低了Alloprevotella、Ruminococcus、Prevotellaceae UCG-001、Akkermansia、Rikenellaceae RC9 gut group、Gastranaerophilales、[Eubacterium]coprostanoligenes group和Parabacteroides的水平。辣木叶可以通过降低功能性便秘小鼠肠道中Ruminococcus、Bacteroidetes、Alloprevotella的相对丰度,调节肠道菌群的组成,进而达到缓解功能性便秘症状[18]。值得注意的是,复合制剂干预后小鼠肠道中Akkermansia的相对丰度降低。Akkermansia被认为是新一批有抗炎性潜在的益生菌。但在分析对比223名帕金森患者及137名对照的肠道菌群,并综合4个已报道的数据集进行荟萃分析发现,Akkermansia、凯特百可特菌属(Catabacter)及阿克曼菌科(Akkermansiaceae)在帕金森患者中富集,而Akkermansia的增多与患者结肠运输缓慢和体重或脂肪量低有关[19],这与本研究结果类似。综上,复合制剂处理显著调节了小鼠的肠道菌群组成,提高了有益菌的丰度,从而重塑了便秘小鼠的肠道菌群的结构和组成。

为了进一步探究影响便秘的差异菌群,利用LEfSe分析发现,Model组小鼠肠道中显著富集了Alloprevotella、Parabacteroides、Bacteroidales uncultured和Prevotellaceae uncultured(图5-e),复合制剂处理则富集了Incertae Sedis、未培养的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae uncultured)、甲基戊糖梭菌(Clostridium methylpentosum group)、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、毛螺菌属(Lachnospiraceae)UCG 006、UCG 005和罗氏菌属(Romboutsia)。利用PICRUSt2对小鼠肠道菌群的基因功能进行了预测,结果发现sSMN-LBK组小鼠肠道微生物涉及膦酸盐和次膦酸盐代谢的基因功能显著上调(图5-f),而涉及脂多糖合成、硫辛酸代谢、钙离子信号途径和细胞凋亡等功能则在Model组上调。脂多糖被认为是高脂饮食、炎症、肥胖和代谢紊乱之间的关键纽带,便秘小鼠由于肠道菌群失衡,影响了肠道细菌脂多糖的合成,从而影响正常的肠道转运功能[20]。综上,复合制剂处理改变了肠道菌群的多样性、结构、组成及其基因功能,进而影响了其代谢活动。

2.8 复合制剂调节了小鼠肠道菌群的代谢

为了进一步分析复合制剂处理对便秘小鼠肠道菌群代谢活动的变化的影响,利用非靶向代谢组学分析其结肠内容物中代谢产物的变化。在正负离子模式下,通过OPLS-DA分析发现,Control组与Model组显著分离(附图1);同时,Model组与sSMN-LBK组也出现显著分离;经过置换检验后,随着置换保留度逐渐降低,Q2点的蓝色回归线与垂直轴(左侧)在零以下相交,说明原模型不存在过拟合现象(图6-a和图6-b)。通过比对数据库,从所有样品中共鉴定出643种有效代谢物,进一步以P<0.05,VIP值>1.5为筛选差异代谢物的条件,随后经过与数据库比对并鉴定,得到各组潜在的显著差异代谢物(图6-c)。在Control组与Model组的差异代谢物有76个,其中40个上调,36个下调(附表1)。在Model组与sSMN-LBK组中差异代谢物有48个,其中包括脱氧胆酸钠和13-L-羟基亚油酸等在内的39个物质上调,6-酮基-前列腺素F1a和2-甲氧基雌二醇在内的9个物质下调(附表1)。牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺酸、脱氧胆酸、环己基氨基磺酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、花生四烯酸和4-吡哆酸等与患者便秘症状存在密切的联系[21]。便秘女性血清中苯丙氨酸的水平显著降低,通过动物实验发现补充苯丙氨酸可以通过重塑肠道微生物群落的结构以及扭转血清代谢活动,发挥改善便秘症状的作用[22]。这些结果说明,复合制剂显著调节了便秘小鼠肠道菌群的代谢活动,并产生了具有缓解便秘的有效代谢产物,从而有利于改善肠道功能。

进一步将差异代谢物进行KEGG通路富集发现,亚油酸代谢、D-氨基酸代谢、精氨酸生物合成、ABC转运蛋白、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和β-丙氨酸代谢通路是主要的代谢通路(图6-d),表明这些潜在的代谢通路可能与便秘的发生与调节密切相关。在一项利用长双歧杆菌CCFM1112对56名慢性便秘患者进行膳食干预的队列中发现,经过4周的干预,长双歧杆菌CCFM1112可显著改善慢性便秘患者的生活质量及其大便硬度,同时提高了患者粪便中包括亚油酸在内多种代谢产物的水平[23]。此外,补充魔芋葡甘露糖可调节肠道菌群的苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成以及亚油酸代谢,从而缓解便秘的症状[24]。复合制剂的摄入影响了肠道微生物的亚油酸代谢以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,从而有利于改善小鼠的便秘症状。

2.9 复合制剂提高了小鼠粪便中SCFAs的水平

SCFAs是肠道菌群发酵碳水化合物产生的代谢产物,与肠道正常的生理活动密切相关,同时,SCFAs能够促进肠液分泌使肠道蠕动而缓解便秘。结果表明,与Control组相比,Model组小鼠肠道菌群代谢产生的乙酸水平降低,但无统计显著性(图7-a),而丙酸、丁酸和异戊酸的含量显著降低(图7-b、图7-c、图7-f);利用复合制剂干预后,丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的水平显著升高,但是对乙酸水平无显著影响(图7)。WANG等[25]发现膳食补充低聚果糖、低聚半乳糖和低聚异麦芽糖可显著调节肠道微生物群的组成,增加便秘小鼠粪便中SCFAs的浓度,从而有利于改善小鼠的便秘症状。此外,乙酸、丙酸和丁酸可以通过诱导结肠GLP-1分泌间接影响小鼠肠道运动,同时异戊酸被证明直接作用于离体结肠平滑肌,并通过蛋白激酶A途径引起肌肉松弛[26]。综合说明复合制剂可通过提高小鼠肠道中SCFAs的水平对便秘症状的缓解具有积极的影响。

3 结论

通过分析副干酪乳酪杆菌及其复合制剂对便秘小鼠的表征指标、胃肠调节肽、结肠病理状况等的影响,本研究侧重探讨了副干酪乳酪杆菌SMN-LBK及其复合制剂缓解便秘症状的潜力。副干酪乳酪杆菌SMN-LBK和复合制剂可以显著缩短首粒黑便时间、提高小肠推进率、调节胃肠调节肽的水平,同时恢复了结肠组织的病理损伤。此外,复合制剂增加了小鼠肠道中有益细菌(如Lactobacillus、Colidextribacter)的丰度,同时减少有害细菌如Alloprevotella的数量,改变了肠道微生物群的组成,进而影响了肠道菌群亚油酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及SCFAs水平。然而,本研究存在两方面的局限,由于在评估复合制剂是否具有缓解便秘作用的研究中并未单独设定沙棘多糖干预组,一方面导致了在机制探究中难以排除沙棘多糖单独作用对实验结果的影响;另一方面,难以明确副干酪乳酪杆菌SMN-LBK与沙棘多糖的协同作用。未来研究的机制研究将通过增加沙棘多糖单独干预组别,从临床症状改变、肠道菌群组成及其代谢等方面明确沙棘多糖对小鼠便秘症状的影响,最终阐明副干酪乳酪杆菌SMN-LBK及其沙棘多糖复合制剂缓解便秘的作用机制。总的来说,副干酪乳酪杆菌SMN-LBK及其复合制剂均显示出作为缓解便秘的替代治疗策略的潜力。这为开发新的通过益生菌干预缓解便秘的新型安全策略提供理论支撑。然而对于副干酪乳酪杆菌SMN-LBK和复合制剂缓解便秘的作用机制,尚需进一步地探究。

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