螺旋藻(Spirulina)作为一种重要的微藻资源,被公认为是一种优质的“超级食品”,其富含高达60%～70%的蛋白质、多种维生素、矿物质以及藻蓝蛋白、β-胡萝卜素等生物活性物质,在增强免疫力、抗炎抗氧化及预防慢性疾病方面展现出巨大潜力[1]。然而,其强烈的藻腥味、苦涩口感的问题,严重制约了其在常规食品中的消费接受度与高值化应用[2]。因此,开发能够同步改善螺旋藻感官属性并提升其营养效价的绿色加工技术,成为当前产业与学界关注的焦点。
微生物发酵技术是改良食品原料品质的有效策略。目前,利用乳杆菌或酵母等单一菌种发酵螺旋藻的研究已有报道,但其在风味复杂性与功能增效上仍存在局限[3]。与单一发酵相比,多菌种顺序发酵策略通过模拟自然发酵中的微生物生态演替,能够实现菌种间功能的时空互补与协同增效[4]。马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)作为一种安全、快速的增殖菌种,具备卓越的产酶(蛋白酶、纤维素酶等)能力,可有效降解螺旋藻细胞壁,释放营养物质,并合成芳香酯类等风味前体物质[5]。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)则以其强大的产酸能力和益生特性著称,能够进一步稳定发酵体系,并通过酯化等反应丰富风味轮廓[6]。然而,将两者结合,利用其“代谢接力”式的顺序发酵模式,系统性地重塑螺旋藻的风味与功能品质,其协同作用机制与增效潜力尚待深入探究。
基于此,本研究创新性地采用从传统发酵食品中筛选的多株马克思克鲁维酵母与植物乳植杆菌,构建特定复配组合,对新鲜螺旋藻采用酵母-乳杆菌的顺序发酵策略。本研究旨在通过系统监测发酵过程中微生物群落动态、理化特性、抗氧化活性(DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、羟自由基清除率及总酚、总黄酮含量)及挥发性风味物质的演变,并结合感官评价,全面阐释该顺序发酵策略对螺旋藻风味与营养品质的协同提升机制。本研究不仅为螺旋藻的高值化加工提供了新路径,也为发酵技术在微藻资源中的实际应用提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜螺旋藻泥,培养收获于郑州大学化工学院的75 L微藻养殖光反应器中,藻泥收获后直接用于发酵实验。4株马克思克鲁维酵母(编号KA、KB、KC和KD)由本实验室从不同奶制品中分离、鉴定并保藏。4株植物乳植杆菌(编号L1、L6、L12和L16)由本实验室从不同来源的泡菜中分离、鉴定并保藏。
葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、氢氧化钠,国药集团化学试剂有限公司;3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、没食子酸、芦丁标准品,麦克林生化技术有限公司;YPD培养基、MRS培养基,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
IS-RDS6多层恒温培养摇床,美国精骐有限公司;JC-150-GE光照培养箱,青岛精诚仪器仪表有限公司;Entris®Ⅱ分析天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台,江苏迅迪仪器科技有限公司;PHBJ-260台式酸度计,上海欧史拓尔实业有限公司;UV-3600Plus紫外-可见分光光度计,日本岛津公司;Infinite M Plex多功能酶标仪,帝肯实验室设备有限公司;1260 InfinityⅡ Prime高效液相色谱,安捷伦科技(中国)有限公司;7000D三重串联四极杆气质联用仪,美国Agilent公司;CR-410色差仪,日本柯尼卡美能达公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌株活化与发酵液制备
将马克思克鲁维酵母接种于YPD液体培养基中,30 ℃静置培养24 h,连续活化2代。将植物乳值杆菌接种于MRS液体培养基中,37 ℃静置培养24 h,连续活化2代。将新鲜螺旋藻配制成质量浓度为60 g/L的悬液,然后加入葡萄糖至其终质量浓度为30 g/L。混合均匀后,直接用于后续发酵。
1.3.2 顺序发酵流程
基于预实验的筛选,得到4种较好的菌种配方(KAL1、KBL16、KCL6、KDL12),将活化后的酵母菌液以4 000 r/min离心5 min,用无菌生理盐水重悬,调整菌液浓度至约6.0 lg CFU/mL。同法制备植物乳植杆菌菌悬液。第一阶段发酵(0～24 h):在无菌条件下,向200 mL螺旋藻发酵基质中接种2%(体积分数)的酵母菌悬液,于30 ℃、150 r/min振荡培养24 h。第二阶段发酵(24～48 h):在发酵24 h后,向同一体系中接种2%(体积分数)的乳杆菌菌悬液,转为37 ℃、150 r/min振荡培养24 h。在发酵过程间隔12 h取样,进行后续指标测定。
1.3.3 发酵液基本理化指标检测
酵母菌活菌数的测定参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》。植物乳植杆菌活菌数的测定参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》。发酵液pH值的测定参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。
采用硫酸苯酚法测定螺旋藻发酵液中的总糖含量,参考HAN等[7]使用高效液相色谱测定可溶性糖含量,结果以mg/mL表示。
参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定(含第1号修改单)》,结果以mg/mL表示。
1.3.4 发酵液感官评价
定量描述性分析用于评估发酵螺旋藻发酵液样品的感官特征,参考PAN等[8]报道的方法并符合《赫尔辛基宣言》的原则评估发酵螺旋藻的感官质量。感官小组由20名从事于食品行业训练有素的评估员组成,包括10名男性和10名女性,年龄在20～40岁。以发酵螺旋藻液的外观(20%)、气味(30%)、口感(25%)和滋味(25%)为指标,感官评分为去掉最高分和最低分后的平均分。
1.3.5 发酵液色度的测定
根据LUO等[9]的方法,通过色度计直接检测发酵液颜色的变化。测量前,分别使用黑板和白板对色度计进行校准。每个样品平行测试3次,重复3次。测量发酵液的L*、a*和b*的平均值,分别表示亮度、红绿和黄蓝颜色。色差ΔE的计算如公式(1)所示:
(1)
1.3.6 发酵液抗氧化活性的测定
参考段文慧[10]的实验方法,使用517 nm波长吸光度测定DPPH自由基清除活性、使用734 nm波长吸光度测定ABTS阳离子自由基清除活性和采用水杨酸法使用510 nm波长吸光度测定羟自由基清除能力。
1.3.7 发酵液总酚和总黄酮含量的测定
采用福林酚法测定总酚含量。以没食子酸标准溶液制备校准曲线,其中横坐标为没食子酸质量浓度(mg/L),纵坐标为760 nm处的吸光度,标准曲线为:y=0.011 6x+0.078 9,R2=0.999 2。采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。以芦丁含量(mg/L)作为横坐标,510 nm处的吸光度作为纵坐标,标准曲线为:y=0.944 2x+0.063 6,R2=0.999 7。
1.3.8 发酵液挥发性风味物质的测定
采用气相色谱-顶空固相微萃取质谱联用技术分析发酵液的挥发性成分,具体依据SONG等[11]的方法。使用极性DB-WAX色谱柱(规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm)检测,起始温度为40 ℃,以10 ℃/min的速率逐渐升温至250 ℃,初始保留时间为3 min,最终保留时间为15 min。载气纯度为99.99%的氦气,流速设定为1.5 mL/min,分流比为10∶1,进样口温度为250 ℃。采用电子轰击离子源;电子能量为70 eV;传输线温度设定为230 ℃;离子源温度为230 ℃;质量扫描范围为35～350 amu;扫描模式为m/z 35～650。挥发性有机化合物的定量分析是基于美国国家标准与技术研究院(NIST 20.)质谱数据库进行匹配。通过面积归一化法计算各化合物的含量,以μg/kg为单位表示。
1.4 数据处理
所有实验均独立重复3次,结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS软件进行单因素方差分析,并利用Duncan多重比较检验进行显著性分析(P<0.05表示差异显著)。采用Origin 2021和Simca 14.1等分析软件进行聚类分析和关键挥发性物质数据分析。
2 结果与分析
2.1 顺序发酵过程中酵母与乳杆菌的生长动力学
不同复配菌株在螺旋藻基质中的生长动态如图1所示,各处理组间活菌数存在显著差异(P<0.05)。在0～24 h的酵母发酵阶段,所有酵母组均快速生长,于24 h达到峰值(图1-A),其中KCL6组生物量最高(8.82 lg CFU/mL),KDL12组较低(8.63 lg CFU/mL),表明菌株的遗传特性直接影响其在发酵基质的生长效率。24 h接入植物乳植杆菌后,所有组合均进入快速生长期,并在48 h达到稳定期(图1-B)。KCL6和KAL1组的乳杆菌生物量最高(分别为8.75和8.62 lg CFU/mL),显著高于KDL12组(8.40 lg CFU/mL),说明KCL6与KAL1组合预发酵后的螺旋藻基质更利于乳杆菌生长。推测原因在于KA和KC酵母前期代谢分解螺旋藻细胞壁更彻底,为乳杆菌创造了预酸化的发酵微环境,为其提供了优越的生长条件[12]。且乳杆菌处于酵母耐受范围内,抑制了杂菌的生长[10],两者形成稳定、非激烈竞争的微生态系统,有利于发酵可控性与风味协调。
A-马克思克鲁维酵母生长曲线;B-植物乳植杆菌生长曲线
图1 螺旋藻发酵液中酵母与乳杆菌的生长曲线
Fig.1 The growth curves of yeast and Lactiplantibacillus in Spirulina fermentation liquid
2.2 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻过程中pH、糖消耗和总酸含量的动态变化
发酵体系的pH值变化是微生物代谢活动的直接反映。在整个发酵过程中,发酵液pH呈现规律性下降趋势(图2)。以KCL6组为例,在0～24 h的酵母单独发酵阶段,pH值从7.08降至4.05,主要因酵母通过糖酵解产生有机酸及呼吸释放CO2所致,为后续乳杆菌的生长创造弱酸环境[13]。24 h接入植物乳植杆菌后,所有组pH急剧下降,如KBL16组在24～36 h由4.23降至3.70,最终稳定在3.45,该下降趋势与乳杆菌指数生长期(图1-B)相符,表明乳杆菌的大量产酸是体系酸化的主因。不同组合间最终pH差异可能与酵母阶段胞外酶分泌及乳杆菌发酵产酸能力有关,KBL16与KCL6组最终pH值较低(分别为3.45、3.47),表明L6和L16乳杆菌的产酸能力较强,与其具有较高的活菌量(图1-B)相印证。此外,发酵液的酸化环境能有效抑制杂菌,并为改善螺旋藻腥味、促进酯类风味物质的形成提供了先决条件[14]。
图2 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的动态pH变化
Fig.2 The changes in dynamic pH of Spirulina during sequential fermentation by yeast and Lactiplantibacillus
注:同一列中不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
可溶性糖与总糖含量的分析共同揭示了顺序发酵过程中糖类的利用规律及菌株协同效率的差异。由表1与图3可知,发酵结束后螺旋藻发酵液中糖类仍有大量残留。在0～24 h酵母单独发酵阶段,总糖快速线性下降,消耗速率约0.4～0.6 mg/(mL·h),其中KCL6组耗糖最多(15.60 mg/mL),KBL16组最少(13.68 mg/mL),表明酵母作为初级碳流消耗者高效利用了基质中的糖类以满足其自身生长[15],这也与KCL6组较高的酵母活菌数(图1-A)相对应。在发酵Ⅱ阶段中,乳杆菌作为次级碳流消耗者继续利用剩余糖分,但不同菌株组合的代谢效率存在明显差异。发酵结束时,KCL6组残糖量最低(可溶性葡萄糖残留9.11 mg/mL,总糖残留14.40 mg/mL,消耗率68.04%),而KBL16组残糖最高(可溶性葡萄糖13.51 mg/mL),表明KCL6组整体表现更优,具有更高的协同代谢效率[16]。而KBL16组则反映其糖类降解能力较弱,乳杆菌生长相对迟缓,导致糖利用不充分,藻菌协同效率较低。
表1 螺旋藻发酵液中可溶性糖含量变化 单位:mg/mL
Table 1 The variation of soluble sugar content in Spirulina fermentation liquid
组别葡萄糖木糖果糖蔗糖对照组0.09±0.09d0.01±0.05dNDNDKAL110.26±1.41c0.25±0.08bcNDNDKBL1613.51±0.35a0.20±0.09cNDNDKCL69.11±0.03c0.33±0.11aNDNDKDL1210.69±1.25ab0.27±0.03bNDND
注:ND表示在当前的检测方法下,目标物质或成分的浓度低于HPLC的检测限,无法被检测到。同一列中不同小写字母表示存在显著性差异(P<0.05)(下同)。
图3 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的总糖含量变化
Fig.3 The changes in total sugar content of Spirulina during sequential fermentation by yeast and Lactiplantibacillus
此外,木糖作为结构多糖的特征性组分,在发酵后含量显著上升(0.21～0.33 mg/mL),明显高于对照组(0.01 mg/mL),证实在顺序发酵过程微生物有效破坏了螺旋藻的细胞壁释放出结构性糖类[10]。果糖与蔗糖在所有样本中均未检出,说明其并非螺旋藻基质中的主要糖类或代谢产物。
总酸积累是发酵食品感官品质的关键指标[12]。发酵组的总酸含量呈时间依赖性显著上升(图4),与pH变化相一致(图2)。发酵初期总酸含量较低,0～24 h酵母阶段酸含量积累缓慢,24 h时KCL6组最高为2.32 mg/mL,说明该阶段酵母主要分解大分子并提供预酸化发酵基质环境[15]。24 h接种乳杆菌后,总酸含量急剧上升,该变化与乳杆菌生长期(图1-B)、pH骤降(图2)及糖快速消耗期(图3)高度耦合,表明在发酵Ⅱ阶段碳源迅速转化为酸性代谢产物,重塑发酵环境[17]。KCL6与KBL16组总酸含量累积幅度最高,反映菌株组合及乳杆菌的产酸能力对总酸含量结果影响显著。
图4 螺旋藻发酵液中总酸含量变化
Fig.4 The changes in total acid content in Spirulina fermentation liquid
2.3 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的感官评价分析
对发酵后螺旋藻浆液的感官评价结果如图5所示。未发酵对照组整体可接受度极低(17.12分),主要因其强烈的藻腥味和苦涩味[2]。相比之下,所有顺序发酵组的整体可接受度均显著提升(P<0.05),其中KCL6组得分最高(83.78分),较对照组提升389.36%,KBL16和KAL1组也表现优异(分别为79.70和77.90分),证明该发酵工艺有效改善了螺旋藻的适口性,提升螺旋藻基食品的整体可接受度[16]。在口感方面,发酵组得分均超过18.0分,远高于对照组(8.80分)。乳杆菌产生的有机酸带来清爽酸味,中和了螺旋藻原有的苦涩味。且酵母与乳杆菌共同代谢生成的风味物质形成了更加协调的味觉体验,覆盖了其原有的不良风味[17]。同时,在气味方面,发酵组得分也显著提高,KCL6组达26.44分,说明酵母-乳杆菌顺序发酵工艺有效削弱了藻腥味。不同菌株组合的感官差异与其发酵过程中的代谢效率一致,进一步证实微生物代谢与产品感官品质间的直接关联。
图5 螺旋藻发酵液中感官评分
Fig.5 The changes in sensory scores in Spirulina fermentation liquid
2.4 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的色度值变化
发酵液色泽是影响消费者购买意愿的主要因素。如表2所示,与未发酵对照组相比,所有顺序发酵处理组的螺旋藻色泽均发生显著变化(P<0.05)。发酵后L*值由25.41下降至13.66～15.55,表明样品亮度显著降低,颜色变深、变暗。a*值进一步降低(-6.69～-7.23),说明发酵液的绿色程度加深。b*值由38.48大幅下降至12.10～12.83,黄色色调明显减弱。所有发酵组的ΔE值均在27.78～28.78,远超过人眼可识别的阈值(ΔE>5),这证明发酵处理在视觉上造成了显著性的颜色改变[16]。这种颜色的转变一方面可能与叶绿素的充分释放及其在酸性环境下的稳定性变化有关[18]。另一方面,酵母和乳杆菌的代谢也可能降解了部分类胡萝卜素(如β-胡萝卜素),从而导致黄色成分减少[19]。
表2 螺旋藻发酵液的色度值变化
Table 2 The colorimetric value variation of Spirulina fermentation liquid
样本L∗值a∗值b∗值ΔE值对照组25.41±0.17a-3.13±0.13a38.48±0.47aNDKAL113.66±0.37c-7.22±0.12b12.16±0.30b28.78±0.41aKBL1613.72±0.31c-6.97±0.52b12.10±0.65b28.78±0.64aKCL615.55±0.62b-7.23±0.19b12.48±0.33b27.78±0.50cKDL1214.14±0.26c-6.69±0.12b12.83±0.06b27.91±0.18b
注:以对照组的颜色作为色差判定标准,ND表示无色差。
2.5 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的体外自由基清除率和生物活性含量变化
发酵后螺旋藻的体外抗氧化能力及其生物活性的变化如图6所示。与对照组相比,所有发酵组的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基及羟自由基的清除能力均显著增强(P<0.05)。对照组的DPPH自由基清除率仅为43.11%,表明未处理的螺旋藻具有一定的本底抗氧化能力,但相对有限[20]。而发酵处理后,清除率大幅提升至71.14%～86.33%。其中,KCL6组的表现最为优异,较对照组提升了1.01倍(86.33%)。推测这可能与发酵中产生或释放大量的可提供氢原子的抗氧化成分有关[21]。ABTS阳离子自由基清除率呈现出与DPPH自由基相似趋势,ABTS阳离子自由基清除率由49.07%升至72.11%～80.78%,反映发酵产生的抗氧化物质具有更广溶解性与作用范围[22]。羟自由基清除率由36.89%提升至63.84%,KAL1、KBL16与KCL6组均超60%。总酚与总黄酮含量的显著上升(图6-B)进一步验证了上述结论。总酚含量由对照组的17.23 mg/L增至31.94 mg/L(KCL6组)与27.81 mg/L(KDL12组),增幅分别达85.37%与61.40%。对应的总黄酮含量也分别提升了2.07倍与1.87倍。总酚、总黄酮含量与3种自由基清除率均呈强正相关(总黄酮与羟自由基清除率R2>0.95),说明发酵液中的酚类物质和黄酮类物质是导致其抗氧化能力上升的主要来源。其原因在于天然螺旋藻细胞中,有大量的酚类和黄酮类物质以结合态形式存在于细胞器内部。顺序发酵过程中酵母与乳杆菌分泌的酶系降解螺旋藻细胞壁及内部基质,使结合态酚类与黄酮类物质转化为游离态,并在酸性条件下保持其稳定性与活性[23]。此外,微生物的生物转化作用同样关键,如乳酸菌与酵母拥有的特定酶系β-葡萄糖苷酶,在转化过程中β-葡萄糖苷酶专一性地水解结合态酚类物质上的糖苷键,将无生物活性的糖苷形式水解为分子质量更小、活性更高的苷元形式。这种去糖基化作用增加了酚类物质的分子可及性以及氢原子的还原能力,从而显著提升了发酵液的抗氧化活性[16]。
A-发酵液体外DPPH自由基、ABTS阳离子自由基和羟自由基清除率;B-发酵液总酚和总黄酮含量
图6 螺旋藻发酵液中体外自由基清除率和生物活性含量变化
Fig.6 The Changes in in vitro free radical clearance rate and bioactive content in Spirulina fermentation liquid
A-挥发性化合物总含量;B-挥发性化合物相对物质含量
图7 螺旋藻发酵液的挥发性化合物含量变化
Fig.7 The changes in the volatile compound content of Spirulina fermentation liquid
2.6 酵母-乳杆菌顺序发酵螺旋藻的挥发性风味特性变化
为阐明酵母-乳杆菌顺序发酵对螺旋藻风味的影响,本研究采用顶空-固相微萃取结合气相色谱-质谱技术,结合化学计量学方法进行全面分析。发酵显著提高了挥发性物质总量(图7-A),相较于对照组(总量为1 483.17 μg/L),KCL6组具有最高的总量(达3 183.92 μg/L)提升114.67%,KDL12与KBL16组分别提高37.46%和11.04%,这表明酵母-乳杆菌发酵代谢产物极大丰富了螺旋藻发酵液中的风味物质。同时,发酵前后发酵液的组分结构发生了质的转变(图7-B)。对照组以酚类(34%)、烷烃类(24%)和酮类(13%)是主要成分,这些物质通常与藻类的腥味、土味和草药味相关[2]。发酵48 h后,风味谱转为以酸类、醇类与酮类为主导。KCL6组中酸类相对含量达46.3%,提高13.31倍。酯类相对含量为7.5%,提高6.4倍。醇类与酮类亦显著增加,共同构建出发酵风味的协调体系。同时,多类潜在异味物质含量急剧下降,KBL16组酚类降至4.0%,较对照组降低30.0%;烯烃类从4.0%降至0.3%,降幅92.5%;KDL12组中炔烃类降至0.5%。这些变化共同推动螺旋藻发酵液风味由藻腥味向果香与酸甜味转化。
主成分分析(principal components analysis,PCA)与正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)揭示了发酵风味的整体差异,如图8所示。PCA结果显示PC1与PC2累计贡献率达90.2%,充分反映样本差异(R2X=0.981,R2Y=0.958)。发酵组与对照组沿PC1轴明显分离(贡献率77.3%),表明发酵是主导风味差异的关键因素。KBL16与KAL1风味特征相似,而KCL6与KDL12各具特异性。OPLS-DA模型参数优异(R2X=0.987,R2Y=0.965,Q2=0.936),置换检验证实模型稳健无过拟合[24]。通过VIP分析筛选出14种关键差异标志物[变量重要性投影(variable importance in projection,VIP)>1.0],包括乙酸苯乙酯、苯乙醇等微生物代谢产物,构成了区分发酵样本的化学基础。
A-PCA得分图;B-OPLS-DA得分图;C-OPLS-DA的200次检验模型验证;D-基于VIP>1筛选关键挥发性化合物得分
图8 螺旋藻发酵液的挥发性化合物统计学分析
Fig.8 Statistical analysis of volatile compounds in Spirulina fermentation liquid
进一步对14种关键挥发性物质进行热图聚类分析(图9),结果显示样本明显分为两大簇,与PCA结果一致,再次验证酵母-乳杆菌发酵处理是导致发酵液风味差异的主因[2]。对照组中2,4-二叔丁基苯酚(337.64 μg/L,酚臭、刺激性)、4-(1,1-二甲基丙基)苯酚(165.10 μg/L,酚臭、药味)、十六烷(116.14 μg/L,蜡质、燃料味)及十七烷(103.27 μg/L,蜡质、燃料味)含量较高,导致发酵液强烈的鱼腥与泥土气味,与感官评价中较差风味表现一致。对照组螺旋藻中的异味物质的来源可以是因为微藻培养过程中的微生物代谢所导致的[25],其转化途径可能包括2方面:a)具有酚臭的烷基酚类经脱烷基与羟基化反应,生成低毒、弱气味的水溶性产物;b)产生蜡质味的直链烷烃通过β-氧化被降解为短链脂肪酸,进而进入中心代谢[24]。与此同时,发酵组中多种愉悦风味化合物显著积累,包括乙酸苯乙酯(玫瑰、蜂蜜香)、苯乙醇(玫瑰、花香)、2-甲基丙酸苯乙酯(果香、蜂蜜香)、二氢猕猴桃内酯(椰子、甜香)、反式-β-紫罗兰酮(紫罗兰、木香)及2,2,5-三甲基-3,4-己二酮(甜香、果香)等[17]。在顺序发酵过程中,酯类物质的爆发式积累是其显著特征,该过程得益于酵母与乳杆菌的协同作用。Ⅰ阶段中马克思克鲁维酵母通过艾氏途径合成高级醇(如苯乙醇),继而Ⅱ阶段乳杆菌代谢产生有机酸(如乙酸、2-甲基丁酸)。最终,这些前体物质在酸性环境下经微生物酯酶催化,发生酯化反应生成相应的酯类化合物[16]。有趣的是,KCL6组表现出强烈代谢特异性,在乙酸苯乙酯(1 125.17 μg/L)、苯乙醇(522.73 μg/L)、2-甲基丙酸苯乙酯(227.90 μg/L)与二氢猕猴桃内酯(233.92 μg/L)等关键香气成分中积累量最高。不同菌株组合在代谢特征上的明显差异,反映了其代谢网络的特异性,为优良发酵菌株选育与风味精准调控提供了重要理论依据。
图9 基于VIP>1筛选螺旋藻发酵液关键挥发性化合物聚类热图
Fig.9 Cluster heatmap of key volatile compounds in Spirulina fermentation broth based on VIP>1 screening
3 结论
本研究系统评价了4种不同马克思克鲁维酵母与植物乳植杆菌组合(KAL1、KBL16、KCL6、KDL12)对新鲜螺旋藻顺序发酵的效果。结果表明,该策略成功构建了高效的藻菌共生体系,Ⅰ阶段酵母有效分解藻细胞壁释放营养物质并预酸化体系,Ⅱ阶段乳杆菌阶段快速定殖产酸形成稳定的发酵微环境。不同菌株组合代谢效率差异显著,其中KCL6在生物量积累、糖利用和产酸方面表现最优。发酵显著改善了螺旋藻的食用品质,感官评价显示发酵组有效消除了藻腥味和苦涩味,KCL6组整体可接受度较对照组提升389.36%。发酵液中生物活性得到显著提升,DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除率分别提升至86.33%和80.78%,总酚和总黄酮含量最大增幅分别达85.37%和206.75%。风味分析显示,发酵实现了风味谱的根本性重塑,酸类、酯类、醇类等宜人风味物质显著增加,酚类、烷烃类等异味物质大幅减少,形成了丰富的花果香风味。本研究证实酵母-乳杆菌顺序发酵是提升螺旋藻适口性、抗氧化活性及风味品质的有效策略。菌株组合的优异性能为开发高品质螺旋藻食品提供了菌种资源与理论依据,后续将深入解析菌株互作机制和优化工艺参数,并开展体内功能评价进一步挖掘其健康潜力。
[1] SHAH M A R,ZHU F F,CUI Y,et al.Mechanistic insights into the nutritional and therapeutic potential of Spirulina(Arthrospira)spp.:Challenges and opportunities[J].Trends in Food Science &Technology,2024,151:104648.
[2] SHAHID A,FAN Z H,SU K R,et al.Sensory chemistry of Spirulina:Unveiling trends and innovations in aromatic volatile organic compound biosynthesis in off-flavors and odor mitigation strategies[J].Trends in Food Science &Technology,2025,156:104886.
[3] ARYA P,VAIDYA D,DEVI S,et al.Fermentation-driven bioactive enhancement in cereal grains:Mechanisms,nutritional improvements,and functional food applications[J].Trends in Food Science &Technology,2025,166:105403.
[4] FENG Y T,ZHOU Y R,LI C C,et al.Sequential fermentation with Kluyveromyces marxianus and yogurt starter cultures produces stirred fermented milk with reduced lactose and enhanced natural flavor[J].Innovative Food Science &Emerging Technologies,2025,105:104169.
[5] BAPTISTA M,DOMINGUES L.Kluyveromyces marxianus as a microbial cell factory for lignocellulosic biomass valorisation[J].Biotechnology Advances,2022,60:108027.
[6] NAWAZ M,RIZWAN H M,MOMAND Z U D,et al.Apple peel fermentation by Lactobacillus plantarum:Phytochemical transformations and enhanced abilities against inhibition of advanced glycation end products[J].Food Chemistry,2025,495:146567.
[7] HAN M Z,WANG X W,ZHANG M N,et al.Effect of mixed Lactobacillus on the physicochemical properties of cloudy apple juice with the addition of polyphenols-concentrated solution[J].Food Bioscience,2021,41:101049.
[8] PAN X,ZHANG S,XU X X,et al.Volatile and non-volatile profiles in jujube pulp co-fermented with lactic acid bacteria[J].LWT,2022,154:112772.
[9] LUO Y,ZENG X B,HU Y Y,et al.Differences and mechanisms of color deterioration in three types of ready-to-eat shellfishes during storage[J].Food Chemistry,2025,469:142459.[10] 段文慧.乳杆菌发酵枸杞及其预防急性酒精性肝损伤的机制[D].无锡:江南大学,2024.DUAN W H.Lactic acid bacteria-fermented goji and protective mechanism against acute alcohol liver injury[D].Wuxi:Jiangnan University,2024.
[11] SONG L Y,MA F W,CHEN H J,et al.Dynamic changes in flavor characteristics of black tea during solid-state fermentation with Eurotium cristatum[J].Food Chemistry,2025,465:142028.
[12] YAY C,CINAR Z O,DONMEZ S,et al.Optimizing bioreactor conditions for Spirulina fermentation by Lactobacillus helveticus and Kluyveromyces marxianus:Impact on chemical &bioactive properties[J].Bioresource Technology,2024,403:130832.
[13] CORIA-HINOJOSA L M,VEL
SQUEZ-REYES D,ALCZAR-VALLE M,et al.Exploring volatile compounds and microbial dynamics:Kluyveromyces marxianus and Hanseniaspora opuntiae reduce Forastero cocoa fermentation time[J].Food Research International,2024,193:114821.
[14] LIAO C S,TANG X L,LI M Y,et al.Effect of lactic acid bacteria,yeast,and their mixture on the chemical composition,fermentation quality,and bacterial community of cellulase-treated Pennisetum sinese silage[J].Frontiers in Microbiology,2022,13:1047072.
[15] OZTURK N,YAY C,CINAR Z Ö,et al.Optimizations related to the use of Lactobacillus helveticus,Kluyveromyces marxianus in monoculture,and co-culture for production of Spirulina-based fermented products[J].Algal Research,2025,86:103948.
[16] 刘光鹏.混合菌协同发酵枣浆的品质形成及其机制解析[D].杨凌:西北农林科技大学,2024.LIU G P.Quality formation and mechanism analysis of jujube pulp by complex strains cooperative fermentation[D].Yangling:Northwest A&F University,2024.
[17] BAO J,ZHANG X,ZHENG J H,et al.Mixed fermentation of Spirulina platensis with Lactobacillus plantarum and Bacillus subtilis by random-centroid optimization[J].Food Chemistry,2018,264:64-72.
[18] LUO X Y,LIU W L,HUANG W,et al.Co-culturing of Saccharomycopsis fibuligera and Lacticaseibacillus paracasei to improve the bioactive components and flavor characteristics of Dendrobium officinale[J].Food Bioscience,2024,59:103736.
[19] 侯雨辰,乌日娜,曹恺欣,等.马克斯克鲁维酵母菌调控酒精饮料风味物质代谢机制的研究进展[J].中国酿造,2024,43(1):7-13.HOU Y C,WU R N,CAO K X,et al.Research progress on metabolic mechanism of flavor substances in alcoholic beverages regulated by Kluyveromyces marxianus[J].China Brewing,2024,43(1):7-13.
[20] 葛保胜,秦松.微藻精准营养与功能及潜在应用研讨会概述[J].生物学杂志,2021,38(2):1-2.GE B S,QIN S.Summary of the symposium on precise nutrition function and potential application of microalgae[J].Journal of Biology,2021,38(2):1-2.
[21] YANG J,ZHAO P P,WANG Q Q,et al.Peptidomics-inspired discovery and activity evaluation of antioxidant peptides in multiple strains mixed fermentation of Porphyra yezoensis[J].Food Chemistry,2024,455:139779.
[22] ZHU Y Y,LYU J M,GU Y,et al.Mixed fermentation of Chinese bayberry pomace using yeast,lactic acid bacteria and acetic acid bacteria:Effects on color,phenolics and antioxidant ingredients[J].LWT,2022,163:113503.
[23] 
B,
M,PEZO L,et al.Development of Spirulina-enriched fruit and vegetable juices:Nutritional enhancement,antioxidant potential,and sensory challenges[J].Foods,2025,14(20):3539.
[24] KURT H,ISLETEN HOSOGLU M,GUNESER O,et al.Influence of different bacteria species in chemical composition and sensory properties of fermented Spirulina[J].Food Chemistry,2023,400:133994.
[25] CHEN C,XIONG Y,XIE Y H,et al.Metabolic characteristics of lactic acid bacteria and interaction with yeast isolated from light-flavor Baijiu fermentation[J].Food Bioscience,2022,50:102102.